Name: 漂白后荧光标记蛋白的荧光恢复（FRAP）在培养海马神经元的树突棘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习使用FRAP技术测量培养海马神经元树突棘中EGFP标记蛋白的流动性。该方法通过共聚焦显微镜定量分析荧光恢复率，揭示突触可塑性相关的蛋白质动态变化机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由国家耳聋及其他沟通障碍研究所（NIDCD）院内项目资助。

1. 神经元转染
<ol>
	<li>在涂有聚-D-赖氨酸的MatTek 35 mm玻璃底培养皿中培养胚胎第18天（E18）的大鼠海马神经元1。体外培养16–18天（DIV）后，使用Clontech CalPhos哺乳动物转染试剂盒对神经元进行转染。首先，在转染前0.5小时，将每35 mm培养皿中的培养基更换为1.5 ml <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">Dulbecco改良Eagle培养基</a>（DMEM）。将原始培养基保存在无菌的15 ml离心管中，以备后续使用（步骤1.6）。</li>
	<li>将10 μg pEGFP-N1质粒DNA与无菌H2O（Clontech）和12.4 μl 2 M氯化钙溶液（Clontech）混合，总体积为100 μl。</li>
	<li>在中等速度涡旋振荡2×HBS的同时，将步骤1.2中的混合液逐滴加入100 μl 2×HBS中。</li>
	<li>室温静置混合物20分钟，然后将步骤1.3所得终混合液加入含DMEM的神经元培养物中。</li>
	<li>将神经元放回37 °C培养箱中孵育1–1.5小时。</li>
	<li>移除含磷酸钙的培养基，用DMEM洗涤细胞三次。在将培养皿放回培养箱前，将DMEM更换为之前保存的原始培养基。</li>
</ol>
2. 树突棘上的FRAP实验
<ol>
	<li>转染后两到四天使用神经元进行荧光漂白恢复（FRAP）实验。</li>
	<li>用预热的Tyrode溶液替换35 mm玻璃底培养皿中的培养基，该溶液含有（单位为 mM）NaCl 145、KCl 5、HEPES 10、葡萄糖 10、甘氨酸 0.005、CaCl2 2.6 和 MgCl2 1.3（用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。</li>
	<li>FRAP实验使用蔡司LSM 710共聚焦显微镜。使用蔡司TempModule系统控制工作环境的温度（37°C）、湿度和CO2浓度（5%）。确保CO2气罐已连接，并且用于调节湿度的水瓶已加满水。</li>
	<li>使用100×物镜（αplan-APOCHROMAT 100×/1.46 油镜）寻找已转染的成熟树突。如果培养皿中转染的细胞较稀疏，可先用40×物镜（plan-NEOFLUAR 40×/1.3 油镜）寻找目标细胞，然后切换至100×物镜进行成像。</li>
	<li>使用5倍光学放大和256×256像素分辨率对包含多个树突棘的一段短树突进行成像。图像采集时采用标称速度9（像素驻留时间为3.15 μsec），完成一次扫描需0.5秒。将针孔设为2 μm以获得较强的荧光信号。成像时应尽量使用较低的激光透射率（例如1–5%），以避免整个图像发生光漂白。</li>
	<li>选择感兴趣的树突棘。在本实验中，我们选择头部直径约为1 μm的蘑菇状树突棘。</li>
	<li>进行FRAP实验时，先采集5张漂白前的对照图像，然后以100%标称激光透射率对目标树突棘进行10次漂白[氩离子激光功率为30 mW，其中488 nm激光线占50%（15 mW），经488 nm激光线到达显微镜的功率约为3–4 mW]，漂白后立即连续采集一系列图像。本实验中，漂白后每1秒采集一次图像，持续15秒。时间间隔应根据不同的靶蛋白和实验设计进行调整（图1）。</li>
	<li>保存图像。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>使用 ImageJ 软件打开图像。</li>
	<li>在 ImageJ 中使用对齐工具（“插件” →“堆栈-混洗” →“对齐堆栈中的切片” →“平移”和/或“刚体”）对图像堆栈进行对齐，使目标树突棘保持在图像中的同一位置，不发生漂移。</li>
	<li>使用 ImageJ 的“强度随时间变化监测”工具（“插件” →“堆栈-混洗” →“强度随时间变化监测”），在时间序列图像中测量目标树突棘的相对荧光强度（Fs）、一个转染但未漂白的区域（对照）以及一个背景区域（Fb）的荧光强度。对照区域可选择一段清晰对焦的远端树突，背景区域应为无荧光信号的区域。</li>
	<li>通过比较对照区域在光漂白前（Fc0）和光漂白后（Fc）的荧光强度，计算光漂白速率（r）： 
	r = Fc/Fc0。</li>
	<li>按以下方式对目标树突棘的荧光强度（F）进行归一化处理： 
	F = (Fs - Fb) / r。</li>
	<li>使用 Graphpad Prism 软件（图 2）或其他类似软件，将目标树突棘的荧光强度数据拟合为单相指数方程曲线。</li>
	<li>通过以下公式计算可移动组分比例（fm）和不可移动组分比例（fi）： 
	fm = F∞/ F0, 
	其中 F∞ 为完全恢复后的荧光强度，F0 为光漂白前的荧光强度。 
	fi = 1 - fm。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
在本研究中，我们对成熟的海马神经元进行荧光漂白恢复（FRAP）实验。在体外培养18-22天时，蘑菇状树突棘已经形成。利用我们的方法，可以记录树突棘等微小区域中荧光强度的动态变化。
为分析EGFP的荧光恢复过程，我们在光漂白前采集5张图像作为对照，光漂白后立即每1秒采集1张图像，持续15秒。图像分辨率足以进行定量分析。标记荧光蛋白的荧光恢复曲线具有高度可重复性。
我们还简要展示了如何使用 ImageJ 和 Graphpad Prism 软件来定义荧光蛋白的可移动组分和不可移动组分。本文展示的 FRAP 方法及分析可广泛应用于神经科学、细胞生物学及其他相关研究领域。
<img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="时间推移荧光显微镜图像，显示每隔15秒的动态细胞过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 培养的海马神经元树突棘中EGFP荧光的FRAP测量结果。红色箭头指示光漂白的时间点。照片显示光漂白前（Pre）以及光漂白后0、5、10、15秒同一区域的图像。树突棘区域、对照区域和背景区域分别用字母S、C和B标记。实验期间神经元保持在37°C。比例尺，1 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="显示荧光随时间恢复的FRAP分析图，包含归一化数据与原始数据的比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. EGFP荧光在15秒内的FRAP曲线。绿色线条表示原始曲线；红色线条表示归一化曲线。曲线上的点表示每1秒采集一次的FRAP数据。曲线通过单相指数方程进行拟合。光漂白前的平均荧光强度计为100%。本实验中，可移动组分（MF）为94%，不可移动组分（IF）为6%。

<ol><li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li>
<li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins%3A+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca%282%2B%29-ATPase+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li>
<li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+binding%3A+proper+and+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

FRAP 分析已被广泛使用 体内 和 体外1-2研究中。该技术通常使用 GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Fusion 
protein">融合蛋白</a>，尽管也可使用红藻融合蛋白3该分析方法具有高灵敏度，可用于表征GFP标记蛋白的迁移特性。
为了获得有意义的FRAP分析结果，在FRAP实验之前和过程中应避免不必要的光漂白。实现这一点有两种方法。首先，寻找和观察目标神经元的过程应尽可能迅速。特别是，长时间使用100倍物镜观察神经元会显著导致荧光漂白。其次，高激光功率和频繁扫描往往会增加光漂白的可能性。因此，有必要在对照区域计算光漂白速率，然后对实验区域的FRAP曲线进行归一化处理。该归一化方法已在实验方案中描述（详见步骤3.3–3.5）。
光漂白步骤对于获得良好的FRAP结果也至关重要。在本实验中，我们在100%激光透射率下对目标树突棘进行10次光漂白。该条件足以将固定样品中树突棘的荧光漂白至背景水平。因此，我们将光漂白后0秒时的荧光强度设定为与背景相同的数值。根据首次扫描速度的不同，若目标蛋白具有高度流动性，则可能在光漂白后立即检测到显著的荧光恢复。
已开发出多种荧光蛋白探针，用于通过荧光漂白后恢复技术（FRAP）研究蛋白质动态。一种互补的方法是使用光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）或光转换变体。结合FRAP技术，这些工具在活细胞成像研究中正变得不可或缺4-6。

<table><tbody><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿 </td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>CalPhos 哺乳动物转染试剂盒</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 质粒</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td></td></tr><tr><td>蔡司共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 TempModule 系统</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

培养的海马神经元树突棘中荧光标记蛋白的光漂白后荧光恢复（frap）

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP 已被用于量化 GFP 标记蛋白的移动性。通过使用强激发激光，使目标区域内的 GFP 标记蛋白荧光发生淬灭。当区域外未淬灭的 GFP 标记蛋白扩散进入目标区域时，该区域的荧光随之恢复。通过测量荧光恢复速率，可分析蛋白的移动性。该技术可用于表征蛋白的移动性和周转速率。
在本研究中，我们在培养的海马神经元中表达（增强型绿色荧光蛋白）EGFP 载体。使用蔡司 710 共聚焦显微镜，我们对单个树突棘中的 GFP 蛋白荧光信号进行光漂白，随后采集时间序列图像以记录光漂白后的荧光恢复情况。最后，通过 ImageJ 和 Graphpad 软件分析成像数据，估算出树突棘中 GFP 可移动组分和不可移动组分的百分比。
本FRAP实验方案展示了如何进行基本的FRAP实验以及如何分析数据。

FRAP 已被用于定量培养细胞中绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白的移动性。我们通过分析光漂白后荧光恢复的百分比，来检测 GFP 的可移动组分与不可移动组分。在本研究中，FRAP 实验在海马神经元的树突棘上进行。

培养的海马神经元树突棘中荧光标记蛋白的光漂白后荧光恢复（FRAP）

FRAP 已被用于量化 GFP 标记蛋白的移动性。通过使用强激发激光，GFP 标记蛋白的荧光被漂白……

本实验的总体目标是通过测量特定区域中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的荧光漂白后恢复（FRAP），来确定该蛋白的移动性。首先将EGFP载体转染至培养的大鼠海马神经元中，随后使用蔡司Seven 10共聚焦显微镜对目标树突棘进行FRAP记录。然后可以使用 Image J 和 GraphPad Prism 软件计算光漂白速率。最终可通过共聚焦显微镜获得结果显示培养的海马神经元树突棘中 EGFP 的移动性。本实验方案由 Chazen 与本人 Ronald Pet，以及 Ya、Wang Bahar Kisha 和原始论文的资深作者 Robert Ol 共同开发，Robert Ol 于 2009 年 10 月去世。我们将本视频献以纪念他。该方法有助于解答蛋白质动力学领域的关键问题，例如特定蛋白质在特定区域内的周转速率。首先，在体外培养16至18天的胚胎第18天大鼠海马神经元，使用多聚赖氨酸包被的MatTek 35毫米玻璃底培养皿。在开始转染前，使用CloneTech CalFectin哺乳动物转染试剂盒对神经元进行转染。将原始培养基保存在无菌的15毫升离心管中以备后续使用。在转染前30分钟，向每个35毫米培养皿中加入1.5毫升DOL eco's改良伊格尔培养基。接着，将10微克P-E-G-F-P-N质粒DNA与12.4微升2摩尔钙溶液混合，并用无菌水将总体积补至100微升。将DNA混合物逐滴加入100微升的2倍Heaps缓冲盐水中。每加一滴后涡旋振荡缓冲液。最终混合物在室温下静置20分钟后，将缓冲液-DNA溶液加入DMEM培养的神经元中。将神经元在 37 摄氏度下孵育一至一个半小时。孵育结束后，从培养皿中移除含磷酸钙的培养基，并用 DMEM 洗涤细胞。重复 DMEM 洗涤，共洗涤三次。将 DMEM 培养基更换为原始培养基，然后将其放回培养箱。转染后 2 至 4 天使用神经元进行断裂实验。开始时，立即用预热的 Tyro 溶液替换 35 毫米玻璃底培养皿中的培养基。使用蔡司 LSM seven 10 共聚焦显微镜进行光漂白实验。蔡司温控模块系统用于维持工作系统的温度、湿度和二氧化碳浓度。请确保二氧化碳气罐已连接，并且用于调节湿度的水瓶已加满水。显微镜设置完成后，使用100倍物镜寻找已转染的成熟树突。如果培养皿中转染的细胞较为稀疏，可先用40倍物镜寻找目标细胞，然后切换至100倍物镜。成像时使用5倍光学变焦和256 × 256像素分辨率，以获取包含多个树突棘的短段树突图像。采集图像时采用标称速度9，耗时0.5秒。完成扫描时，将针孔设为两微米以获得强烈的荧光信号。拍摄图像时，尽量使用低激光透射率，例如1%至5%，以避免整个图像发生光漂白。接下来，选择本实验感兴趣的树突棘。选择树突棘头直径约为一微米的蘑菇状树突棘进行包裹实验。在漂白前采集五张对照图像，然后以标称100%激光透射率对目标树突棘进行10次漂白，并在漂白后立即连续采集一系列图像。时间间隔应根据不同的靶向蛋白和不同的实验设计进行调整。在本实验中，漂白后每隔1秒采集一次图像，持续15秒。随后保存图像以进行数据分析。使用Image J软件打开图像，并利用对齐工具对图像序列进行对齐，以确保目标树突棘位置固定，不发生漂移。在图像中测量所关注树突棘的相对荧光强度，该区域为转染但未经漂白的区域。使用ImageJ中的“强度随时间变化监测工具”在时间序列图像中测量背景区域。选择一个无荧光信号的区域作为背景区域，然后在GraphPad Prism软件或其他类似软件中，采用单相指数方程对荧光强度进行曲线拟合。最后，计算荧光的可移动组分和不可移动组分的百分比。结果如图所示。以下是培养的海马神经元树突棘中EGFP荧光的光漂白后荧光恢复（frack）测量结果。图中标出了树突棘的对照区域和背景区域，红色箭头指示光漂白发生的时间点。在光漂白前以及光漂白后0、1、5、10和15秒，对同一区域进行了拍照记录。EGFP荧光的FRA曲线显示了15秒时间内的变化，曲线上各点代表每秒的FRA值。曲线通过单相指数方程进行拟合。光漂白前的平均荧光强度计为100%。本实验中，可移动组分为87%，不可移动组分为13%A。观看本视频后，您应该能够充分理解如何利用 FRAPPE 技术测量一种 GFP 标记蛋白的迁移率。

fluorescence-recovery-after-photobleaching-frap-fluorescence-tagged

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

漂白后荧光标记蛋白的荧光恢复（FRAP）在培养海马神经元的树突棘

本文将介绍利用多光子荧光漂白后恢复技术测量扩散系数的实验步骤。我们将首先沿光路对样品进行激光校准，并确定合适的实验参数，随后生成荧光恢复曲线并进行拟合分析。...

通过双光子荧光漂白后恢复法测量扩散系数

我们介绍了光漂白方法，包括光漂白后荧光恢复（FRAP）和光漂白过程中的荧光丢失（FLIP），用于监测胚胎干细胞（ES细胞）中染色质蛋白的动力学。染色质蛋白动力学被认为是研究染色质可塑性的手段之一，在多能性细胞中其活性增强。...

活体胚胎干细胞中染色质蛋白动态的光漂白实验（FRAP与FLIP）测定

最近的多项研究已发现与脑部病理相关的突触蛋白存在突变。原代培养的皮层神经元为研究这些致病相关蛋白对树突棘形态和运动性的影响提供了极大的灵活性。...

培养的中枢神经系统神经元中树突棘形态的分析

本报告介绍了利用活细胞成像和光漂白技术，研究在神经元质膜上外源性表达的、pH敏感型GFP标记蛋白的表面表达、转运途径及运输动力学。...

利用荧光恢复与荧光丢失光漂白技术评估培养神经元中膜蛋白的侧向扩散与胞吐作用

我们介绍了使用苯乙烯基FM染料对功能性神经末梢中的突触囊泡循环进行成像的方法。该方案不仅适用于诱发性突触活动，还可用于自发性和微小突触活动的检测。本方案拓展了可有效评估的突触事件类型。<br...

利用FM染料检测诱发性、自发性和微小突触活动期间的突触囊泡再循环

通过将突触小泡蛋白与pHluorin融合后的光学显微镜检测以及突触小泡摄取的电子显微镜观察，可检测突触小泡的内吞作用。...

在培养的海马神经元中测量突触囊泡内吞作用

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

生物样本的背景自发荧光常常使基于荧光的成像技术复杂化，尤其是在老年个体的终末分化组织中尤为明显。本方案描述了如何利用市售的发光二极管光源，在免疫染色前对样本进行光漂白，从而有效去除这些样本中的自发荧光。...

简单去除福尔马林固定人脑组织中背景荧光以进行免疫荧光显微镜检测

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

我们描述了一种针对活细胞进行光漂白后荧光恢复实验的全面且实用的方案。尽管该方案曾用于测量黄色荧光蛋白标记的p62在类聚集小体诱导结构中的迁移性，但它可适用于多种显微镜系统和荧光蛋白。...

光漂白后黄色荧光蛋白标记的p62在类聚集小体诱导结构中的荧光恢复

学习使用FRAP技术测量培养海马神经元树突棘中EGFP标记蛋白的流动性。该方法通过共聚焦显微镜定量分析荧光恢复率，揭示突触可塑性相关的蛋白质动态变化机制。

培养的海马神经元树突棘中荧光标记蛋白的光漂白后荧光恢复（FRAP）

探索更多视频