Name: 收集可变浓度等温滴定量热数据集，以确定约束机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习使用等温滴定量热法（ITC）收集可变浓度数据集，以确定大分子与配体结合的正确物理模型并提取热力学参数。该方法为药物设计和生物化学研究提供重要框架。

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本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）、自然科学与工程研究委员会（NSERC）以及CIHR培训资助奖学金（授予L.F.）的支持。我们感谢加拿大麦克马斯特大学的Gerard D. Wright教授提供AAC(6)-Ii表达质粒。

1. 配制储备溶液
<ol>
	<li>纯化目标大分子。（本实验中，氨基糖苷类 N-6'-乙酰转移酶-Ii（AAC6'-Ii）的分离方法参见其他文献报道13。）</li>
	<li>配制 4 升透析缓冲液。（本实验中使用 25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，分子量 238.3 g/mol），含 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA，分子量 292.2），pH 调至 7.5。）</li>
	<li>对蛋白进行透析。所用 AAC(6')-Ii 样品（5 mL，浓度 400 μM）需在透析缓冲液中透析三次，每次 1.3 L。最终的透析液保留用于冲洗仪器及稀释样品。</li>
	<li>将最终透析液经 0.45 μm 纤维素滤膜过滤后，于 4°C 保存。该缓冲液后续称为“运行缓冲液”。</li>
	<li>将蛋白溶液经已用运行缓冲液充分冲洗过的 0.2 μm 注射器滤膜过滤。使用标准方法（如 Bradford 法、Lowry 法等）或紫外吸光度测定蛋白最终浓度。储存蛋白时应确保其长期稳定性。（对于 AAC(6')-Ii 蛋白，应于 4°C 保存。该蛋白在冻融后无法保持活性。）</li>
	<li>将 4.0 mg 乙酰辅酶 A（AcCoA，配体，分子量 809.57）溶于运行缓冲液中，配制成 200 μL 的 25 mM 储存液。待用前于 -78°C 冻存。</li>
	<li>所有蛋白和配体样品必须来源于同一母液，以最大限度减少样品间浓度的随机波动。在整个变浓度滴定实验（variable-c）数据集中，蛋白浓度采用单一校正因子在数据分析中进行调整。10</li>
</ol>
2. 准备等温滴定量热法（ITC）样品
<ol>
	<li>将酶溶液稀释至c值为64，终体积为2 mL。（对于AAC(6')-Ii，这相当于192 μM。）</li>
	<li>将配体（AcCoA）储备溶液迅速置于冰水中解冻。</li>
	<li>用流动缓冲液将80 μL AcCoA储备溶液稀释至420 μL，配制0.5 mL浓度为蛋白结合位点数量10倍的AcCoA溶液（本例中为4 mM）。转移至移液管填充管中。迅速将AcCoA储备溶液放回-78°C保存。</li>
	<li>在比设定运行温度低1°C（19 °C）的条件下，将蛋白及溶液在真空下脱气5分钟。</li>
</ol>
3. 注射器的准备14
<ol>
	<li>将注射器插入注射器支架，直到预装的注射器夹与支架处于同一高度。</li>
	<li>将第二个注射器夹套在注射器上，直至其紧贴支架底部。使用提供的 0.050" 球头六角扳手轻轻拧紧夹具。</li>
	<li>将注射器支架放入移液器支架中。</li>
	<li>轻轻将移液器注射装置滑入注射器内，确保推杆尖端直接插入注射器孔中。完全插入后，将注射器支架的锁紧环拧入移液器注射装置。</li>
</ol>
4. 加载样品池14
<ol>
	<li>用至少 50 mL 运行缓冲液清洗样品池，并使用带长针头的 2.5 ml 玻璃注射器吸除残留液体。</li>
	<li>缓慢将至少 1.8 ml 蛋白质样品溶液吸入洁净干燥的带长针头的 2.5 ml 注射器中。注意避免引入气泡。</li>
	<li>小心将针头插入样品池并轻轻接触池底。将针尖略微上提（约 1 mm），然后缓慢注入 AAC(6')-Ii 溶液，直至样品池顶部可见多余液体溢出。</li>
	<li>一边缓慢上提针头约 1 cm，一边确保溢流口处始终有液体存在。迅速抽出并注入少量溶液（约 0.25 ml），以排除样品池中可能滞留的气泡。</li>
	<li>清除所有溢出的溶液。操作时将针头沿溢流侧壁轻轻滑入样品池内，当针尖触碰到一个台阶时即达到运行溶液的理想液面高度。将此线以上的所有液体完全吸除。</li>
</ol>
5. 加载注射器并启动运行14
<ol>
	<li>将塑料管路装填注射器连接至注液口。 </li>
	<li>将柱塞尖端降至加样口顶部。</li>
	<li>将乙酰辅酶A溶液置于移液管支架底部的移液管填充管中。注射器尖端不应接触填充管底部。</li>
	<li>缓慢将溶液吸入注射器，直至少量溶液进入加样注射器的管中。</li>
	<li>通过降低柱塞尖端并点击“关闭灌注口”按钮来关闭灌注口。点击“冲洗-重新填充”按钮进行冲洗和重新填充。&gt;填充按钮，重复3次以去除加载过程中可能混入的气泡。</li>
	<li>从移液管架上取下填充管，并轻轻擦拭注射器尖端。</li>
	<li>取移液器组件，将注射器轻轻插入样品池中。操作需缓慢，因为注射器容易弯曲，须格外小心。通过按压锁定卡环底部，确保注射器完全插入。</li>
	<li>设定所需的运行温度（此处 20°C），并选择一个略大于预期最大注入热流的参考功率（本案例中 20μcal/sec).</li>
	<li>设定所需的注射体积和延迟时间。（本实验中采用了28次注射。第一次注射的体积为 2 μL 延迟60秒。所有后续注射的体积均为 10 μL 延迟330秒。</li>
</ol>
6. 后续运行
<ol>
	<li>在所有后续实验中重复步骤 2-5，同时将 AAC(6')-Ii 和 AcCoA 的浓度依次降低为原来的 1/2、1/4、1/8、1/16 和 1/32。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>采用拟合程序，将所有等温线全局拟合至一组结合参数，具体方法如前所述10。</li>
</ol>
8. 代表性结果
代表性数据如图1所示。等温线的形状应随浓度变化而变化。当c值较高（即蛋白质和配体浓度较高）时，预期会出现更陡峭的转变（图2）。 
对于AAC(6')-Ii，双位点顺序模型的拟合效果优于描述两组相同且独立结合位点并具有可调化学计量比的模型。 
<img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig1.jpg" alt="等温滴定量热法结果，滴定曲线显示摩尔比下的热量变化，数据分析图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 将乙酰辅酶A（3.86 mM）滴定至AAC(6')-Ii（192 μM）所产生的等温线。A) 原始ITC曲线。B) 用于确定结合参数的积分值（方块），采用双位点连续结合模型拟合（实线）。 
<img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig2.jpg" alt="显示结合相互作用曲线和热力学分析的等温滴定微量热法图谱" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 将乙酰辅酶A（AcCoA）以不同浓度滴定至AAC(6')-Ii蛋白中的等温滴定微量热（ITC）等温曲线。实验数据（空心圆圈）拟合为两组独立结合位点模型（虚线，品红色）和双位点顺序结合模型（实线，蓝色）。双位点顺序结合模型明显提供了更优的整体拟合效果。所使用的AAC(6')-Ii与AcCoA浓度分别为：A) 6 μM, 0.25 mM；B) 12 μM, 0.25 mM；C) 24 μM, 0.5 mM；D) 48 μM, 1.0 mM；E) 96 μM, 1.9 mM；F) 196 μM, 3.86 mM。

<ol><li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li>
<li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2004%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Okhrimenko, O. ksana, J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li>
<li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li>
<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li>
<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li>
<li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li>
<li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase%3A+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li>
<li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC%286%27%29-Ii+from+Enterococcus+faecium%3A+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li>
<li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li>
<li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ITC+Data+Analysis+in+Origin%22">ITC Data Analysis in Origin</a>. , 7 edn, MicroCal. (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

可变浓度c拟合的这一分析部分此前已有详细描述10。本文报道了采集适用于该方法的可变浓度c数据集的实际操作要点。所有蛋白质和配体样品必须来自相同的储备溶液，因此初始阶段需制备足够量的储备液以完成全部系列实验。这可确保AAC(6')-Ii与AcCoA的比例在所有实验中保持恒定，并减少样品间浓度的随机波动。
在此情况下，必须谨慎操作配体。乙酰辅酶A（AcCoA）在溶液中化学性质不稳定，因此务必确保其储备液处于液态的时间极短。一旦从储备液中取出所需用量，必须立即重新冷冻储备液。若不如此操作，AcCoA可能随时间推移发生降解，导致后续实验中的浓度不准确。分装后的AcCoA样品必须立即使用。对于不稳定的蛋白质，同样需要采取类似的预防措施。
该方案可轻松修改以用于研究其他复杂系统。10 所用浓度必须根据特定系统的结合常数进行调整。广泛的范围 c 约1至1000之间的数值8,10 在整个数据集中是必需的。

<table><tbody><tr><td>乙酰基 c&amp;#8211;乙酰辅酶A（AcCoA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>Fisher Scientific</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 2 透析管</td><td>Spectrum Labs</td><td>132678</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器（0.2 &amp;mu;m)</td><td>VWR 国际公司</td><td>281445-477</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜滤器（0.45 &amp;mu;m)</td><td>Whatman，GE Healthcare</td><td>7184-004</td><td></td></tr><tr><td>VP-ITC</td><td>MicroCal</td><td>VP-ITC</td><td>用于测量的微热量计</td></tr><tr><td>ThermoVac</td><td>MicroCal</td><td>USB Thermo Vac</td><td>温度控制脱气站</td></tr></tbody></table>

收集变浓度等温滴定量热法数据集以确定结合机制

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

等温滴定 calorimetry（ITC）常用于测定配体与宿主大分子结合过程中相关的热力学参数。相较于研究宿主/配体相互作用的常见光谱学方法，ITC 具有一些优势。例如，当两个组分相互作用时所释放或吸收的热量被直接测量，无需任何外源性报告分子。因此，结合焓和缔合常数（Ka）可直接从 ITC 数据中获得，并可用于计算熵贡献。此外，等温曲线的形状依赖于 c 值及所涉及的机制模型。c 值定义为 c = n[P]tKa，其中 [P]t 为蛋白质浓度，n 为宿主分子内配体结合位点的数量。在许多情况下，同一配体的多个结合位点并不等同，而 ITC 可用于表征每个独立结合位点的热力学结合参数。然而，这要求使用正确的结合模型。若不同模型均可拟合同一实验数据，则模型选择可能成为问题。我们此前已证明，通过在多个 c 值下进行实验可规避此问题。在不同 c 值下获得的多条等温曲线可同时拟合至不同模型。随后基于整个变 c 值数据集的拟合优度来确定正确模型。本文将该方法应用于氨基糖苷类耐药酶——氨基糖苷 N-6'-乙酰转移酶-Ii（AAC(6')-Ii）。尽管本方法适用于任何体系，但该策略的必要性在表现出变构效应或协同性的大分子-配体体系中更为显著，尤其是在不同结合模型对同一数据产生几乎相同拟合效果的情况下。据我们所知，目前尚无此类商业可得的系统。AAC(6')-Ii 是一种同源二聚体，含有两个活性位点，且两个亚基之间表现出协同性。然而，在单一 c 值下获得的 ITC 数据可 equally well 拟合至少两种不同模型：一种为两组独立位点模型，另一种为双位点序贯（协同）模型。通过如上所述改变 c 值，我们确定 AAC(6')-Ii 的正确结合模型为双位点序贯结合模型。本文中，我们描述了进行 ITC 实验时必须采取的步骤，以获得适用于变 c 值分析的数据集。

等温滴定量热法（ITC）是研究配体与其宿主结合的有力工具。然而，在复杂体系中，可能有多个模型对数据的拟合效果相当。本文所述方法提供了一种手段，用于阐明复杂体系中合适的结合模型，并提取相应的热力学参数。

等温滴定 calorimetry（ITC）常用于测定配体与宿主结合相关的热力学参数……

本实验的总体目标是确定描述大分子与其配体结合的正确物理模型，并测定相关的热力学参数。首先通过充分透析制备大分子的储备溶液，然后将目标配体溶解于最终的透析缓冲液中，并在第二步中测定所有组分的浓度。将大分子和配体样品小心地稀释至一系列不同浓度。接下来，在多种配体和蛋白质浓度条件下进行一系列等温滴定 calorimetry（ITC）实验，以在该实验流程的最后一步获得一系列 ITC 等温曲线。对这一系列实验数据采用不同的物理模型进行全局分析，并确定能提供最佳整体拟合效果的模型为正确模型。今天我将向您展示一种方法，该方法可用于解答生物物理学问题，例如蛋白质分子如何与其配体结合，并可准确测定结合参数，如焓变、熵变和结合常数。在开始本实验方案之前，需纯化目标蛋白质。本演示中所用的大分子为免疫糖苷N-六磷酸，一种转移酶SIX Prime A或C六磷酸A I。首先，配制四升透析缓冲液并冷却至四摄氏度。接下来，对少量大分子溶液进行透析。在此情况下，将5毫升400微摩尔的AAC C六 prime，一 eye 溶于1.3升透析缓冲液中，在4摄氏度条件下进行透析。可在冷室或冰箱中操作，每8小时更换一次新鲜缓冲液，总共透析三次。保留最终的透析液。将750毫升终末透析液通过0.45微米纤维素滤膜过滤，并于4摄氏度保存。此缓冲液现称为运行缓冲液，将用于洗涤及作为稀释剂。对于样品，需用运行缓冲液充分冲洗0.2微米注射器滤膜。加入蛋白样品并过滤。在储存蛋白溶液之前，用锥形管轻轻收集样品，并使用标准蛋白检测方法测定蛋白浓度。本实验中，蛋白浓度通过在280纳米处的吸光度（ABSORBENCE）测定，并据此计算酶浓度。使用来自 EXI 蛋白质组学服务器生成的消光系数，以最大化长期稳定性的方法储存蛋白质。AAC C six prime one eye 必须在 4 摄氏度下保存，因为其在冻融后无法保持活性。接下来溶解配体和运行缓冲液。本演示中，将 4 毫克乙酰辅酶 A 溶解于 200 微升运行缓冲液中，配制成 25 毫摩尔的储备溶液。该配体可在使用前储存在零下78摄氏度，用于制备ITC样品。首先，根据AAC六撇一I的书面实验方案，计算酶的浓度，以获得C值为64，这对应于192微摩尔的浓度。在此浓度下配制2毫升的大分子溶液，用过滤后的运行缓冲液稀释原液。将乙酰辅酶A溶液在冰水浴中解冻。待乙酰辅酶A溶液完全解冻后，轻轻混匀，通过将大分子浓度乘以结合位点数再乘以10，计算配体溶液的浓度。通过将80微升25毫摩尔的乙酰辅酶A储备液加入420微升运行缓冲液中并混匀，配制乙酰辅酶A溶液。将稀释后的乙酰辅酶A溶液转移至移液管填充管中，并将剩余的25毫摩尔储备液于-78摄氏度保存。在19摄氏度（比预定实验运行温度低1摄氏度）条件下，对AC6'1I和辅酶A溶液进行真空脱气5分钟。安装注射器时，将注射器穿过注射器支架，直至预装的注射器夹与支架处于同一高度。将第二个注射器夹套在注射针筒上，直至其紧贴支架底部。使用提供的 0.05 英寸球头六角扳手轻轻拧紧夹具。接下来，将注射器架放入移液器架中。轻轻将移液注射器滑入注射针筒内，并确保推杆尖端直接插入针筒的孔中。完全插入后，将注射器架的锁紧环拧入移液注射器中。在上样A a C six prime one eye蛋白样品溶液之前，使用仪器配备的细胞清洗系统，用至少50毫升的运行缓冲液清洗样品池。用一支长针头2.5毫升玻璃注射器抽吸，去除样品池中残留的缓冲液。使用第二支洁净干燥的长针头，从脱气真空装置中移除溶液。2.5 毫升注射器。小心吸取至少 1.8 毫升的 A a C six prime one eye 蛋白样品至注射器中。注意避免产生气泡。将蛋白样品加入注射器后，将针头插入样品池并轻轻接触池底。然后将针头向上提起约一毫米，缓慢向池中注入样品，直至样品液面高出样品池顶部并可见液体溢出。为排除池中可能存在的气泡，将针头向上提升约一厘米，同时确保溢出部分仍保持液体存在，随后迅速抽出并重新注入约0.25毫升溶液。现在轻轻地将针头沿溢流侧壁向上滑动。在样品孔中，针头会碰到一个凸起的台阶。将此台阶上方的所有液体吸出，因为该台阶指示了运行溶液所需的液面高度。为装载注射器，将塑料管膨胀注射器连接到填充口，并将活塞末端降至填充口顶部。然后将DGA配体溶液的移液管填充管置于移液管架底部。检查注射器尖端未接触填充管底部，缓慢将溶液吸入注射器，直至有少量溶液进入装载注射器的管中。接下来，通过降低活塞头来关闭填充口。此操作可通过点击“关闭填充口”按钮完成。然后去除在加载过程中可能被困住的任何气泡。单击排空-填充按钮进行排空和填充。总共执行三次排空和填充操作。排空-填充过程完成后，从移液器支架上取下填充管，并用实验室纸巾轻轻擦拭注射器尖端。现在将移液器组件的注射器缓慢插入样品中。操作时需小心谨慎，动作要缓慢，因为针头容易弯曲。通过按压锁定卡箍底部，确保注射器完全插入。固定好注射器后，设定所需的运行温度，并选择略高于预期最大注射热流的参比功率。本示例中，运行温度和参比功率分别设为 20 摄氏度和 20 微卡每秒。然后设定所需的注射体积和延迟时间。此处使用28次进样，第一次进样体积为2微升，延迟时间为62秒，后续进样体积为10微升，延迟时间为332秒。本实验演示了在单一浓度下生成数据集的基础方法，以获得生成额外曲线所需的数据。通过逐步降低大分子和配体浓度重复此过程。务必确保所有大分子和配体样品均来自同一母液，以尽量减少浓度误差。图中显示的是将3.86毫摩尔的配体乙酰辅酶A滴定至192微摩尔的小分子AAC6'1中所获得的原始等温滴定热量测定曲线。采用双位点连续结合模型，利用眼（Eye）的积分值确定结合参数。该图展示了通过等温滴定量热法（ITC）测定不同浓度的ACE辅酶A与AAC C六号引物一（Six Prime One Eye）所产生的等温结合曲线。以空心圆圈表示的实验数据同时拟合了双独立结合位点模型和双位点连续结合模型。与双位点顺序模型相比，结果吻合得更好。所使用的蛋白质浓度在随文文本中已作定义。进行此操作时，务必精确进行稀释，因为浓度的变化可能对实验结果产生显著影响。

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收集可变浓度等温滴定量热数据集，以确定约束机制

本文介绍了一种利用等温滴定 calorimetry...

等温滴定 calorimetry 测定大分子-配体亲和力

本视频演示了差示扫描量热法——一种用于研究生物分子与配体之间相互作用的技术。通过对待测样品施加反复的加热和冷却循环，并获取热力学分析所需的扫描数据，来研究DNA适配体与热不稳定配体之间的结合。...

利用差示扫描量热法研究DNA适配体与热不稳定配体的相互作用

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利用微尺度热泳技术绘制适配体在ATP上的结合位点

本文描述了一种进行滴定ELISA的详细实验方案。此外，还提出了一种新颖的算法，用于评估滴定ELISA结果，并获得可溶性配体与微孔板固定化受体结合的解离常数。...

利用滴定ELISA法测定受体-配体相互作用解离常数的方法

关键词：ELISA，滴定，解离常数，受体-配体结合，结合亲和力

通过等温滴定 calorimetry（ITC）可方便地测定酶活性的热稳定性。目前使用的大多数蛋白质稳定性检测方法仅测量蛋白质的去折叠过程，而无法提供有关酶活性的信息。ITC...

通过等温滴定 calorimetry 测定酶的稳定性

微量热泳技术能够以较低的材料消耗快速获得结合常数。目前市面上有标记型和无标记型微量热泳技术可供选择；然而，无标记型热泳技术在相互作用检测的多样性方面不及使用荧光标记的技术。本文提供了一种基于标记型热泳的检测方案。...

使用微尺度热泳技术测量蛋白质-脂质相互作用

本文重点介绍利用电子吸收光谱法和等温滴定热法来研究并量化 Cu(II)...

量化在有无发色团存在下Cu(II)与肽残基之间的结合相互作用

本实验方案描述了使用等温滴定...

利用等温滴定量热法测定DNA适配体与四环素结合的热力学和动力学参数

一种在特定时间点采集和测定手术伤口生化介质的技术。...

采集与测定手术伤口中的伤害性及炎性介质

学习使用等温滴定量热法（ITC）收集可变浓度数据集，以确定大分子与配体结合的正确物理模型并提取热力学参数。该方法为药物设计和生物化学研究提供重要框架。

收集变浓度等温滴定量热法数据集以确定结合机制

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