漂白后荧光标记蛋白的荧光恢复（FRAP）在培养海马神经元的树突棘

该程序的总体目标是通过测量感兴趣区域中蛋白质的 frap 来确定增强的绿色荧光蛋白的迁移率。这是通过首先横切培养的大鼠海马神经元中的 EGFP 载体来实现的。接下来，使用 Zeiss seven 10 共聚焦显微镜在感兴趣的脊柱中进行 Fre 记录。

然后可以使用 Image J 和 GraphPad Prism 软件计算光漂白速率。最终，可以通过共聚焦显微镜获得显示 EGFP 在脊柱中从培养的海马神经元移动的结果。该协议是由 Chazen 与我自己、Ronald Pet 以及 Ya、Wang Bahar Kisha 和原始论文的资深作者 Robert Ol 合作开发的，Robert Ol 于 2009 年 10 月去世。

我们将这段视频献给他。这种方法可以帮助回答蛋白质动力学领域的关键问题，例如感兴趣区域中目标蛋白质的周转率。在开始转染之前，在体外使用 clone tech Cal Foss 哺乳动物转染试剂盒，在涂有 poly de 赖氨酸涂层的 mattec 35 毫米玻璃底培养皿上培养胚胎第 18 天的大鼠海马神经元

将原始培养基保存在无菌 15 毫升试管中以备后用。转染前 30 分钟，用 1.5 mL DOL eco 改良 eagle 培养基填充每个 35 毫米培养皿。接下来，将 10 μg P-E-G-F-P-N one 血浆 DNA 与 12.4 μL 双摩尔钙溶液混合，并用无菌水使总体积达到 100 μL。

将 DNA 混合物滴加到 100 微升的 2 x 堆缓冲盐水中。添加每滴后涡旋缓冲液。让最终混合物在室温下放置 20 分钟后，将缓冲 DNA 溶液添加到 DMEM 孵育的神经元中。

将神经元在 37 摄氏度下孵育一到一个半小时。孵育后，从培养皿中取出含磷酸钙的培养基，并用 DMEM 洗涤细胞。重复 DMEM 洗涤总共 3 次。

在将 DMEM 培养基放回培养箱之前，将其与原始培养基交换。转染后 2 至 4 天，神经元用于压裂实验。首先，立即用 Prewarm Tyro 溶液替换 35 毫米玻璃底培养皿中的培养基。

蔡司 LSM 7 10 共聚焦显微镜用于压裂实验。蔡司温度模块系统保持工作系统的温度、湿度和二氧化碳百分比。确保二氧化碳罐已连接，并且用于平衡湿度的水瓶已装满水。

设置显微镜后，使用 100 x 物镜找到转染的成熟树突。如果培养皿中转染的细胞稀疏，则搜索具有 40 x 物镜的所需细胞。然后切换到 100 x 物镜。

要捕获图像，请使用 5 倍光学变焦和 2 56 x 2 56 像素分辨率。对具有几根刺的短树枝突进行成像。要捕获图像，请使用标称速度 9，这需要 0.5 秒。

要完成扫描，请将针孔设置为两微米以获得强荧光。拍摄图像时，尽量使用低激光透射率，例如 1% 到 5%，以避免整个图像发生光漂白。接下来，选择此实验感兴趣的 spine。

选择刺头直径约为 1 微米的蘑菇刺进行包裹实验。漂白前拍摄 5 张对照图像，然后以标称 100% 激光透射率漂白感兴趣的脊柱 10 次漂白后立即捕获一系列图像。应根据不同的靶向蛋白和不同的实验设计调整时间间隔。

对于此实验，漂白后 15 秒内每秒捕获一次图像。接下来，保存图像以分析数据。使用 Image J 软件打开图像使用对齐工具对齐图像堆栈，以便感兴趣的书脊不会浮动并保持在同一位置。

在图像上测量感兴趣脊柱的相对荧光强度，该脊柱是转染但未漂白的区域。使用图像 J 的强度与时间监控工具测量延时图像中的背景区域，使用非荧光区域作为背景区域曲线，在 GraphPad Prism 软件或其他类似软件中用一相指数方程拟合荧光强度。最后，计算荧光的移动和固定分数百分比。显示。

以下是培养的海马神经元脊柱中 EGFP 荧光的压裂测量。标记了书脊控件和背景的区域，红色箭头表示照片漂白的时间。在照片漂白之前和之后 0、1、5、10 和 15 秒拍摄同一区域的照片。

EGFP 荧光的 FRA 曲线在 15 秒内显示，曲线上的点代表每秒的 FRA。曲线由一相指数方程拟合。光漂白前的平均荧光计数为 100%在本实验中，移动分数为 87%，不固定分数为 13%A。

观看此视频后，您应该对如何使用 FRAPPE 技术测量 A GFP 标记蛋白的迁移率有很好的了解。