Name: 成人出生的神经元的整合研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学习利用逆转录病毒标记与全细胞膜片钳电生理技术，研究成年小鼠海马齿状回新生颗粒细胞的功能性突触整合与成熟过程。该方法为神经发生研究提供高分辨率分析手段。

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本工作由NINDS和美国心脏协会资助予S.Ge。该方法最初由作者在约翰斯·霍普金斯大学洪军宋博士的实验室中建立并发展。我们感谢洪军宋博士提供的指导与支持。

1. 病毒注射
通过将逆转录病毒载体和VSVG共转染到HEK293T细胞中，随后对病毒上清液进行超速离心，可制备出高滴度的重组逆转录病毒（1×109 单位/ml）。有关来源和制备方法，请参见JoVE的优秀演示（3）。
注意：使用4至6周龄的雌性C57Bl/6小鼠（Charles River），在标准条件下饲养。所有操作均遵循美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》，并经石溪大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
<ol>
	<li>将每只动物 2 μl 冻存的逆转录病毒置于冰上解冻。</li>
	<li>使用每克体重 100 μg 氯胺酮和 10 μg 哌替啶进行麻醉，并将动物固定于立体定位仪（Steolting）上。去除头部毛发，并用 70% 乙醇擦拭皮肤。</li>
	<li>暴露颅骨，使用牙科钻（0.6 mm 钻头）在以下坐标位置钻四个浅孔：
		<ul>
 	<li>前后方向 = 从前囟后 2 mm；左右方向 = ±1.6 mm；腹背方向 = 2.5 mm；前后方向 = 从前囟后 3 mm；左右方向 = ±2.6 mm；腹背方向 = 3.2 mm。</li>
 <li>前后方向 = 从前囟后 2 mm；左右方向 = ±1.6 mm；腹背方向 = 2.5 mm；前后方向 = 从前囟后 3 mm；左右方向 = ±2.6 mm；腹背方向 = 3.2 mm。</li>
		</ul>
		</li>
	<li>安装 1 μl Hamilton 平头注射器，以 0.25 μl/min 的速度向每个位点注射 0.5 μl 逆转录病毒至齿状回。（腹背方向深度参见上述坐标。）每次注射后停留 2 分钟，再缓慢撤出注射器，以防止液体回流。两次注射之间，用无菌 PBS 和涂抹棒短暂清洗注射器尖端外表面，以去除残留血液。</li>
		<li>使用 无菌 外科缝合材料（P-1 型，6-0 规格）缝合伤口，并将动物放回标准饲养环境，直至达到预定的注射后时间点。</li>
	</ol>
2. 切片制备
为了从成年小鼠获得高质量的急性脑片，我们采用改良的切割液进行脑片制备（见下文）。
<ol>
	<li>将切割液预冷至 0-4 °C 冰浴中，并用 95% O2-5% CO2 气体饱和至少 30 分钟。</li>
	<li>麻醉动物后，经心脏灌注冰冻且充氧的切割液。</li>
	<li>迅速将脑组织取出，置于含有经冷切割液润湿的滤纸的培养皿中。切除小脑，并在（可见的）注射坐标前至少 1 mm 处切出一个用于固定的平面。将脑组织粘附于振动切片机的切片台上，并将其置入充满冷且充氧切割液的切片室中。</li>
	<li>制备冠状面或水平面切片（厚度 300-350 μm），并用大口径移液管转移至含有室温人工脑脊液（ACSF）的孵育 chamber 中，该液体以 95% O2/5% CO2 持续充氧。</li>
	<li>在 32°C 下持续充氧孵育切片 30-60 分钟。记录期间将孵育 chamber 恢复至室温。</li>
</ol>
3. 电生理学实验
<ol>
	<li>将脑片转移至记录室中，持续用32°C - 34°C的含氧饱和人工脑脊液（ACSF）灌流。</li>
	<li>使用低倍物镜（10X）在显微镜下将双极钨刺激电极置于齿状回的分子层。</li>
	<li>通过GFP或dTomato的表达，在颗粒下层/颗粒细胞层中识别新生的齿状回颗粒细胞（DGCs）。在高倍镜（40X）下对新生神经元进行全细胞膜片钳记录。</li>
	<li>在电流钳模式下，通过注入一系列电流来获取记录细胞的动作电位特性。</li>
	<li>通过由记录软件控制的刺激隔离器，经刺激电极施加电刺激，并记录新生DGCs中诱发的突触后电流。</li>
</ol>
4. 数据分析
分析成年新生神经元在不同发育阶段诱发的突触后反应的幅度。
5. 典型结果
采用上述方案，新生齿状回神经元中的GFP表达通常与图1相似。需要注意的是，新生神经元易于观察，其树突和轴突均能被清晰标记。细小的齿状颗粒细胞（DGC）轴突和小树突棘的表达水平取决于病毒的质量与滴度、所使用的启动子以及体内表达时间的长短。在我们的实验中，注射后数天内通常即可观察到新生细胞及其亚细胞器，树突棘的表达可从发育的最早阶段开始追踪。对不同时间点的新生神经元进行全细胞记录，可研究其独特的细胞特性，例如动作电位（图2a），以及在成熟过程中突触整合到现有神经环路的过程（图2b）。
<img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="大鼠海马齿状回分子层颗粒神经元的荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 图1 成年小鼠水平齿状回切片中新出生神经元的双光子共聚焦图像。绿色细胞为注射后21天（dpi）表达GFP的新生颗粒细胞（DGCs），由pUX-GFP逆转录病毒感染标记。
<img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="电生理图；神经信号波形；时间测量；电生理数据。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 图 2 a) 21 天感染后（dpi）新生颗粒细胞（DGC）的动作电位发放特性。b) 在 21 dpi 记录的新生 DGC 上诱发的典型兴奋性突触后电流（EPSCs）。

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

成年哺乳动物大脑海马体中的持续神经发生为研究成熟大脑中神经元的发育与整合提供了一个独特的实验模型系统。本文介绍的实验方案结合了逆转录病毒标记和电生理学方法，用于研究新生齿状回颗粒神经元在成年小鼠大脑中的整合过程。
为确保实验成功，我们建议在实验关键步骤中注意以下事项：
为避免不必要的感染和炎症，所有器械在手术前应进行灭菌处理（通过高压灭菌、其他类型的灭菌设备或70%乙醇）。注射前应用无菌PBS清洗注射器针头的尖端。
进行病毒注射时，动物必须牢固地固定在立体定位仪上，并在注射过程中尽量减少不必要的移动。确保头部固定良好且稳固，并在计算注射坐标前调整小鼠鼻部位置，使前囟和后囟处于同一水平。应迅速将病毒吸入注射器，以尽量减少其暴露于室温环境——逆转录病毒对温度尤其敏感。按照推荐速度缓慢注射病毒，以尽量减少压力造成的损伤。使用推荐的平头注射器（而非常见的斜面针头）&nbsp;可确保齿状回感染区域分布均匀。
在制备脑片之前，切割液和孵育用人工脑脊液（ACSF）必须用95% O2-5% CO2 气体饱和至少30分钟，以确保溶液充分氧合。动物应迅速灌注，并将组织保存在冰冷且氧气饱和的溶液中，以获得最佳的脑片质量。
记录时，逐渐增加刺激强度，直至出现突触后反应。根据需要，在齿状回分子层内调整刺激电极的位置。
总之，推荐的方法为研究成年新生神经元在早期整合到活跃的成熟神经环路过程中所具有的独特特性及潜在功能作用提供了一种途径。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;李&gt;切割液（单位：mM）：110 氯化胆碱，2.5 KCl，1.3 KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，25.0 NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，0.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，7 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;10 葡萄糖，1.3 抗坏血酸钠，0.6 丙酮酸钠，5.0 犬尿烯酸&lt;/li&gt;&lt;李&gt;人工脑脊液（ACSF，单位：mM）：125.0 NaCl，25.0 NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，2.5 KCl，2 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1.3 KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.3 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;1.3 毫摩尔抗坏血酸钠，0.6 毫摩尔丙酮酸钠，10 毫摩尔右旋糖 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;全细胞膜片钳内液（单位：mM）：120 葡萄糖酸钾，15 KCl，4 MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.1 EGTA，10.0 HEPES，4 MgATP，0.3 Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;GTP，7 磷酸肌酸（pH 7.4，300 mOsm）。&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

研究成年出生神经元的整合

Studying the Integration of Adult-born Neurons

在成年哺乳动物大脑中，神经发生终生持续存在于侧脑室的室下区（SVZ）以及海马齿状回的颗粒下区（SGZ）。先前的研究表明，成年海马神经发生与多种脑部疾病相关，包括癫痫、精神分裂症、抑郁症和焦虑症（1）。解析正常与异常的成年新生神经元整合过程，可能有助于阐明这些疾病的病因，并为开发新的治疗方法提供依据。
SGZ 成年神经发生过程与胚胎期及出生后的神经元发育相似，包括命运决定、迁移、突触整合和成熟等阶段。然而，完全整合需要经历一个漫长的6周时期。新生 SGZ 齿状回颗粒细胞（DGCs）最初的突触输入为GABA能性，随后在第14天出现谷氨酸能输入（2）。目前尚不清楚调控齿状回新生神经元环路形成的特定因素。
本实验室采用基于莫洛尼鼠白血病病毒的复制缺陷型逆转录病毒载体，将荧光蛋白和假设的调控基因递送至这些增殖细胞。该病毒技术可对细胞出生时间、谱系、形态以及突触形成进行高特异性和高分辨率的分析。
一个典型的实验通常会使用两种或三种含有独特标记、转基因和启动子元件的病毒，以对特定的发育过程进行单细胞水平的分析 体内以下方案描述了一种利用单一绿色（GFP）或红色（dTomato）荧光蛋白逆转录病毒结合膜片钳电生理技术分析新生神经元功能整合的方法。

本文介绍了一种研究新生齿状回颗粒细胞在成年动物体内整合的方法。该技术利用改造后的逆转录病毒标记新生神经元，随后通过体内电生理记录来确定其功能性整合情况。

成年哺乳动物大脑中的神经发生发生在侧脑室的室下区（SVZ）以及齿状回的颗粒下区（SGZ）……

本实验的总体目标是介绍一种研究成年出生的齿状回颗粒细胞功能整合的方法。首先，通过立体定位法将逆转录病毒注射到成年小鼠的齿状回，以标记新出生的齿状回颗粒细胞。实验的第二步是在特定时间点用冰冷切割液灌注小鼠并取出脑组织。该实验方案的第三步是使用振动切片机制备急性脑切片。第四步是对新生齿状回颗粒细胞进行全细胞膜片钳记录，并刺激急性脑切片的分子层。最终，通过记录和分析新生齿状回颗粒细胞上的诱发性突触后电流，可以获得表明新生神经元功能性和突触整合的结果。该技术的主要优势在于能够对成年动物大脑中的新生神经元进行逆转录病毒标记，并制备成年动物的急性脑切片。该方法有助于回答成年神经发生领域的关键科学问题，例如成年大脑中新生神经元的功能丧失问题。在进行病毒注射前，需从冰箱中取出编码绿色荧光蛋白GFP或红色荧光蛋白DsRed的逆转录病毒，并置于冰上解冻。每只动物注射2 µL逆转录病毒以麻醉4至6周龄的雌性小鼠。通过轻捏脚趾检测麻醉效果，将小鼠固定于立体定位仪上，剃除头部毛发，并用70%乙醇擦拭皮肤。使用手术刀切开皮肤，暴露颅骨。使用直径为0.6毫米的牙科钻头，调整小鼠鼻部位置，使bgma和lambda处于同一水平面。在图示坐标位置通过颅骨钻四个孔。迅速用解冻的逆转录病毒填充一支1微升Hamilton平头注射器。将其置于齿状回区域，在距负2毫米bgma处的一个孔上方，以注射逆转录病毒。将注射器下降至垂直深度2.5毫米处。以每分钟0.25微升的速度注射0.5微升逆转录病毒，以防止液体回流。每次注射后等待两分钟，再缓慢撤出注射器。用无菌 PBS 和涂抹工具短暂冲洗注射器尖端外表面，以去除残留的血液。采用相同方法，向另外三个位于腹侧深度为 2.5 或 3.2 毫米的位点各注射 0.5 微升逆转录病毒。使用无菌外科缝合材料闭合伤口，并将动物放回饲养环境中，直至新生神经元达到所需的成熟时间。21天后，配制必要的溶液以准备切片小鼠脑组织。将切割液置于冰上冷却至0至4摄氏度，并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体持续通气至少30分钟。将人工脑脊液（A CSF）置于室温下，并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体至少饱和30分钟。小鼠冰浴30分钟后，准备冰上预冷的、经氧气饱和的灌流切割液用于心脏灌流。麻醉小鼠后，进行心脏灌流。然后迅速取出脑组织，放入含有切割液和一张滤纸的培养皿中。切除小脑，然后在注射位点前方一到两毫米处进行冠状切面切割，以形成一个平整的表面。用于固定超薄切片。将脑组织粘附到振动切片仪的平台上。将该平台安装至已充满充氧切割液的振动切片仪切割室中。降下刀片，并在振动切片仪上设定切割范围。开始切片组织。沿中线将每个切片切成两半。使用大口径移液管将这些切片转移至含有室温溶液的孵育 chamber 中。温度：用95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和的脑脊液。继续切片直至海马体前部可见。将切片置于32°C水浴中，持续通入气体，孵育30至60分钟。将孵育室重新放回至边缘温度，并在整个记录期间保持该温度。此时切片已准备好用于记录。首先以每分钟约2毫升的速度向记录室灌流32至34摄氏度、经氧气饱和的aCSF。使用大型移液管将脑片转移至记录室中。在脑片上方放置带有尼龙线的U形铂丝，以在低倍镜下固定脑片。辨认齿状回的分子层。然后将刺激电极插入齿状回的分子层。在高倍镜下，通过绿色或红色荧光蛋白标记的表达，在颗粒下层或颗粒层中鉴定新生的齿状回颗粒细胞。通过在微分干涉（DIC）与荧光滤光片之间切换，定位表达 GFP 或 DsRed（D tomato）的新生神经元。选择荧光相对较强且细胞体形态健康的细胞，用于全细胞膜片钳记录。在显微镜高倍物镜下，将一支尖端电阻为 3 至 6 兆欧、充满适当内液的玻璃微电极插入放大器头部支架上的微电极夹持器中。使用显微操作器将微量移液管移至选定的齿状回颗粒细胞，并形成全细胞膜片钳。在电流钳模式下注入一系列电流，记录新生神经元的放电特性。通过刺激电极施加单脉冲或成对脉冲电刺激，并记录诱发出的突触后电流。如果没有记录到突触后反应，将刺激电极移动到分子层的另一个位置，并尝试记录来自新刺激位点的突触后电流。实验结束后，使用钳制拟合（clamp fit）测量新生神经元诱发的突触后反应的幅度。该图显示了成年小鼠齿状回中新生神经元在注射GFP逆转录病毒21天后的GFP表达情况。请注意，新生神经元易于观察，且树突和轴突均被清晰标记。树突是从胞体延伸至齿状回分子层的突起，而轴突在门区和CA3区域也可见。该图显示了成年小鼠注射P-U-X-G-F-P逆转录病毒21天后，对新生齿状回颗粒细胞进行的全细胞电流钳记录。上方的迹线显示了由电流注入引发的动作电位。该图显示了在病毒注射后21天，新生齿状回颗粒细胞中诱发的突触后电流。通过在分子层进行刺激。突触后反应的存在表明，新生神经元在发育后已经整合到现有的神经回路中，并正在接收来自不同起源的ENT的突触输入。该技术为成体神经发生领域的研究人员探索新生神经元在成体大脑中的功能整合铺平了道路。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成人出生的神经元的整合研究

利用在吻侧迁移流中注射表达通道视紫红质2的慢病毒，并结合植入式微型LED进行慢性光刺激，可对嗅球中成年新生神经元进行光遗传学操控。...

选择性病毒感染转导成年出生的嗅觉神经元以实现长期研究 体内 光遗传学刺激

本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。...

成年背根神经节神经元培养体系中的轴突再生遗传学研究

来源： Gómez-Villafuertes, R., et. al., 通过活体成像结合单细胞追踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学特性及谱系进展. J. Vis. Exp. (2017)...

活体成像与单细胞追踪监测成年神经干细胞中的神经谱系

本文描述了调控和分析NF-κB依赖性成年海马神经发生的实验方法。提供了一种详细的实验方案，用于检测小鼠认知功能的齿状回依赖性行为学测试（称为“空间模式分离-巴恩斯迷宫”）。该技术也有助于在其他实验条件下开展相关研究。...

NF-κB依赖性成体神经发生的调控与分析方法

本视频文章展示了一种全面的实验方案，可在同一组织切片中检测并定量成年海马神经发生的各个阶段。我们改进了一种方法，以克服在无法获得来自不同宿主物种的合适抗体时，间接多重免疫荧光技术所存在的局限性。...

使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

在新的脑区中对年轻神经元进行挑战，可以揭示环境如何塑造神经元命运和成熟过程的重要见解。本方案描述了一种从特定脑区分离中间神经元前体细胞，并将其同位或异位移植到出生后幼鼠脑内的实验方法。...

同龄期中间神经元前体细胞移植至出生后早期小鼠大脑

本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。...

检测成年海马神经前体细胞的环路特异性调控

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

本文介绍一种对小鼠齿状回中分离的单个细胞核进行测序的方法，该方法通过荧光激活细胞核分选（FAN-分选）排除大多数神经元。该方法可获得高质量的表达谱，有助于研究该微环境中存在的大多数其他细胞类型，包括数量稀少的细胞群体，如神经干细胞。...

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

在此，我们采用高密度微电极阵列（HD-MEA）深入研究大规模神经元群集的计算动力学，特别是在海马体、嗅球环路以及人类神经元网络中的应用。通过捕捉时空电活动并结合计算工具，可深入了解神经元群集的复杂性。该方法有助于增进对脑功能的理解，并有望为神经系统疾病发现生物标志物和治疗方法。...

在CMOS集成高密度微电极阵列上记录与分析多模态大规模神经元集群动态

现代神经科学需要探索多种物种之间的差异，包括实验啮齿类动物和人类。然而，在涉及大脑较大的哺乳动物时，技术难题随之而来。该方法针对差异较大的哺乳动物中神经元群体的种间变异进行研究，获得可比较的结果，进而绘制出揭示进化模式的图谱。...

一种用于广泛不同哺乳动物大脑中定量细胞计数研究的比较方法

学习利用逆转录病毒标记与全细胞膜片钳电生理技术，研究成年小鼠海马齿状回新生颗粒细胞的功能性突触整合与成熟过程。该方法为神经发生研究提供高分辨率分析手段。

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