Name: 压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 了解使用压力控制通气在小鼠体内诱导急性肺损伤的实验方法。该技术通过气管切开术和高压力机械通气模拟人类急性呼吸窘迫综合征，为研究急性肺损伤机制提供可靠的动物模型。

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本研究由美国国家心肺血液研究所资助，资助编号为R01-HL0921、R01-DK083385和R01HL098294（授予H. K. Eltzschig），1K08HL102267-01（授予T. Eckle），麻醉教育与研究基金会资助（授予T. Eckle和H. K. Eltzschig），美国心脏协会资助（授予T. Eckle和H. K. Eltzschig），以及德国研究基金会（DFG）研究奖学金（授予M. Koeppen）。

一般注意事项：
所有操作均应在直立式解剖显微镜（Olympus，SZX10 配备 Z 轴手轮立柱和 STU2 支架臂）下进行，并使用外科凝固器（11）。实验组在年龄和体重方面应尽可能匹配，以确保结果的可比性。在整个过程中，温度、血压、麻醉和液体输注应保持稳定。

1. 麻醉与气管准备
<ol>
	<li>使用至少10周大、体重为22–25 g的C57BL/6小鼠。腹腔注射戊巴比妥钠（6）诱导麻醉，剂量为70 mg/kg体重。以约10 mg/kg/h的速率维持麻醉。需谨慎避免过量，因为这可能显著降低血压。即使在数小时后追加戊巴比妥钠，也可能导致血浆浓度严重升高。</li>
	<li>麻醉诱导后，将小鼠仰卧位固定，用胶带和缝线将四肢固定在手术台上，缝线系于踝部。同样通过牙齿将头部固定。充分的固定对于成功插管和精确控制手术过程至关重要。术前在小鼠体表涂抹矿物油，以降低小鼠毛发过敏的风险。为维持体温稳定，使用市售食品保鲜膜覆盖小鼠。</li>
	<li>将小鼠置于温度可控的加热台上（RT，Effenberg，Munich，德国），并连接直肠温度探头至热反馈控制器，以维持体温在37°C。</li>
	<li>手术暴露气管。分离气管两侧及背侧的结缔组织，并在气管下方分别置入两根10 cm长的3.0号丝线缝合线（Harvard apparatus，USA）。两根缝线应相距约1 cm。</li>
	<li>使用McPherson-Vannas剪刀（8 cm，直刃；World Precision Instruments，USA）在喉部下方3–4 mm处的两个环状软骨之间小心切开气管。操作时应避免出血，因为出血可能干扰后续观察指标。</li>
	<li>使用钝头聚乙烯导管（Insyte 22g，Beckton Dickinson，USA）进行气管插管。将聚乙烯导管尖端以85度角插入气管，随后倾斜导管使其与气管腔走行一致。缓慢将导管进一步推进气管，直至导管尖端完全进入胸廓入口。利用置于气管背侧的两根丝线缝合线将导管固定在此位置（见步骤1.4）。</li>
</ol>

2. 呼吸机相关性肺损伤技术
<ol>
	<li>将导管连接至呼吸机。为诱导肺损伤，我们采用压力控制通气技术，使用 Siemens（DRE Veterinary，美国）生产的 Servo 900 C 呼吸机。动物通气参数设置为：吸气峰压 45 mbar，呼吸频率 80 次/分钟，呼气末正压 0–3 mbar，吸入氧浓度 FiO2 = 1.0。吸气与呼气时间比应为 1:1。尽管 Servo 900 C 是为人设计的呼吸机，但在压力控制通气模式下，其用于小鼠通气效果极佳。</li>
	<li>使用心电图仪（例如 Hewlett Packard，Böblingen，德国）监测心率。确保心率不低于 400 次/分钟。当开始机械通气时，应观察到心电轴右偏，这是胸腔内压升高导致肺动脉压力升高的表现。若小鼠出现心动过缓，应检查体温及麻醉剂量/浓度。使用赛拉嗪/氯胺酮麻醉可导致心率降至 250 次/分钟，因此不推荐使用。</li>
	<li>实施适当的液体替代治疗。应在通气前通过动脉或静脉导管以 0.1 ml/小时的速度输注生理盐水，以确保足够的静脉充盈。由于通气压力较高，静脉回心血量会受到抑制，可能导致平均动脉压显著下降。此外，术前可经腹腔给予 500 μl 生理盐水作为冲击剂量。</li>
	<li>在颈动脉内放置导管以持续记录血压（27）。在开始分离动脉前，先将动物肢体固定于身体。通过钝性分离气管旁肌肉暴露颈动脉。进一步暴露过程中应仔细避免组织损伤（特别是迷走神经）。使用两根缝线和一个小夹钳（37）将导管插入血管，以便暴露更长的动脉节段。在颈动脉远端末端结扎一根缝线。将缝线末端固定在较大夹钳上以施加张力，或用胶带将缝线固定于操作台。在动脉周围再放置一根缝线，并向远端充分游离动脉。在此处放置一个小夹钳。使用显微剪刀在动脉上剪出一个微小的斜行切口。用精细镊子（Dumont，WPI）夹住切口，用手或镊子将合适尺寸的导管插入血管。用第二根缝线打结固定导管与动脉。松开夹钳，继续推进导管。通过多个结扎线和胶带固定导管。作为替代方案，可在实验结束时放置颈动脉导管，用于采集动脉血样进行血气分析。</li>
</ol>

3. 组织样本的回收
机械通气3小时后，采集样本以评估肺损伤程度。我们建议采集支气管肺泡灌洗液（BAL）、动脉血和肺组织。
<ol>
	<li>实验结束时获取支气管肺泡灌洗液（BAL）。加深麻醉后，用1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗气管插管。液体应在气管/肺内保留三秒钟，然后通过连接的注射器回收。将回收的BAL液迅速在液氮中速冻，并在-80°C下保存以备进一步分析。请注意，回收的液体体积可能显著少于1 ml。</li>
	<li>实验结束时进行血气分析。为此，应在胸骨下方做一切口。用镊子夹住胸骨，并沿肋骨延伸切口。接着在边缘处切开膈肌，并将其从肋骨上切除。此时可清晰观察到胸腔下口。用镊子抬起胸骨，并在左右两侧做尽可能靠外的长切口以打开胸腔，使整个前胸壁向上翻起。此操作应在实验动物仍接受机械通气时进行。使用27½G针头穿刺左心室，并使用i-STAT系统（Abbott，USA）进行动脉血气分析。如果需要进行动脉血气分析，则不应获取BAL液，因为这将对结果造成显著干扰。</li>
	<li>作为上述方法的替代方案，可通过颈动脉导管采集动脉血样。但此操作应在获取BAL液之前完成。</li>
	<li>通过上提心脏并切断气管的方式整块切除肺组织。准备一块组织以吸收血液，确保手术视野清晰。将心脏向腹部方向牵拉，并沿脊柱小心剪开，以游离所有胸腔器官。切断主动脉，取出胸腔器官并置于洁净的手术台上。</li>
	<li>从组织样本上去除心脏和主要血管。确保肺组织上无残留的胸腺组织。用剪刀将左右肺分离，分别放入独立的管中并迅速冷冻。在-80°C下保存以备进一步分析。</li>
</ol>
4. 肺损伤的评估
我们建议使用以下结果参数来评估肺损伤程度：采用白蛋白ELISA（Bethyl Laboratories, USA）和髓过氧化物酶（MPO）ELISA（Hycult Biotechnology, USA）检测支气管肺泡灌洗液（BAL）中屏障功能障碍的程度以及炎性细胞的数量。同时对肺组织进行MPO ELISA检测。若需测定湿重/干重比，则不采集BAL液，且不冲洗肺循环（见3.3）。切除肺组织后，测量其湿重；随后将肺组织冷冻干燥48小时，再次称量干重。湿重/干重比以每毫克干组织所含水的毫克数（mg水/mg干组织）表示（5）。
<img src="/files/ftp_upload/2525/2525fig1.jpg" alt="机械通气不同时间后支气管肺泡灌洗液蛋白含量变化的柱状图，显示显著差异。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 支气管肺泡灌洗液（BAL）中蛋白含量对呼吸机诱导肺损伤（VILI）的反应。 小鼠以戊巴比妥麻醉后进行机械通气，采用压力控制通气模式（吸气压 45 mbar，呼气末正压 3 mbar，吸入氧浓度 100%）。在通气 0、1、2 和 3 小时后收集支气管肺泡灌洗液，并使用二辛可宁酸法（BCA 法）测定蛋白含量。图中显示的蛋白含量变化以通气 0 小时为基准进行归一化处理（n=4 每组，* 表示与对照组相比 p &lt; 0.05，均值 ± 标准误 SEM）

<ol><li>Eckle, T., Faigle, M., Grenz, A., Laucher, S., Thompson, L. F., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A2B+adenosine+receptor+dampens+hypoxia-induced+vascular+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A2B adenosine receptor dampens hypoxia-induced vascular leak.</a> Blood. 111, 2024-2035 (2008).</li>
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<li>Morote-Garcia, J. C., Rosenberger, P., Nivillac, N. M., Coe, I. R., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-dependent+repression+of+equilibrative+nucleoside+transporter+2+attenuates+mucosal+inflammation+during+intestinal+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-dependent repression of equilibrative nucleoside transporter 2 attenuates mucosal inflammation during intestinal hypoxia.</a> Gastroenterology. 136, 607-618 (2009).</li>
<li>Reutershan, J., Vollmer, I., Stark, S., Wagner, R., Ngamsri, K. C., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+and+inflammation%3A+CD39+and+CD73+are+critical+mediators+in+LPS-induced+PMN+trafficking+into+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Adenosine and inflammation: CD39 and CD73 are critical mediators in LPS-induced PMN trafficking into the lungs.</a> FASEB J. 23, 473-482 (2009).</li>
<li>Schingnitz, U., Hartmann, K., Macmanus, C. F., Eckle, T., Zug, S., Colgan, S. P., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+the+A2B+adenosine+receptor+dampens+endotoxin-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signaling through the A2B adenosine receptor dampens endotoxin-induced acute lung injury.</a> J Immunol. 184, 5271-5279 (2010).</li>
<li>Thompson, L. F., Eltzschig, H. K., Ibla, J. C., Van De Wiele, C. J., Resta, R., Morote-Garcia, J. C., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+for+ecto-5%27-nucleotidase+%28CD73%29+in+vascular+leakage+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Crucial role for ecto-5'-nucleotidase (CD73) in vascular leakage during hypoxia.</a> J. Exp. Med. 200, 1395-1405 (2004).</li>
<li>Aherne, C. M., Kewley, E. M., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resurgence+of+A2B+adenosine+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The resurgence of A2B adenosine receptor signaling.</a> Biochim Biophys Acta. , (2010).</li>
<li>Eckle, T., Koeppen, M., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extracellular+adenosine+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Role of extracellular adenosine in acute lung injury.</a> Physiology (Bethesda). 24, 298-306 (2009).</li>
<li>Koeppen, M., Feil, R., Siegl, D., Feil, S., Hofmann, F., Pohl, U., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+protein+kinase+mediates+NO-+but+not+acetylcholine-induced+dilations+in+resistance+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent protein kinase mediates NO- but not acetylcholine-induced dilations in resistance vessels in vivo.</a> Hypertension. 44, 952-955 (2004).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了一种在小鼠中建立呼吸机诱导肺损伤的技术。该模型通过高压通气可产生高度可重复的肺损伤。考虑在小鼠中研究急性肺损伤的研究人员可受益于该模型。

<table><tbody><tr><td>戊巴比妥钠（Fatal Plus）</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td>V.P.L. 9372</td><td>生理盐水中浓度为 4mg/mL</td></tr><tr><td>Insyte 22 G</td><td>BD Biosciences</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>缝合线，4.0 号丝线</td><td>Harvard Apparatus</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>缝合线，8.0 号 Prolene</td><td>Ethicon Inc.</td><td>M8739</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>Siemens 900&amp;#x00B0;C</td><td>DRE Veterinary</td><td># 336</td><td>翻新设备</td></tr><tr><td>解剖显微镜（SZX10）</td><td>Olympus Corporation</td><td>n/a</td><td>建议选择工作距离较大的型号</td></tr><tr><td>加热台</td><td>Rt, Effenberger, Germany</td><td>n/a</td><td>唯一供应商</td></tr><tr><td>血压监测设备</td><td>Cyber Sense, Inc</td><td>BPM02</td><td></td></tr><tr><td>I STAT</td><td>Abbott Laboratories</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

小鼠模型被广泛用于研究不同器官系统的急性损伤（1-34）。急性肺损伤（ALI）可由长时间机械通气引发，是危重症患者发病和死亡的重要原因，针对新的遗传学或药理学靶点的研究目前正受到广泛关注（1-3, 5, 8, 26, 30, 33-36）。ALI 的特征是疾病急性发作，导致非心源性肺水肿以及随后的肺气体交换功能障碍（36）。我们已建立了一种通过压力控制通气诱导呼吸机相关性肺损伤的小鼠 ALI 模型（2）。具体方法为：对 C57BL/6 小鼠实施麻醉后行气管切开术，随后通过机械通气诱导 ALI。小鼠在压力控制模式下通气，吸气峰压为 45 mbar，持续 1 - 3 小时。评估指标包括肺水肿（湿重/干重比）、支气管肺泡灌洗液白蛋白含量、支气管肺泡灌洗液及肺组织髓过氧化物酶含量，以及肺气体交换功能（2）。利用该技术，我们已证实其可有效诱导急性肺部炎症，并能区分不同处理组或基因型之间的差异（1-3, 5）。因此，该技术可能有助于研究人员利用基因敲除小鼠模型，从遗传学角度探讨参与 ALI 的分子机制。

一种用于研究急性肺损伤的呼吸机诱导肺损伤小鼠模型 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位 使用高压机械通气诱导肺急性损伤的急性肺损伤模型。

小鼠模型被广泛用于研究不同器官系统的急性损伤（1-34）。急性肺损伤（ALI）在持续...

本实验的总体目标是通过使用呼吸机在小鼠体内诱导肺损伤。该过程通过实施气管切开术并给予高压机械通气来实现。随后，插入颈动脉导管以测量血流动力学参数。在动物接受机械通气足够长时间以诱导肺损伤后，采集动脉血样本和支气管肺泡灌洗液。该操作的最后一步是收获肺组织以进行进一步分析。最终可获得结果，将所采集样本的变化与机械通气的持续时间相关联。与现有的脂多糖（LPS）吸入等方法相比，该技术的主要优势在于能够诱导出一种急性肺损伤，其具有人类急性呼吸窘迫综合征的所有主要特征。首先，将一只麻醉后的小鼠仰卧置于温度可控的加热台上，用缝合线材料绕过每只肢体，并将缝合线固定在台面上。接着，将缝合线穿过上排牙齿下方，以固定头部位置。给予500微升生理盐水推注，并插入连接至温度反馈控制器的直肠探针，以确保体温维持在37摄氏度。准备完成后，可在小鼠体表覆盖矿物油，以减少毛发中过敏原的暴露。最后，用市售食品保鲜膜包裹动物，以帮助维持体温。为了暴露气管，沿颈部做一切口，钝性分离周围的肌肉和结缔组织。将两条长约10厘米的外科缝线置于气管下方，间距约1厘米。使用显微镊和Vanna剪刀，在喉部下方约3至4毫米处的两节软骨环之间小心切开气管。完成插管时，将钝头聚乙烯导管的尖端以85度角插入气管。接着，倾斜导管使其与气管管腔对齐。缓慢推进导管，直至其尖端完全进入胸腔开口。用先前置于气管下方的两根外科缝线将导管固定到位。最后，将导管连接至呼吸机。肺损伤由西门子Servo 900 C呼吸机诱导。采用压力控制通气技术，将吸气峰压设定为 45 毫巴，呼吸频率为 80 次/分钟，呼气末正压为 0 至 3 毫巴，吸入氧浓度为 1，吸气与呼气时间比为 1:1。动物成功连接呼吸机后，插入导管至颈动脉以监测血压和心率。若先将前肢固定于体侧，则可暴露更长一段动脉。首先钝性分离气管旁肌肉，暴露颈动脉。动脉分离后，在其近端结扎，然后用夹子或胶带固定。在距离第一根缝线约一厘米处放置第二根缝线，打结但不要收紧。继续游离动脉至远端，并用小夹子夹闭以防止出血。使用显微剪刀在第二道结扎线以上的动脉处剪出一个小的斜向开口。用精细镊子夹住开口，同时插入导管，并拉紧结扎线以固定导管。接着，松开夹钳，继续推进导管。将导管推进至第二道缝线远端，用数个结扎结固定导管并用胶带加固。导管就位后，以每小时0.1毫升的速度输注生理盐水，并连接至血压测量装置。最后，将夹钳连接至四肢以监测心率。机械通气三小时后，采集样本以评估肺损伤程度。首先，通过颈动脉导管采集样本进行血气分析。加深麻醉深度后，断开呼吸机连接，插入装有1毫升磷酸盐缓冲液的注射器。推动注射器活塞，等待三秒后将支气管肺泡灌洗液重新吸入注射器。需要注意的是，回收的液体体积应明显少于1毫升。Flash。将支气管肺泡灌洗液在液氮中速冻，并于负80摄氏度保存。为分离肺脏，首先在胸骨下方做一切口。用镊子夹住胸骨，并沿肋骨框架延伸切口。接着，在远离肋骨的边缘处剪开膈肌，以充分暴露胸腔下部开口。用镊子抬起胸骨，沿左右两侧做长切口打开胸腔，尽量使切口靠近外侧，以便完全翻开前胸壁。将27½号针头连接至装有5毫升PBS的注射器上。将针头插入右心室，灌注整个体循环，直至肺部完全变白。如果未达到此效果，请确保针尖正确置于右心室，并在必要时调整位置。切除肺部并阻断，通过上提心脏并切断气管来完成。使用组织材料吸收任何阻碍视野的血液。将心脏向腹部方向牵拉，沿脊柱仔细剪开，以游离所有胸腔器官。剪断主动脉，将胸腔器官置于洁净的手术台上。分离心脏并清除样本上的主要血管。确保肺组织上无残留的胸腺组织。将肺叶分离后分别放入不同的管中，迅速冷冻，并于-80摄氏度保存，以备后续分析。如图所示，支气管肺泡灌洗液中的蛋白质含量随通气时间的延长而增加。蛋白质含量的相对变化以通气0小时为基准进行归一化，用于评估肺损伤程度。通过ELISA检测白蛋白和髓过氧化物酶，并对支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞进行定量分析。

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本文介绍了一种通过插管将博来霉素直接注入小鼠气管的快速简便方法。该方法的主要优点在于具有高度可重复性、易于掌握，且无需特殊设备或漫长的恢复时间。...

一种改进的小鼠气管快速插管方法

本方案在小鼠中诱导急性肺损伤，其病理发生过程与人类观察到的酸性肺炎高度相似。我们通过开放式气管造口术结合环周压力释放，产生最大程度的急性非致死性低pH肺损伤，并考虑了啮齿类与人类在呼吸系统解剖结构上的差异。...

开放气管切开胃酸误吸小鼠急性肺损伤模型可诱导最大程度的急性非致死性肺损伤

本文介绍了一种通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的逐步操作方法，以及对血液样本、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行流式细胞术分析的方法。该方法具有侵入性小、操作简便、可重复性好以及可滴定疾病严重程度等优点。...

通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤

在小鼠左侧肺进行选择性支气管内酸灌注，可导致单侧且自限性的急性肺损伤，该模型模拟了由胃酸误吸引起的人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。...

通过单侧支气管内注射酸建立自限性急性肺损伤模型

经臭氧与细菌内毒素联合暴露的小鼠表现出广泛的细胞死亡，包括中性粒细胞的死亡。我们观察到细胞发生多种适应性变化，例如细胞骨架片状伪足结构的破坏、支气管肺泡灌洗液中复合体V...

可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化

采用0.9%生理盐水（35 mL/kg体重，37...

表面活性物质耗竭联合损伤性通气可建立可重复的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型

活体荧光显微镜可用于实时研究白细胞与内皮细胞的相互作用以及毛细血管灌注。本方案描述了利用真空稳定肺成像系统对肺微循环中的这些参数进行成像和定量的方法。...

采用真空稳定成像系统对实验性急性肺损伤中肺微循环进行活体宽场荧光显微观察

一种小鼠手术模型，可在维持通气并避免缺氧的情况下建立左肺缺血再灌注（IR）损伤。...

一种经口插管小鼠模型及通气肺缺血-再灌注手术

此处，我们提出一种经气管递送脂多糖（LPS）的实验方案 通过 无创经口咽气管插管。该方法可最大限度地减少手术操作对动物造成的创伤，并能准确地将LPS输送至气管，进而进入肺部。...

小鼠非侵入性气管内脂多糖滴注

本方案描述了一种新生仔猪急性肺损伤模型的建立方法，该模型模拟早产肺中发生的早期致病事件，包括表面活性物质不足、高氧暴露、高压通气以及炎症反应，旨在促进对支气管肺发育不良分子触发机制的理解，并推动治疗策略的转化应用。...

建立一种新生仔猪急性肺损伤模型以重现早产儿肺部早期环境

在本研究中，采用一种非侵入性气管内滴注技术，通过基本的喉镜确保将脂多糖（LPS）精确递送至肺部，从而在大鼠中建立急性肺损伤（ALI）模型。LPS被滴注入气管 通过 使用喉镜插入气管插管。在多个时间点评估肺损伤程度。...

非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

了解使用压力控制通气在小鼠体内诱导急性肺损伤的实验方法。该技术通过气管切开术和高压力机械通气模拟人类急性呼吸窘迫综合征，为研究急性肺损伤机制提供可靠的动物模型。

压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

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