Name: 手指棒运动诱导淋巴细胞凋亡的测定血液抽样方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 学习使用手指采血快速检测运动诱导的淋巴细胞凋亡方法。该流程结合流式细胞术分析免疫细胞凋亡，为运动免疫学研究提供准确可靠的实验技术。

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本研究得到了西肯塔基大学教师奖学金委员会新进教师资助项目的支持。

1. 指尖采血取样
<ol>
<li>全血采集通常在静息状态下进行，以获得基线测量值（一般在静坐休息10-15分钟后），并在运动过程中或运动结束后立即采样，以及在运动后阶段持续采样（通常为运动停止后1-3小时内）。</li>
<li>按照通用预防措施，首先使用70%异丙醇对指尖进行消毒。</li>
<li>接着，使用自动采血针或类似装置穿刺采血部位。尽管我们采用30号采血针以提高受试者的舒适度，但也可使用更大规格的针头。</li>
<li>弃去第一滴血液，随后将血液收集至毛细管或含锂肝素抗凝剂的微量采血管中，以防止血液凝固。</li>
</ol>
2. 细胞表型分析与凋亡染色
<ol>
<li>在250 μL结合缓冲液中加入10 μL肝素抗凝全血至已滴定的抗体组合（见表1示意图）。我们曾成功使用1:20的稀释比例，但各实验室应自行滴定试剂以确定最佳工作浓度。 
表1. 用于检测运动诱导的白细胞亚群凋亡的抗体组合。早期凋亡通过Annexin V的表达来定义，晚期凋亡通过Annexin V与7-AAD双阳性标记来定义。坏死细胞仅指Annexin V阴性而7-AAD阳性的细胞。 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>第1管</td>
 <td>第2管</td>
 <td>第3管</td>
 <td>第4管</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>仅细胞对照管</td>
 <td>Annexin V - FITC</td>
 <td>Annexin V - FITC</td>
 <td>Annexin V - FITC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>抗人CD4 - PE</td>
 <td>抗人CD8 - PE</td>
 <td>抗人CD19 - PE</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7-AAD</td>
 <td>7-AAD</td>
 <td>7-AAD</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>抗人CD45RA - APC</td>
 <td>抗人CD45RA - APC</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
7-AAD = 7-氨基放线菌素D，APC = 别藻蓝蛋白，CD4 = 辅助性T淋巴细胞，CD8 = 抑制性/细胞毒性T淋巴细胞，CD19 = B淋巴细胞，CD45RA = 初始型细胞亚群，FITC = 异硫氰酸荧光素，PE = 藻红蛋白。</li>
<li>室温避光孵育30分钟。</li>
<li>以1075 × g离心5–10分钟。</li>
<li>弃上清，加入300 μL红细胞裂解缓冲液，并充分涡旋混匀。</li>
<li>室温孵育15分钟。</li>
<li>加入300 μL PBS以终止红细胞裂解反应。</li>
<li>以1075 × g离心5–10分钟。</li>
<li>弃上清，将离心管置于试管架上，加入50 μL结合缓冲液。</li>
<li>通过流式细胞术进行分析。</li>
</ol>
建议至少使用以下对照：一个仅含细胞的管作为阴性对照，用于检测背景自发荧光；以及含有每种单独荧光染料的管，用于在流式细胞仪初始设置时调节补偿。此外，我们已成功使用补偿校准微珠来建立实验条件。

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本研究展示了一种微创样本采集方法及其后续分析技术，可用于检测运动诱导的淋巴细胞凋亡的早期和晚期阶段。该方法还能明确排除坏死细胞，仅针对凋亡细胞进行分析。此方法克服了传统侵入性肘前静脉穿刺的局限性和不适感，无需在运动前、运动中及运动后即刻等多个时间点反复采血，也避免了在整个运动过程中留置导管的需要。从研究者角度来看，传统的静脉采血操作通常需要专门的抽血技术培训，并非所有研究人员都具备该技能。此外，采用这种微创方法有助于提高受试者的招募效率和依从性，从而在存在真实效应的情况下，提升统计检验效能，增加发现显著效应的可能性。
先前采用静脉穿刺采血的研究已报道了静息状态及运动后总体淋巴细胞的数值。利用膜联蛋白V，Simpson 等 静息状态下淋巴细胞凋亡率约为1.2%，跑步机运动后约为1.3% 1。类似地，Steensberg 等 静息状态下报告的总凋亡淋巴细胞约为1.8%，跑步2.5小时后约为2.1% 2采用本文所述指尖采血法检测的凋亡淋巴细胞结果相似，在完成递增负荷运动试验的五名受试者中，静息时观察到的凋亡...

<table><tbody><tr><td>流式细胞术结合缓冲液</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>采血针具</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>肝素化毛细管</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC 标记试剂</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PE 标记试剂</td><td>抗人，克隆株 RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8-PE 标记试剂</td><td>抗人，克隆株 OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE 标记试剂</td><td>抗人，克隆株 HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 活性染色溶液</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA-APC 标记试剂</td><td>抗人，克隆株 HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

指尖采血法用于测定运动诱导的淋巴细胞凋亡

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

运动是一种能够诱导免疫细胞发生凋亡的生理刺激。迄今为止，在检测这一现象时已发现多种局限性，尤其是获取血样后在评估细胞死亡前所需的分离和处理时间较长。因此，很难确定所报道的免疫细胞凋亡增加究竟是运动对机体产生的实际效应，还是仅仅反映了为获得该测量结果所必需的耗时操作过程。本文介绍了一种快速且微创的方法，用于分析运动诱导的淋巴细胞凋亡。与其他技术不同，该方法在获取样本后立即将其加入抗体组合中。经过孵育后，裂解红细胞，样本即可用于分析。采用指尖采血方式减少了所需血液体积，并最大程度降低了受试者的不适感。

运动能够诱导免疫细胞发生凋亡。现有的检测方法存在多种局限性，尤其是血液样本在分析前所需的分离和处理时间较长。本文展示了一种快速且微创的方法，用于分析运动诱导的淋巴细胞凋亡。

运动是一种能够诱导免疫细胞发生凋亡的生理刺激。迄今为止，在检测……方面已发现多种局限性

大家好，我是来自西肯塔基大学运动机能学、休闲与体育系运动科学项目的 James Volta。接下来，我们将向您展示我们开发并用于测量运动诱导淋巴细胞凋亡的实验方法。现在让我们开始吧。采用通用预防措施进行指尖采血。先对指尖进行消毒，然后刺破皮肤。弃去第一滴血，随后将血液吸入毛细管或微孔板中。将10 µL全血加入含有流式细胞术抗体组合的管中，该组合包含适当的缓冲液和荧光染料，包括Annexin V、7-AAD、CD4、CD8、CD19以及CD45RA；此外设置仅含细胞的对照管。我们使用补偿微珠作为对照，以辅助实验的设置。样品充分混匀后涡旋振荡，随后在室温避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，样品以离心机离心10分钟，然后一次性倾倒弃去上清液。加入300微升红细胞裂解缓冲液，并将样品充分涡旋混匀。确保样品与裂解缓冲液充分混合至关重要。为了最大限度地去除红细胞，您会观察到样品开始变得浑浊。但在室温孵育至少15分钟后，随着红细胞裂解，溶液将变得澄清，此时加入300微升磷酸盐缓冲液作为终止液以结束裂解反应。然后再次将样品以300 × g离心10分钟。请注意，在离心步骤结束后，试管底部会形成细胞沉淀，应一次性平稳地弃去上清液，并充分涡旋振荡以重新悬浮细胞和溶液。此时，您的样本已准备好进行流式细胞术分析。此处展示的是具有代表性的前向散射与侧向散射图，用于圈定淋巴细胞亚群，并在该亚群内鉴定annexin V阳性细胞。我们刚刚描述了用于检测运动诱导淋巴细胞凋亡的方法学，认为该方法还可拓展应用于诸多其他研究领域。它实际上可用于观察除淋巴细胞及其亚群之外的任何类型的白细胞，也可用于检测细胞表面存在的任何标志物。因此，我们认为该技术具有更广泛的应用前景。

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免疫学与感染

手指棒运动诱导淋巴细胞凋亡的测定血液抽样方法

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