Name: 从大脑皮层的器官型切片制备全细胞记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学习制备大鼠大脑皮层器官型切片并进行全细胞记录的技术，用于研究锥体神经元的电生理特性。该方法支持基因转染后的长期培养与电生理分析。

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作者谨此感谢 Mayumi Sakuraba 和 Rebecca Foehring 提供出色的技术支持。此外，我们感谢 Rodrigo Andrade 博士在实施器官型脑片培养和基因枪转染实验方案方面提供的帮助，以及 Jeanne Nerbonne 博士为我们提供用于转染的 cDNA 构建体。本研究工作由美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）资助：NIH 基金项目 NS044163（资助对象：RCF）。

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<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
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<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
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<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们一直在研究大鼠新皮层锥体神经元中电压门控性钾通道的表达及其功能作用（4, 9-11）。由于目前缺乏针对这些通道的特异性药理学工具，我们采用遗传学方法来调控通道的表达（1,14,15,17-19）。我们采用一种改良自Stoppini et al.（16）的器官型脑片培养方法（2,3;5-8;12,13,15-22），以维持细胞形态以及皮层的分层结构。我们在出生后第6至17天获取急性新皮层脑片，并在体外培养2至7天。这种方法使我们能够研究与急性脑片实验中年龄相近的神经元，同时最大限度地减少脑片中过度兴奋性连接的形成。我们通过红外照明（IR）结合微分干涉差显微镜（DIC）技术，在电流钳或电压钳模式下对II/III层或V层中视觉识别的锥体神经元进行全细胞膜片钳记录。通过基因枪（Biolistic）转染野生型或突变型钾通道DNA，调控通道表达以研究其功能（1,14,15,17）。通过与GFP的cDNA共转染，可在落射荧光显微镜下轻松识别转染的细胞。我们将同一脑片同一皮层层中相邻的未转染神经元作为对照，与转染细胞的记录结果进行比较（1,17）。
本文所述的所有操作步骤均...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;手术 / 转染 / 培养&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;李&gt;脑切片仪：Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments，美国佛罗里达州萨拉索塔&lt;/li&gt;&lt;李&gt;基因枪系统：Bio-Rad Helios #165-2431（Bio-Rad Laboratories，1000 Alfred Nobel Drive，Hercules，CA 94547）&lt;ul&gt;&lt;李&gt;包含：基因枪、带调节器的氦气软管组件、管路制备站（#165-2418）、注射器套件、特氟龙涂层管、管路切割器、优化套件（#165-2424）、管路切割器&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bio-Rad 氦气调节器（#165-2413）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;Bio-Rad Helios 一次性耗材&lt;ul&gt;&lt;李&gt;1.6 &amp;#x03BC;m 金微载体：#165-2264&lt;/li&gt;&lt;李&gt;Tefzel 管道：#165-2441&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;李&gt;培养箱：Forma Scientific 型号 #3110（Thermo-Scientific：(866) 984-3766）&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;媒体：&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;李&gt;马血清：Hyclone 供体马血清 #SH 30074。（HyClone，美国犹他州洛根市西1800南街925号，84321）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;HMEM（不含谷氨酰胺的最低必需培养基，含HBSS和HEPES：Lonza BioWhittaker 目录号#12-137F）：GIBCO/INVITROGEN，(800) 955-6288，选项1。 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;HBSS（GIBCO Hank's 平衡盐溶液，#24020-117）：GIBCO/INVITROGEN，(800) 955-6288，选项 1。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;MEM（GIBCO最小必需培养基，#12360-038），GIBCO/INVITROGEN，(800) 955-6288，选项1。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;250 mL Millipore 0.2 &amp;#x03BC;m 滤膜：#SC6PU02RE&lt;/li&gt;&lt;李&gt;塑料移液管：Fisher #13-711-20。&lt;/li&gt;&lt;李&gt;50 mL Millipore Steriflip 0.22 &amp;#x03BC;m 滤膜 (#SCGP00525)&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;第6-8项物品购自：Fisher Scientific，1241 Ambassador Blvd，P.O. Box 14989，St. Louis，MO 63132。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;记录：&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;李&gt;移液管玻璃：Harvard GC150TF-10：Harvard Apparatus，美国马萨诸塞州霍利斯顿十月山道84号，01746&lt;/li&gt;&lt;李&gt;Sutter P-87 水平电极拉制仪：Sutter Instrument 公司，One Digital Drive，诺瓦托，加利福尼亚州 94949&lt;/li&gt;&lt;李&gt;Axon Instruments Multiclamp 700B 放大器：Molecular Devices, Inc.，美国加利福尼亚州森尼韦尔市奥尔良斯大道1311号，邮编 94089-1136&lt;/li&gt;&lt;李&gt;PClamp 10 数据采集软件：Molecular Devices, Inc.，1311 Orleans Drive，Sunnyvale，CA 94089-1136 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;电极位置由 Sutter R 控制&amp;#8211;-200 操作臂与 PC-200 控制器： &lt;强&gt;Sutter Instrument Company&lt;/strong&gt;美国加利福尼亚州诺瓦托数字大道1号，邮编94949 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;显微镜：Olympus BX-50WI 直立显微镜，配备红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统&lt;/li&gt;&lt;李&gt;对红外敏感的相机 OLY-150（Olympus）或 DAGE-MTI（DAGE-MTI，01 North R&amp;#8211;ske大道，密歇根城，印第安纳州 46360&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

我们一直在研究大鼠新皮层锥体神经元中电压门控钾通道的表达及其功能作用。由于目前缺乏针对这些通道的特异性药理学工具，我们采用了遗传学方法来调控通道的表达。我们采用脑片器官型培养方法（16），以维持细胞形态以及皮层的分层结构。通常在出生后第8至10天急性分离新皮层脑片，并将脑片在体外培养3至7天。这种方法使我们能够在与急性脑片实验相似的发育阶段研究神经元，同时最大限度地减少脑片中过度兴奋性连接的形成。我们通过红外照明（IR）结合微分干涉差显微镜（DIC）技术，在电流钳或电压钳模式下进行全细胞膜片钳记录，对II/III层或V层中经视觉识别的锥体神经元进行电生理记录。为调控钾通道的表达以研究其功能，我们采用基因枪（生物弹道）法转染野生型或突变型钾通道DNA。通过共转染绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA，可在转染后利用落射荧光显微镜轻松识别转染的细胞。我们将同一脑片同一皮层内转染细胞的记录结果与邻近未转染神经元的记录结果进行比较。

本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。

我们一直在研究大鼠新皮层锥体神经元中电压门控钾通道的表达及其功能作用。由于……

本实验的总体目标是从新生大鼠大脑皮层的器官型脑片中获取锥体神经元的电生理记录。首先，从出生后第8至第10天（P8–P10）的大鼠中制备急性脑片；其次，对cDNA进行Bic转染；第三步是将脑片培养3至7天。该实验流程的最后一步是采用电流钳或电压钳技术对转染细胞进行电生理记录。最终获得的结果表明，器官型脑片中的下橄榄核神经元具有与同龄动物急性脑片中神经元相似的电生理特性。转染GFP不会改变这些特性，因此可在全细胞电流钳或电压钳记录中研究离子通道经过基因操作后的神经元特性。该技术的主要优势在于，与急性切片相比，细胞可在正常环境中维持较长时间，从而能够对离子通道进行遗传学操作。该方法有助于回答离子通道研究领域中的关键问题，例如特定类型离子通道的功能作用。准备层流罩、抽滤罩、手术器械及溶液，具体步骤详见配套文稿。在过滤制备的250毫升切割溶液后，将其中40毫升分装至50毫升烧杯中，此后所有步骤均需佩戴手套操作。将切割室、40 毫升等分试样以及剩余的 210 毫升切割溶液置于超净工作台内的 -20 摄氏度冰箱中。在六孔板的三个对角孔中各加入 1.1 毫升培养基。对第二个六孔板重复此操作。六孔板。将六孔板放入37摄氏度的培养箱中孵育至少一小时。接下来，使用无菌剪刀将四根移液管剪短，用于转移组织切片。当溶液变成泥状混合物时，另外三根移液管保持完整。从冰箱中取出40毫升切割溶液的等分试样，置于真空罩下，用95%氧气、5%二氧化碳进行鼓泡。然后从冷冻机中取出210毫升切割液，置于超净工作台内进行鼓泡，气体环境为95%氧气和5%二氧化碳。接着从冰箱中取出洗涤培养基，在超净工作台内用100%氧气进行鼓泡。在培养皿中加入两毫升培养基。将剩余的培养基放入冰箱冷藏，用于本周换液，为脑组织切片做准备。在真空罩下，从50毫升烧杯中倒入约10毫升冰冷切割液至25毫升烧杯中。麻醉并断头后，取出出生后第8至10天的大鼠脑组织。将脑组织放入含有30毫升冷切割液的烧杯中清洗约30秒。然后小心地将脑组织转移至25毫升的烧杯中。更换手套，并用乙醇充分浸湿手套。然后将脑组织置于冷切割液中，转移至超净工作台。下一步是定位并修整脑组织：去除小脑和额极，并进行部分正中矢状切口，将修整好的脑组织粘贴在切片台上，使额叶皮层朝上。根据需要进行额外的手术刀切割，以控制切片大小。然后将带有脑组织的切片台放入已灭菌的金属切片室中，并连接至振动切片机。用冰冷的含气切割液充满浴槽。将剩余的30毫升切割液倒入50毫升烧杯中，并用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气。该烧杯将用于收集切片。切取额顶叶皮层250微米厚的冠状切片。将至少六片切片放入盛有切割液的50毫升烧杯中。接着，在35毫米的培养皿中加入约2毫升洗涤培养基。使用剪断的移液管将切片从切割液转移至含有洗涤培养基的培养皿中。每次使用新的移液管加入培养基，并在洗涤后吸除废液，共洗涤三次；随后将切片转移至含有培养基的35毫米培养皿中。接下来，打开网格插件包装的盖子，但将插件保留在包装内。然后使用镊子和剪去尖端的移液管从包装中取出一个网状插件。将一片组织从培养基转移至网状膜上。使用完整的移液管将组织片插入并置于膜的中央位置。去除多余的培养基。现在，将带有脑片的网状插件放入六孔板中盛有液体的孔之一。每个盛有液体的孔中放入一片后，需小心操作，避免网状插件下方产生气泡。将两个六孔板放回培养箱中，在37摄氏度下孵育约一小时。在此期间，在超净工作台内清洁操作区域，为转染做好准备。下一步是装载BioRad Helios基因枪，第一个位置留空。将含有CD NA包被弹丸的 cartridge 装入基因枪 cartridge 持架的每隔一个位置，然后将 cartridge 持架放入基因枪中。首先，通过发射一个无弹丸的枪管来清枪。然后推进炮管，对准含有cDNA包被微弹的 cartridge。从培养箱中取出六孔板，置于超净工作台内，将基因枪垂直持稳，位于六孔板上方，以100 PSI的压力射击一片。随后推进炮管，并通过发射一次空弹将其清空。对剩余的每一片区域均以一次射击完成轰击。拍摄后，将六孔板放回培养箱，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育切片2至7天。孵育期间每隔一天更换一次培养基，具体操作如下：在超净工作台内，向三个未使用的孔中加入新鲜培养基。然后将六孔板放回培养箱至少一小时；一小时后，将六孔板重新移至超净工作台，用经乙醇消毒的弯头镊子将每个网格插件及其切片转移至新的孔中，吸除旧培养基，再将六孔板放回培养箱。经过数天的孵育后，脑片现已准备好进行全细胞记录。在超净工作台内，从培养箱中取出一个六孔板。使用经乙醇消毒的弯头镊子取出一个网状插件及其脑片。然后将六孔板放回培养箱中。接着，将带有网格插件和脑片的培养皿转移至记录区域，用镊子或一段有弹性的金属丝施加张力。如有必要，使用11号手术刀将网格从脑片周围切开，最后用剪刀完成最终的切割。然后使用镊子将切片及其附着的网格转移至记录室。在直立显微镜的载物台上，用含碳合气的模拟脑脊液在红外微分干涉（IR DIC）光学条件下孵育切片。在落射荧光和fitz滤光片下观察第2、3或5层中的参数神经元。在红外微分干涉相差显微镜下定位绿色转染的细胞。寻找cDNA弹丸，它们在细胞内呈现为微小的黑点。选择一个转染的细胞进行全细胞记录。接下来，将微电极推进至所选细胞，并施加轻柔的负压以形成吉欧姆级封接。随后施加额外的负压以穿入细胞，进入全细胞记录模式。此时细胞已准备好进行电流钳或电压钳记录。该图显示了转染了GFP cDNA的细胞的荧光图像。以下记录来自转染了GFP cDNA的细胞。此处展示的是第三层顶叶细胞在受到超阈值10毫秒电流刺激时产生的动作电位。该图显示了第五层旁内侧神经元在持续两秒、400 皮安电流刺激下产生的重复放电。该图显示了第五层旁内侧神经元的电压钳记录。使用河豚毒素阻断电压门控钠电流。这些痕迹代表通过一系列500毫秒的电压阶跃（从−70毫伏的保持电位开始）所诱发的外向钾电流。一旦掌握技术，包括准备时间在内，精细制备和转染过程大约可在两小时内完成。尝试本实验步骤时。保持无菌条件并限制切片的厚度和尺寸以防止干燥非常重要。感谢观看，祝您的实验顺利。谢谢。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

从大脑皮层的器官型切片制备全细胞记录

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。...

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

本视频展示了如何将尖端精细的移液管置于脑切片附近，与神经元细胞形成封接。通过施加负压使细胞膜破裂，从而建立全细胞膜片钳，以实现电生理实验中的电流测量。...

建立脑片电生理记录的全细胞电压钳制配置

本视频介绍了一种同时对含有神经元特异性荧光蛋白的转基因脑片进行成像和记录电活动的方法。该方法包括将脑片置于灌流室中，并用充氧的人工脑脊液维持；使用光源激发荧光标记的细胞；并通过多通道探针和膜片钳技术记录电信号。...

脑切片中神经元细胞的同步光学与电生理监测

配对记录是指对两个突触连接的神经元同时进行全细胞膜片钳记录，从而能够精确地表征单个神经元之间突触的电生理学和药理学特性。本文详细描述了在具备电生理学实验条件的任何实验室中，于海马脑片组织培养上建立该技术的具体方法和所需条件。...

器官型海马切片中的成对全细胞记录

闭环协议在现代电生理学中正日益普及。我们介绍一种简单、通用且成本低廉的方法，用于在皮层锥体神经元中执行复杂的电生理学实验方案 体外使用台式计算机和数字采集板。...

实时电生理学：利用闭环协议探究神经元动态及其更广泛应用

此处介绍一种通过基因编码将光反应性非天然氨基酸定点插入培养神经元中表达的靶向神经元蛋白，从而利用短时闪光选择性激活该神经元蛋白的方法。 体内...

利用基因编码的非天然氨基酸在神经元中光学控制神经元蛋白

本方案演示了一种优化方法的实施...

使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

本文中，我们讨论了三种用于全细胞膜片钳记录以研究视网膜-顶盖环路的脑组织制备方法 非洲爪蟾 蝌蚪。每种制备方法都有其特定的优势，有助于提高实验的可操作性 非洲爪蟾...

全细胞膜片钳记录的制备与操作方案 Xenopus laevis 中脑顶盖神经元

在此，我们描述了在 substantia gelatinosa (SG) 神经元中进行全细胞膜片钳记录的关键步骤 体外...

脊髓胶状质神经元全细胞膜片钳记录用急性脊髓切片的制备

本文介绍了制备包含外侧膝状体核的急性脑切片以及对视网膜-膝状体和皮层-膝状体突触功能进行电生理研究的实验方案。该方案可在同一急性脑切片中高效地研究高释放概率和低释放概率的突触特性。...

视网膜-外侧膝状体及皮层-外侧膝状体突触功能的电生理学研究

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

学习制备大鼠大脑皮层器官型切片并进行全细胞记录的技术，用于研究锥体神经元的电生理特性。该方法支持基因转染后的长期培养与电生理分析。

从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

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