Name: 神经调节和线粒体运输:在较长的时间里，海马神经元的实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 探索利用慢病毒介导的荧光蛋白标记和延时荧光显微镜技术，在海马神经元中长期实时成像观察线粒体运输的方法。该方案可评估神经调节剂对线粒体动态的影响，为研究神经递质调控机制提供可靠的技术手段。

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我们感谢 Donald Hutson 在台式培养箱的设计与制造过程中贡献出他的专业技术与高超技能。我们还感谢 Ayda Dashtaei 提供出色的技术协助。所有工作均由神经科学研究基金会资助。

<ol><li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li>
<li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li>
<li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrawley%2C+JN+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. , J. Wiley. (1999).</li>
<li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedoroff%2C+S+%22Protocols+for+neural+cell+culture%22">Protocols for neural cell culture</a>. , 3rd edn, Humana Press. (2001).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

通过使用慢病毒介导的荧光蛋白在感染的培养神经元中靶向线粒体表达，并结合一种价格低廉、实验室自制的载台式培养箱，可实现对活细胞长时间成像，我们得以研究线粒体运动与5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）和乙酰胆碱（ACh）等神经调节信号之间的关联。我们的研究有助于阐明一条信号通路，首次将线粒体运输与由5-HT和DA等神经递质调节的神经元活动变化联系起来，而这些神经递质正是神经功能的核心。我们发现，使用靶向荧光蛋白可在生理学上更具相关性的较长时间内，对活体培养神经元中的标记线粒体进行持续观察，相较使用活体染料所能实现的较短观察时间具有明显优势。此外，荧光蛋白信号的强度使我们在图像采集过程中能够保持较短的曝光时间，从而最大限度地减少光漂白或光毒性发生的可能性。最后，一种结构简单且成本低廉的载台式培养箱，可在最小化培养基蒸发的同时维持环境温度、湿度和CO2水平，使我们能够连续数小时甚至数天追踪活神经元中线粒体的运动。希望为活神经元中线粒体的长期观察构建载台式培养箱的研究人员，无需完全照搬本方案中设计的具体细节，只要所用材料的特性（例如，使用透气膜以避免培养基蒸发）和应用原理（例如，温度与湿度控制、pH缓冲、渗透压维持）总体上与本方案所述一致即可。

<table><tbody><tr><td>(1) 组织培养箱（H）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1) 耐热塑料外壳（A）</td><td></td><td></td><td>（聚甲醛或性能相当的材料）</td></tr><tr><td>(1) 35 mm GBM 盖用塑料框架（M）</td><td></td><td></td><td>（用于将膜固定到培养皿上）</td></tr><tr><td>(1-2) 英尺透明 PFTE（特氟龙）</td><td></td><td></td><td>膜材料</td></tr><tr><td>(4) 黄铜手拧螺钉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(2) 小型 10 kOhm 散热电阻</td><td></td><td></td><td>作为载台培养箱外壳内的加热元件</td></tr><tr><td>(1) 变压器</td><td></td><td></td><td>为电阻提供 9 V 电流</td></tr><tr><td>(1) 爬虫类饲养箱温控器及探头</td><td></td><td></td><td>通过变压器对散热电阻进行恒温功率调节</td></tr><tr><td>(1) 2000 ml 锥形瓶（K）</td><td></td><td></td><td>作为载台培养箱前软管的减震消音器</td></tr><tr><td>(1) 1/8&quot; 索尔波坦片材</td><td></td><td></td><td>作为载台培养箱底座的垫圈材料</td></tr><tr><td>(1) 密闭式 ABS（或性能相当）塑料盒（J）</td><td></td><td></td><td>用于容纳水族泵</td></tr><tr><td>(1) 水族泵（I）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1) 小型计算机散热风扇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1) 散热风扇塑料外壳（L）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1) 计算机散热风扇用 9 V 变压器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(20-30 英尺) Nalgene 或硅胶软管（F, G, N）</td><td></td><td></td><td>连接组织培养箱与载台培养箱；用于水分捕集</td></tr><tr><td>(2) 塑料活塞阀（O）</td><td></td><td></td><td>用于开启和关闭载台培养箱前后气流</td></tr><tr><td>(4) 带倒刺黄铜软管接头</td><td></td><td></td><td>用于连接载台培养箱与水族泵外壳的软管</td></tr><tr><td>(2) 黄铜快速接头</td><td></td><td></td><td>用于连接载台培养箱的软管</td></tr><tr><td>(2) 黄铜快速接头</td><td></td><td></td><td>用于连接载台培养箱的软管</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;strong&gt;表 1. 载台培养箱组件：&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Roche Group</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻底培养皿</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10567</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>富含脂质的 BSA</td><td>Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381-100G</td><td></td></tr><tr><td>维生素 B-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876-100MG</td><td></td></tr><tr><td>5-HT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523-25MG</td><td></td></tr><tr><td>8-OH-DPAT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8520-25MG</td><td></td></tr><tr><td>多巴胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8502-5G</td><td></td></tr><tr><td>溴隐亭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2134-25MG</td><td></td></tr><tr><td>SKF38393</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D047-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

神经调节与线粒体运输：对海马神经元进行长时间活体成像

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

为了理解线粒体运输与神经元功能之间的关系，长时间观察活体培养神经元中的线粒体行为至关重要1-3。如今，借助活细胞染料和荧光蛋白，可以对活细胞中的细胞骨架成分、细胞器及其他结构进行标记，并通过动态荧光显微镜进行可视化观察，从而实现这一目标。例如，在鸡胚交感神经元中，曾使用活细胞染料罗丹明123来表征线粒体的运动4。在另一项研究中，通过转染线粒体靶向的eYFP，在大鼠前脑神经元中实现了线粒体的可视化5。然而，对原代神经元进行数分钟、数小时甚至数天的成像仍面临诸多挑战。其中最主要的问题包括：1）在长时间成像过程中维持培养环境的温度、湿度和pH等条件；2）获得强而稳定的荧光信号，以确保所获取图像的质量，并在图像分析过程中准确测量信号强度；3）在图像采集过程中限制曝光时间，以尽量减少光漂白并避免光毒性。
本文介绍了一种可在高时间分辨率及最佳生命维持条件下，对培养的海马神经元中线粒体运动进行观察、可视化和分析的实验方案。我们构建了一种经济实惠的载物台式培养箱，能够实现良好的温度控制和气体流通，同时减少培养基蒸发，从而确保稳定的pH值和渗透压。该培养箱通过进气和出气软管连接至标准组织培养箱，后者可提供恒定的湿度环境以及5-10% CO2/空气的气体环境。该设计相较于昂贵得多的显微镜专用培养箱更具成本效益，而后者并不一定能保证细胞在数小时甚至数天内的存活状态。为实现线粒体的可视化，我们使用编码靶向线粒体的红色荧光蛋白的慢病毒感染细胞。这种方法可产生强而持久的荧光信号，结合稳定的氙灯光源，使我们在图像采集过程中能够缩短曝光时间，几乎完全避免光漂白和光毒性。载物台培养箱顶部设有两个注射端口，可用于快速施加神经递质及其他旨在调节线粒体运动的试剂。综上所述，通过慢病毒介导的细胞器靶向红色荧光蛋白表达，结合本载物台培养箱、常规倒置荧光显微镜、CCD相机和氙灯光源，我们能够对活神经元中线粒体运输进行长时间的延时成像，其持续时间远超使用传统活体染料和现成生命支持系统的以往研究。

我们描述了一种通过荧光显微镜对活神经元中的线粒体进行长时间成像的实验方案。通过慢病毒介导表达线粒体靶向的荧光蛋白，并结合使用本实验室设计和构建的低成本载台式培养箱，可实现对样本的长期连续成像。

要理解线粒体运输与神经元功能之间的关系，关键在于观察活体培养神经元中线粒体的行为。

本实验的总体目标是利用活细胞荧光显微镜技术，对培养神经元中的线粒体运输过程进行长时间的动态观察。首先，通过使用靶向线粒体的荧光蛋白对培养神经元中的线粒体进行标记；随后，在对照条件下采集线粒体运输的实时图像，从而实现这一目标。该实验步骤的第三步是在急性施加血清素等神经调节剂后，获取线粒体运输的延时成像序列。实验步骤的最后一步是对所获得的延时成像序列进行分析。最终可得到结果，表明神经递质能够调节线粒体的运输。只有通过长时间成像荧光标记的神经元线粒体才能获得此类结果。与现有的活体染料标记或GFP瞬时转染等技术相比，该方法的主要优势在于能够对健康培养神经元中的线粒体运输进行长期观察。为了提供一个稳定加热和加湿的环境，本实验操作将由本实验室的副研究员 Chen 演示。载物台培养箱通过闭合回路连接至标准组织培养箱，配备适用于35毫米玻璃底培养皿的A-P-F-T-E膜盖，可实现神经元培养物与培养箱内部环境之间的气体交换。这些及其他特性共同支持在多种实验条件下对培养的神经元进行长期观察。将含有表达线粒体靶向Turbo Red蛋白的培养海马神经元的培养皿转移至组织培养超净台中。将塑料盖替换为聚四氟乙烯（PFTE）膜盖，并将培养皿移至显微镜下。将培养箱底座夹在显微镜载物台上，然后小心地将覆有膜的培养皿放入其中。在凹陷开口处，将培养箱外壳与底座上的钢柱对齐，并将外壳缓缓放到底座上。拧紧 thumbscrews，直到 enclosure 与 base 之间形成良好密封。在打开成像软件之前，先开启显微镜滤光轮控制器、光源和 CCD 相机。本方案中使用 slide book 5 进行图像采集。切换至63倍油镜物镜并降低物镜转盘。小心地将镜油滴加到物镜表面。单击工具栏上的对焦窗口图标，并通过移动光源滑块打开明场照明灯。为了调节光照强度，首先使用目镜对细胞视野进行聚焦，并找到感兴趣的细胞。在显微镜选项卡下选择XI三滤光片，使用目镜找到经mito turbo red蛋白标记的细胞中线粒体的焦平面，然后切换至CCD相机。单击工具栏上的图像采集图标，初始曝光时间设置为100毫秒。在捕获窗口中使用测试和查找最佳按钮来找到最佳曝光。在捕获类型框下，勾选延时成像选项，并在延时成像选项下选择所需的成像时间间隔和成像会话时长。通过点击捕获窗口右下角的开始按钮，启动延时成像采集。在完成对照成像采集后，通过载物台顶部培养箱上方的注射口加入神经递质或其他试剂。加入5-羟色胺受体激动剂8-OH-DPAT后，先前静止的线粒体（由箭头指示）开始沿海马神经元的轴突移动。在添加血清素之前，单个线粒体的平均速度和运动方向性已进行总结。大多数线粒体处于静止状态；然而，在添加血清素后，42%的线粒体表现出定向运动，并且移动距离比未添加血清素时表现出定向运动的线粒体更远。相反，在添加多巴胺后，按照此操作流程，在成像实验的最后15分钟内，92%的线粒体处于静止状态。为了回答更多问题，可以采用其他方法来同时监测多个信号。例如，神经元中的钙活动与线粒体运输之间的关系。

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神经调节和线粒体运输：在较长的时间里，海马神经元的实时成像

活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。...

活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

来源： Ulivi, A. F., et. al. 活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像. J. Vis. Exp. (2019)...

活体小鼠海马中荧光标记神经元的纵向双光子成像

来源：Katsalifis, A., 等。利用比率型指示剂对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像。J. Vis. Exp.

利用比率型指示剂对原代神经元中的线粒体氧化还原状态进行成像

衰老过程中细胞内 Ca2+ 重塑可能引起兴奋性毒性及神经元损伤，这些过程由 Ca2+ 超载介导。本研究旨在利用荧光和生物发光成像技术，对大鼠海马神经元长期培养模型（一种神经元衰老模型）中胞质和线粒体 Ca2+ 的动态变化进行检测，以探究衰老脑组织中的 Ca2+...

衰老海马神经元中亚细胞钙离子（Ca2+）的荧光与生物发光成像

本方法描述了一种慢性制备技术，可实现对活体小鼠海马体的光学观察。该技术可用于在数周时间内对神经元结构可塑性以及活动诱导的细胞可塑性进行纵向光学成像。...

活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

线粒体运输和形态异常与多种神经退行性疾病相关。本方案利用诱导性多能干细胞分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中的线粒体运输和形态。该方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于推动神经退行性疾病的机制研究。...

分析遗传性痉挛性截瘫患者来源的人诱导多能干细胞衍生神经元中的线粒体运输与形态

本文演示了定制成像窗口的制备方法，该窗口配有灌注套管，并展示了其在小鼠海马CA1区的植入过程。...

行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

本文介绍了一种利用共聚焦活细胞显微镜检测原代海马神经元和皮层神经元基础氧化还原状态差异以及对急性干扰的氧化还原反应差异的实验方案。该方案经少量修改后也可适用于其他细胞类型和显微镜系统。...

利用比率型探针对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像

本文介绍了一种通过精确控制的手术和双光子显微镜技术，对小鼠海马CA1区静息态小胶质细胞进行慢性体内观察的方法。...

体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

探索利用慢病毒介导的荧光蛋白标记和延时荧光显微镜技术，在海马神经元中长期实时成像观察线粒体运输的方法。该方案可评估神经调节剂对线粒体动态的影响，为研究神经递质调控机制提供可靠的技术手段。

神经调节与线粒体运输：对海马神经元进行长时间活体成像

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