收集变浓度等温滴定量热法数据集以确定结合机制

本实验的总体目标是确定描述大分子与其配体结合的正确物理模型，并测定相关的热力学参数。首先通过充分透析制备大分子的储备溶液，然后将目标配体溶解于最终的透析缓冲液中，并在第二步中测定所有组分的浓度。

将大分子和配体样品小心地稀释至一系列不同浓度。接下来，在多种配体和蛋白质浓度条件下进行一系列等温滴定 calorimetry（ITC）实验，以在该实验流程的最后一步获得一系列ITC等温曲线。通过使用不同的物理模型对这一系列实验进行全局分析，并确定与实验数据整体吻合最佳的模型为正确模型。

今天，我将向您展示一种方法，该方法有助于回答生物物理学问题，例如蛋白质分子如何与其配体结合，并可提供对结合参数（如焓变、熵变和结合常数）的精确测量。在开始本实验方案之前，需纯化目标蛋白质。本演示中使用的生物大分子是一种免疫糖苷 N 六磷酸，即一种转移酶 S1 或 C 六磷酸 S1。首先，配制四升透析缓冲液并冷却至 4°C。接下来，对少量大分子溶液进行透析。

在此情况下，将5毫升400微摩尔的AAC C六prime，一置于1.3升透析缓冲液中，在4摄氏度下进行。可在冷室或冰箱中操作，每8小时更换一次新鲜缓冲液，总共透析三次。保留最终的透析液。

将750毫升终末透析液通过0.45微米纤维素滤膜过滤，并于4摄氏度保存。此缓冲液现称为运行缓冲液，将用于洗涤及作为稀释剂。对于样品，需用运行缓冲液充分冲洗0.2微米注射器滤膜。

加入蛋白样品并过滤。在储存蛋白溶液之前，用锥形管轻轻收集样品，并使用标准蛋白检测方法测定蛋白浓度。本实验中，蛋白浓度通过在280纳米处的吸光度（ABSORBENCE）测定，并据此计算酶浓度。

使用由EXI蛋白质组学服务器生成的消光系数，以最大化长期稳定性的方法储存蛋白质。AAC C six prime one eye必须在4°C下保存，因为其在冻融后无法保持活性。接下来，溶解配体和运行缓冲液。在本演示中，将4毫克乙酰辅酶A溶解于200微升运行缓冲液中，配制成25毫摩尔的储备溶液。

该配体可保存在零下78摄氏度，直至准备使用以制备ITC样品。首先，根据AAC六撇一I的书面实验方案中所述，计算酶的浓度，以获得C值为64，这对应于192微摩尔的浓度。在此浓度下配制2毫升的大分子溶液，用过滤后的运行缓冲液稀释储备液。将乙酰辅酶A溶液置于冰水浴中解冻。待乙酰辅酶A溶液完全解冻后，轻轻混匀，通过将大分子浓度乘以结合位点数再乘以10，计算配体溶液的浓度。

通过将80微升25毫摩尔的乙酰辅酶A储备液加入420微升运行缓冲液中并混匀，配制乙酰辅酶A溶液。将稀释后的乙酰辅酶A溶液转移至移液管填充管中，并将剩余的25毫摩尔储备液放回-78摄氏度保存。在19摄氏度（比目标实验运行温度低1摄氏度）下，对a C six prime one eye和辅酶A溶液进行真空脱气5分钟。

安装注射器时，将注射器穿过注射器支架，直至预装的注射器夹与支架处于同一高度。将第二个注射器夹套在注射器上，直至其紧贴支架底部。使用提供的 0.05 英寸球头六角扳手轻轻拧紧夹具。

接下来，将注射器固定架放入移液管架中。轻轻将移液注射器滑入注射针筒，确保推杆尖端直接插入针筒的孔中。完全插入后，将注射器固定架的锁紧螺帽拧入移液注射器中。

在上样 A a C six prime one eye 蛋白样品溶液之前，使用仪器配备的细胞清洗系统，用至少 50 毫升运行缓冲液清洗样品池。用长针头 2.5 毫升玻璃注射器抽吸，除去样品池中残留的缓冲液。使用第二个洁净干燥的长针头，从脱气真空装置中移除溶液。

2.5 毫升注射器。小心吸取至少 1.8 毫升的 A a C six prime one eye 蛋白样品至注射器中。注意避免产生气泡。

将蛋白质样品吸入注射器后，将针头插入样品池并轻轻接触池底。然后将针头向上提升约一毫米，缓慢将样品注入样品池，直至样品液面升至样品池顶部并可见液体溢出。为排除样品池中可能存在的气泡，将针头向上提升约一厘米，同时确保溢流口处始终有溶液存在，随后快速抽出并重新注入约 0.25 毫升溶液。

现在轻轻地将针头沿溢流口侧面向上滑动。在样品孔中，针头会碰到一个凸起的台阶。将此台阶上方的所有液体吸出，因为该台阶指示了运行溶液所需的液面高度。

为装载注射用注射器，将塑料管膨胀注射器连接到填充口，并将活塞尖端降至填充口顶部。然后将DGA配体溶液的移液管填充管置于移液管架底部。检查注射器尖端未接触填充管底部，缓慢将溶液吸入注射器，直至有少量溶液进入装载注射器的管中。

接下来，通过降低活塞头来关闭填充口。此操作可通过点击关闭填充口按钮完成。然后去除在加载过程中可能被困住的任何气泡。

单击排空填充按钮进行排空和重新填充。总共执行三次排空和重新填充操作。排空填充过程完成后，从移液器支架上取下填充管，并用实验室纸巾轻轻擦拭注射器尖端。

现在将移液器组件的注射器缓慢插入样品中。操作时需小心谨慎，动作要缓慢，因为针头容易弯曲。通过按压锁定卡箍底部，确保注射器完全插入。

固定好注射器后，设定所需的运行温度，并选择略高于预期最大注射热流的参比功率。本示例中，运行温度和参比功率分别设为 20 摄氏度和 20 微卡每秒。然后设定所需的注射体积和延迟时间。

此处使用28次进样，第一次进样体积为2 µL，延迟时间为62秒，后续进样体积为10 µL，延迟时间为332秒。本实验演示了在单一浓度下生成数据集的基础方法，以获得生成额外曲线所需的数据。通过逐步降低大分子和配体浓度重复此过程。

务必确保所有大分子和配体样品均来自同一母液，以尽量减少浓度误差。图中显示的是将 3.86 毫摩尔的配体乙酰辅酶 A 滴定到 192 微摩尔的小分子 A A C six prime one 中所获得的原始等温滴定热量测定曲线。

采用双位点连续结合模型，利用眼（Eye）的整合值确定结合参数。该图显示了通过等温滴定量热法（ITC）测定的不同浓度ACE辅酶A与AAC C六号位点一（Six Prime One Eye）相互作用生成的结合等温线。实验数据以空心圆圈表示，分别拟合至两个独立位点模型和双位点连续结合模型。

与双位点顺序模型相比，结果吻合得更好。所用蛋白质浓度在随文文本中已作定义。进行此操作时，务必精确进行稀释，因为浓度的变化可能对实验结果产生显著影响。