Name: 在发展中国家斑马鱼的前脑的神经祖细胞克隆相关的定时实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 了解电穿孔结合共聚焦显微技术对斑马鱼前脑神经祖细胞进行活体实时成像的方法。该技术可在单细胞水平动态观察神经祖细胞的体内发育过程，为神经发育研究提供重要工具。

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本工作由NIH基金NS042626资助。我们感谢Kurt Thorn和加州大学旧金山分校尼康影像中心在成像方面的协助。

1. 斑马鱼胚胎的制备
<ol>
 <li>电穿孔前两天，使用隔板将野生型鱼按性别分开，设置交配笼。</li>
 <li>电穿孔前一天，取出交配笼中前一日放置的隔板。</li>
 <li>收集胚胎，将50个受精胚胎置于30 ml含0.003%苯硫脲（PTU）的胚胎培养基中培养，于 28.5°C.</li>
 <li>电穿孔当天，当胚胎发育至22小时（22 hpf）时，使用精细镊子（Inox 5，Dumont Electronic，瑞士）手动去除胚胎的绒毛膜。随后将胚胎转移至10 ml电穿孔林格液中3 （180 mM NaCl，5 mM KCl，1.8 mM CaCl₂，5 mM Hepes pH 7.2）含 0.003% PTU。</li>
 <li>添加 420 μl 将三卡因储备液（4 mg/ml）加入10 ml电穿孔林格液中，以麻醉胚胎。</li>
</ol>
2. 电穿孔的准备
<ol>
 <li>使用 Sutter Instruments（美国加利福尼亚州诺瓦托）的 Flaming-Brown P897 拉针仪，从毛细管（外径 1.2 mm，内径 0.9 mm，带纤维）上拉制玻璃注射针。用镊子折断针尖，以获得如图 1D 所示的尖锐末端。针尖直径应约为 10 μm，锥角应约为 30 度。</li>
 <li>在电穿孔林格溶液中配制 0.8% 和 1% 的低熔点琼脂糖（Shelton Scientific, Inc. 货号 #IB70050）。将琼脂糖溶液分装至 2 ml 微离心管中，并置于约 37°C 的加热块中保温。</li>
 <li>使用 Gal4/UAS 系统驱动电穿孔胚胎中神经前体细胞的基因表达。使用两种质粒：质粒 EF1α-GFF-PT2KXIG，其中 Gal4FF 由普遍性启动子 EF1α 驱动；以及质粒 UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG。</li>
 <li>使用 GenEluteTM HP 质粒中量提取试剂盒（Sigma）制备 EF1α-GFF-PT2KXIG 和 UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG 质粒 DNA。</li>
 <li>随后通过乙酸钠/乙醇沉淀法将质粒浓缩至最终浓度为 1–2 μg/μl（溶于 10 mM Tris·Cl，pH 8.5）。</li>
 <li>将两种质粒等量混合，并用无核酸酶的 H2O 稀释至每种质粒终浓度为 500 ng/μl。建议向溶液中加入酚红（总体积的 1/10 稀释液），以便观察递送过程。将 DNA 溶液置于冰上保存。</li>
 <li>在电穿孔前，用 2 μl DNA 溶液反向装填注射针，并调节注射体积至 2 nl。</li>
</ol>
3. 电穿孔
<ol>
 <li>按照图1A所示设置体视解剖显微镜（Zeiss Stemi 2000，最大放大倍数为50倍）、气压注射仪（Narishige IM 300 微注射仪）、两个显微操作器（WPI M3301R，World Precision Instruments，Sarasota，FL，USA）以及电刺激器（SD9方波脉冲刺激器，Grass Tlefactor，West Warwick，Rhode Island，USA）。</li>
 <li>为固定胚胎，将2个胚胎浸入1%低熔点琼脂糖中，随后立即用玻璃移液管将胚胎从琼脂糖中取出。</li>
 <li>将胚胎分别置于倒置的塑料培养皿盖上的独立琼脂糖液滴中。在琼脂糖凝固前，用纤维探针轻轻调整胚胎方向，使其背侧朝上，以便电极和微注射针能够接触到前脑（见图1B）。每个胚胎必须单独固定在独立的琼脂糖液滴中。</li>
 <li>使用左侧显微操作器操控电极。按图1B所示将电极插入琼脂糖中。电穿孔使用定制的直径为125 μm、间距为500 μm的铂铱平行双极电极（FHC，目录号#PBSA0575）。</li>
 <li>将微注射针插入前脑脑室，并注入4 nl DNA混合物，此时可观察到红色液体流动以及脑室膨胀。</li>
 <li>立即手动施加一个持续1毫秒、电压为28.5 V的脉冲，随后反转极性，再施加一个相同参数的脉冲。该过程可实现前脑神经前体细胞的双侧嵌合标记。</li>
 <li>完成10个胚胎的电穿孔后，加入5 ml胚胎培养基覆盖胚胎，并用显微外科刀剥离琼脂糖以释放胚胎。</li>
 <li>将电穿孔后的胚胎转移至含有30 ml胚胎培养基的新培养皿中，培养基中含0.003% PTU，并在28.5°C下孵育。</li>
</ol>
4. 样品固定与活细胞延时成像
<ol>
 <li>电穿孔后约4小时，在落射荧光体视显微镜下可观察到EGFP信号。</li>
 <li>电穿孔5小时后，挑选前脑区域EGFP表达强烈但呈高度嵌合分布的胚胎。</li>
 <li>将选中的胚胎转移至含有0.003% PTU的10 ml胚胎培养液中。</li>
 <li>向10 ml胚胎培养液中加入420 μl三卡因原液（4 mg/ml），以麻醉胚胎。</li>
 <li>为固定胚胎，将1个胚胎浸入0.8%低熔点琼脂糖中，随后立即用玻璃移液器将胚胎从琼脂糖中取出，并将其置于35 mm玻璃底培养皿中央（MatTek公司，货号：P35GC-1.5-10-C，<a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass-bottom-dishes.com</a>）。</li>
 <li>在琼脂糖凝固前，用纤维探针轻轻调整胚胎方向，使其背侧朝上。</li>
 <li>将培养皿正确放置于共聚焦显微镜的温控载物台上（如图1C所示，我们使用尼康C1光谱共聚焦显微镜，配备直立物镜），并将温度调节至28.5°C。</li>
 <li>加入3 ml预热至28.5°C、含0.003% PTU的胚胎培养液，以覆盖胚胎。此时胚胎已准备好进行成像。</li>
 <li>使用水浸物镜，以固定时间间隔进行延时活体成像。</li>
</ol>
5. 典型结果
图2显示了在22 hpf时对胚胎进行EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP电穿孔后，通过延时共聚焦活体成像获得的部分帧图像。
<img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="用于光学激发测量的显微镜装置；包括控制单元、显微镜和探测器。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 实验装置示意图。（A）电穿孔设备的组装：Grass SD9 方波脉冲刺激器（i）、左侧显微操作器（ii）、电极（iii）、Zeiss 解剖显微镜（iv）、注射针头（v）、右侧显微操作器（vi）以及 Narishige IM 300 显微注射仪（vii）。（B）电极（i）、前脑脑室（ii）和注射针头（iii）之间的相对位置。注意已将红色的DNA溶液注入前脑脑室。（C）Nikon C1 共聚焦显微镜活体成像系统的组装：温度控制器（i）、水浸物镜（ii）以及嵌于玻璃底培养皿中低熔点琼脂糖内的电穿孔胚胎（iii）。（D）用于DNA显微注射的拉制并切割后的针头图像。
<img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="细胞分裂荧光显微镜序列，显示随时间变化的细胞核分裂阶段。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 对在22 hpf时通过EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP进行胚胎电穿孔后，进行18小时延时共聚焦活体成像所选取的图像帧。每个图像帧的底部为脑室表面。比例尺表示10 μm。

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本视频中，我们演示了一种在斑马鱼前脑发育过程中以克隆水平对神经前体细胞进行延时活体成像的方法。我们测试并改进了现有的电穿孔方案4-6，以实现对单个神经前体细胞进行遗传和荧光标记。由于仅使用相对较低的电穿孔电压，使少数细胞被稀疏标记，因此可以构建由克隆相关子代细胞组成的谱系树。除了EGFP外，通过将EGFP替换为其他荧光标记物，即可简单地实现神经前体细胞的亚细胞结构标记。例如，若将EF1α-GFF与UAS-E1B-膜-EGFP和UAS-E1B-H2B-mRFP共电穿孔，则单个前体细胞的细胞膜将被绿色荧光蛋白标记，而细胞核将被红色荧光蛋白标记。大多数被标记的前体细胞均保持健康状态，这由电穿孔胚胎整体发育正常以及活体成像过程中观察到的极少凋亡现象所证实。此外，使用低浓度琼脂糖固定胚胎，并在共聚焦活体成像过程中采用最低限度的激光功率，对于维持细胞健康也至关重要。该技术还可应用于中枢神经系统的其他区域，如后脑和脊髓。然而，该技术不能用于18小时后受精（hpf）之前的胚胎，因为DNA构建体必须被注射至脑室中才能进行电穿孔。

延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

神经前体细胞分裂、迁移和分化的精确模式对大脑的正常发育与功能至关重要1,2. 为了理解神经前体细胞在复杂环境中的行为 体内 环境，对完整大脑中神经前体细胞进行延时活体成像至关重要。在本视频中，我们利用斑马鱼胚胎的独特优势，可视化前脑神经前体细胞的发育过程 体内我们采用电穿孔技术对单个神经前体细胞进行稀疏的遗传标记。简言之，将编码荧光标记物的DNA质粒注射至受精后22小时（hpf）的斑马鱼胚胎前脑脑室中，随即施加电脉冲。6小时后，将电穿孔后的斑马鱼胚胎置于玻璃底培养皿中，用低熔点琼脂糖固定。随后，使用共聚焦显微镜配合水浸物镜，以固定时间间隔对荧光标记的神经前体细胞进行持续36小时的活体成像。该方法为研究神经前体细胞的动态行为提供了有效途径。 体内 前脑神经前体细胞的发育，并可应用于斑马鱼胚胎中枢神经系统的其他部分。

本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。

神经前体细胞分裂、迁移和分化的精确模式对大脑的正常发育与功能至关重要1,2。为了……

以下实验的目的是通过斑马鱼胚胎的延时活体成像，观察前脑单个神经前体细胞在体内的发育过程。该目标通过电穿孔导入编码荧光标记物的DNA构建体实现，从而稀疏地标记四个脑部神经前体细胞。电穿孔后的胚胎经麻醉处理，固定于低熔点琼脂糖中，并通过延时共聚焦显微镜进行成像。结果展示了特定前脑神经前体细胞在体内的发育过程。该方法可为前脑神经前体细胞在体内的发育提供见解，也可应用于中枢神经系统的其他区域，如脑膜、脑和脊髓。该方法相较于现有方法（例如单细胞阶段的 DNA 或 RNA 显微注射）的主要优势在于，能够在任意指定的发育时间点精确地靶向特定组织或自身感兴趣区域。本实验方案从计划进行电穿孔的前一天开始。在早晨，从交配后的斑马鱼中收集 50 枚受精胚胎，将胚胎置于含有苯硫脲（PTU）的胚胎培养基中，于 28.5 摄氏度下将浸没的胚胎孵育 22 小时，次日继续后续操作。受精后22小时，胚胎已准备好进行电穿孔。首先用精细镊子手动将胚胎镀膜。将镀膜后的胚胎转移至含有PTU的10毫升电穿孔林格液中，以麻醉胚胎。向溶液中加入420微升浓度为4毫克/毫升的Trica储备液。胚胎现已准备好进行电穿孔。为准备电穿孔所需的注射针，需拉制玻璃毛细管，并用镊子折断其尖端，以形成尖锐的0.2低熔点末端。还需要准备农杆菌溶液，包括含有1%电穿孔林格液的悬浮液，以及用于样品固定的0.8%胚胎培养基溶液。将两种不同的农杆菌溶液分别分装至2毫升微量离心管中，并置于约37摄氏度的加热块中预热备用。本实验方案采用GAL4-UAS系统驱动神经前体细胞中的基因表达。使用两种质粒，一种在全身性表达GAL4 ff，另一种在响应GAL4 ff时表达GFP。两种质粒均通过试剂盒制备，并使用乙酸钠-乙醇沉淀法在10毫摩尔Tris-Cl溶液中浓缩至每微升1至2微克。测定质粒浓度后，用无核酸酶水将两种质粒稀释成单一溶液，浓度为每微升500纳克。在此浓度下，将它们合并以观察溶液的递送情况，并加入占总体积10%的酚红进行染色。溶液现已准备好用于电穿孔，应置于冰上。电穿孔装置包括一台最大放大倍数为50 ×的体视解剖显微镜。该装置配备有气压注射器、两个显微操作器和一个电刺激器。左侧显微操作器上的电极装有定制的铂铱平行双极电极。电穿孔前，用两微升DNA溶液回装注射针，并将注射体积调整为四纳升。自此之后，该实验方案需要经过练习才能熟练掌握：将胚胎浸入1%低熔点琼脂糖溶液中，立即取出两个胚胎。用玻璃移液管将每个胚胎转移至平台或培养皿中各自的琼脂糖液滴内。在琼脂糖凝固前，使用纤维探针轻轻将胚胎调整为背侧向上的位置。这将使前脑易于接触电极和显微注射针。重复此过程，直到所有10个液滴中均加载了准备好的全部胚胎。将电极插入气室，并将显微注射针插入前脑室。现在注入4纳升的DNA混合物。注意观察液体流动，并留意脑室是否出现膨胀。一旦观察到膨胀现象，立即施加两组共4次、每次持续1毫秒的27.5伏特脉冲刺激，且这4次脉冲需以相反极性递送。结果是大脑四个神经前体细胞呈现双侧马赛克标记。现在将注射针从前脑移开，移动载物台至下一个胚胎。对每个剩余的胚胎重复注射和电穿孔操作。将全部10个胚胎电穿孔后，倒入5毫升胚胎培养液以转移胚胎。用显微手术刀剥离绒毛膜，并将胚胎移至含有30毫升胚胎培养液的新培养皿中。电穿孔后约4小时，在成像前将胚胎于28.5摄氏度下孵育约4小时。可观察到EGFP信号。若在电穿孔后一小时或五小时，在落射荧光解剖显微镜下观察，应选择在脑部四个区域呈现高度嵌合但强EGFP表达的胚胎。将选中的胚胎转移至10毫升培养基中，并加入420微升浓度为4毫克/毫升的三卡溶液进行麻醉。成像将在配备直立物镜的共聚焦显微镜的温度控制载物台上进行。将载物台温度设定为28.5摄氏度以准备显微镜，并将胚胎培养基预热至28.5摄氏度。为固定胚胎，使用玻璃移液管将其短暂浸入琼脂糖中，然后放置在35毫米玻璃底培养皿的中央。在琼脂凝固之前，使用光纤探针轻轻将胚胎调整为背侧向上的位置，并加入3毫升预热的培养基覆盖胚胎。此时胚胎已准备好进行固定时间间隔的活体延时成像，此处显示的是一个神经前体细胞的延时共聚焦图像。利用该方法，我们可以在受精后28.5至41.5小时之间观察到该细胞迁移并分裂两次。通过尽量降低激光功率并定期更换胚胎培养基，可在受精后长达60小时内持续采集图像。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对基因标记的神经前体细胞进行电穿孔并进行活体成像，以及如何处理电穿孔后的胚胎。对于共聚焦时间序列成像，一旦掌握要领，若操作得当，该电穿孔过程可在一小时以内完成。

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