高通量微RNA分析:优化复纳升秤定量RT - PCR Fluidigm公司动态ArrayTM国际金融中心
2011年8月3日
在这里，我们描述一个优化的多重逆转录定量PCR（QRT - PCR）结合起来作为一个时间和成本效益高通量的microRNA（miRNA）的表达水平的筛检工具的微流体平台的协议，尤其是当样本数量有限的工作。
该程序的总体目标是通过将多重定量 R-T-P-C-R 与微流控平台相结合，以最少的起始材料高效、廉价地分析 micro RNA 表达。首先浓缩提取的 RNA，然后是多重逆转录和多重预扩增。下一步是纯化掉过量的引物。
最后，使用微流控平台分析单重 micro RNA 表达。结果是目标样品中准确且高度可重现的 micro RNA 表达水平。现有方法的这种技术的主要优点是，EMP 前扩增后的额外纯化步骤提高了多重 Q-R-T-P-C-R 方法的准确性和重现性。
从从血清中提取的 RNA 开始。使用 RNA 纯化试剂盒或基于苯酚氯仿的 RNA 方法从匀浆组织（如三醇）中提取，所有提取后必须进行洗涤步骤，并且所有储存均在零下 80 摄氏度下进行。浓缩 RNA 溶液。
如果从有限量的样品开始，例如先从血清中加入样品，将 MicroCon 样品储液槽插入样品瓶中，然后将 RNA 溶液移液到储液槽中，要非常小心，不要用移液器吸头接触膜。现在将样品瓶和过滤器放入离心机中，使裂缝带朝向转子，然后运行离心约三个小时。三小时后，RNA 将完全集中在膜上以洗脱 RNA。
向膜中加入所需量的游离 RNA 水，倒置储液槽并放入新样品瓶中。然后在 4 摄氏度下以最多 3000 次 G.Store 下 80 摄氏度旋转浓缩的 RNA 旋转 3 分钟，直到需要 使用 xpl 反向茎环引物对 RNA 进行 RT 反应后，然后进行 12 至 18 轮 PCR 循环。microRNA 由 CD NA 链表示。
这称为 PCR 前产物。指的是即将到来的 QPCR。pre PCR 产物需要在 10% 聚丙烯酰胺凝胶上纯化，同时用 10 个碱基配对的 DNA ladder 在每个泳道上加载 5.5 μL 的 6 x 橙色 G 和 27.5 μL 的 pre PCR 产物。
在 150 伏特下运行凝胶 55 至 60 分钟。Romo 酚蓝在 20 个碱基对区域的凝胶上运行。凝胶电泳后，用 Cyber Gold 染色 25 分钟，不要暴露在光线下，并在染色凝胶的摇床上染色。
从 60 至 80 个碱基对中切下 PCR 前产物条带，并将凝胶块转移到标记的试管中。如果产品浓度低，它可能不可见，但仍会存在于凝胶中。现在用管中管离心粉碎凝胶带，并加入 300 微升 TEN 缓冲液。
将缓冲凝胶混合物在 37 摄氏度下搅拌孵育 4 小时。4 小时后，将液体转移到新试管中，再加入 300 μL TEN 缓冲液。将此混合物在 4 摄氏度下搅拌孵育过夜。
第二天，再次转移试管内容物，并对 pre PCR 产物进行乙醇沉淀。从包装中打开芯片时，必须在 24 小时内灌注，然后在灌注后 60 分钟内加载。通过将 150 μL 控制管路液注入芯片上的每个蓄能器中，开始灌注阵列。
小心不要将任何液体溅到芯片或入口上，否则芯片将变得无法使用。然后将芯片放入集成流体电路或 IFC 控制器中，并运行控制器的启动脚本。程序启动后，立即开始准备样品。
首先制备 pres 样品混合粘性人、通用预混液和上样试剂的组合。然后使用 96 孔上样形式，将每个样品的 2.25 微升与 2.75 微升的预样品混合物混合，以收集上样的液体。短暂涡旋并在 4 摄氏度下快速离心板。
样品板现已准备好。现在使用新的 96 孔板制备 13 x 浓度的分析混合物。这是通过每孔混合一个通用引物、正向引物和基因特异性 tac man 探针来完成的。
1 X 浓度为通用引物和正向引物的 1 微摩尔和 tac man 探针的 0.2 微摩尔。然后在 5 微升的最终孔体积中加入足够的补间，使最终浓度为 0.25% 补间。充分混合，避免气泡，并短暂旋转板以收集液体。
这是检测板。通过加载芯片开始 96.96 Q-R-T-P-C-R。首先将样品加载到 IFC 中，然后以每个入口 5 μL 的最终体积进行分析。
其次，运行 load mix 脚本，将样品和检测加载到芯片中。脚本结束后，从加载的芯片上撕下保护膜，并使用胶带去除芯片表面的任何灰尘颗粒或碎屑。现在设置 bio system 扩增程序。
将芯片加载到系统中并运行程序。可以使用 fluid dime 软件分析结果，以提供每个结果的扩增曲线、全芯片热图和 CT 值。Well使用pre PCR产物，在天然聚丙烯酰胺凝胶上通过大小分离纯化，野生型DG CR 8和ER无效突变体。
与以前的方案相比，RNA 的制备方法。由于纯化步骤，DGCR 8 个无效和 ER 无效背景中都会出现更多的 microRNA 和假阳性信号的丢失。此外，改良的 QR TPCR R 方法允许对稀有的 D gcr 8 个独立的 dicer 依赖性小 RNA 进行正确分类。
在这里，筛选了来自患者和对照的 48 个cera 的 384 种不同 microRNAs 的表达变化。通过减去相应的中位数对每个样本的数据进行标准化，并且在对照中不使用加标。观看此视频后，您应该对流感生产线平台上的多重 Q-R-T-P-C-R 如何用于同时分析许多样品中的数百种微粒酶，即使从非常有限的起始量 RNA 开始也是如此。
概述
本文介绍了一个优化的多重逆转录定量PCR（qRT-PCR）协议，集成了微流控平台，旨在高效地分析microRNA（miRNA）表达水平。该方法对于涉及有限样本数量的研究特别有优势。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物技术
- 分子生物学
背景
- MicroRNA在基因调控中扮演着关键角色。
- 传统的miRNA分析方法可能需要大量资源。
- 微流控平台提供高通量能力。
- 优化协议可以提高准确性和重复性。
研究目的
- 开发一种经济高效且节省时间的miRNA表达分析方法。
- 最大限度地减少分析所需的起始材料量。
- 提高qRT-PCR结果的准确性和重复性。
使用的方法
- 从血清样本中提取和浓缩RNA。
- 多重逆转录和miRNA的预扩增。
- 使用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化预PCR产物。
- 利用微流控平台进行高通量qRT-PCR。
主要结果
- miRNA表达水平的准确性和重复性得到提高。
- 成功对样本中的384种不同microRNA进行分析。
- 在突变背景下减少了假阳性信号。
- 改进了稀有小RNA的分类。
结论
- 优化的协议对于高通量miRNA分析有效。
- 该方法可应用于样本有限的研究。
- 未来的应用可能包括在各种生物学环境中更广泛地筛查miRNA分布。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate microRNA profiling is critical for target validation and biomarker discovery in early drug development, particularly when working with limited clinical samples. This optimized multiplex qRT-PCR method on microfluidic platforms enhances data reliability while reducing reagent consumption, supporting cost-effective high-throughput screening. The purification step addresses a key limitation in existing methods, improving confidence in downstream mechanistic and translational decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing accurate miRNA expression data across disease models.
- Operational Value: Reduces false positive signals through primer purification, increasing target validation confidence.
- Predictive Value: Supports categorization of rare small RNAs, aiding in the identification of novel regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows simultaneous profiling of 384 miRNAs, enabling comprehensive biomarker screening campaigns.
- Operational Value: Microfluidic nanoliter format significantly reduces reagent costs and sample input requirements.
- Assay Readiness: Purified pre-PCR products ensure reproducible singleplex detection, improving assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Generates quantitative, normalized miRNA expression data suitable for cross-study comparison and biomarker alignment.
- Preclinical Modeling: Demonstrated utility in mutant backgrounds (DGCR8, DICER) supports validation of disease-relevant systems.
- Risk De-risking: Improved accuracy reduces biological ambiguity in target selection and pathway analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where reliable miRNA expression data informs target prioritization and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation by delivering reproducible miRNA profiles from limited starting material.
- Screening: Enables high-throughput, multiplexed miRNA expression analysis with quantitative CT outputs for hit selection.
- Analytics: Provides normalized expression values (via median subtraction) that allow cross-sample comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Generates biomarker-relevant data applicable to preclinical validation and early clinical correlation.
- Enterprise Reuse: Microfluidic platform compatibility allows reuse across projects, standardizing miRNA profiling workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through accurate, reproducible miRNA quantification.
- Operational Value: Standardization via microfluidic automation and purification-enhanced specificity.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by reducing biological false positives in screening campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets with improved mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, gel-based purification, and microfluidic chip operation.
- Dependent on access to Fluidigm Dynamic Array IFCs and compatible qPCR instrumentation.
- Necessitates standardized protocols for RNA concentration and primer removal across teams.
- Adaptation to alternative model systems requires validation of purification efficiency and miRNA recovery.
- Practical limitation: Gel-based purification step adds hands-on time compared to fully automated methods.
