Name: 流动小鼠减数分裂细胞的流式细胞仪净化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 了解利用流式细胞仪从小鼠睾丸中高效纯化减数分裂细胞的方法。该技术结合酶解消化与荧光染色，可高纯度分离不同DNA含量的细胞群体，用于细胞遗传学和基因表达分析。

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本项目部分得到了佛罗里达州向斯克里普斯研究所提供的资金，以及美国国家普通医学科学研究所和国家儿童健康与人类发展研究所分别授予的项目编号R01GM085079和R21HD061304的资助。这是斯克里普斯研究所的第20917号论文。

该方案可分为两个主要步骤：（1）小鼠睾丸细胞的解离及Hoechst 33342染色，随后如有需要，（2）通过FACS分选生殖细胞中与减数分裂相关的各阶段细胞组分，包括从精原细胞到圆形精子细胞的整个减数分裂过程。收集后，这些高度富集的减数分裂细胞群体可用于多种分析。本方案描述的是单个成年小鼠睾丸的解离过程；对于幼鼠或多个睾丸，可相应调整体积。
1. 睾丸解离
<ol>
	<li>将一个去囊睾丸放入一个15 ml的离心管中。</li>
	<li>加入3 ml含有120 U/ml I型胶原酶的盖氏平衡盐溶液（GBSS）。</li>
	<li>加入10 μl DNA酶I（1 mg/ml的储存液，溶于50%甘油），用手剧烈震荡，直至观察到睾丸小管开始解离。</li>
	<li>在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。</li>
	<li>室温下垂直静置1分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤1.2至1.5。</li>
	<li>加入2.5 ml含有I型胶原酶的GBSS、50 μl溶于1 mM盐酸溶液的50 mg/ml胰蛋白酶储存液，以及10 μl DNA酶I（1 mg/ml），并反复倒置混匀数次。</li>
	<li>在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。</li>
	<li>使用带有宽口的塑料一次性巴斯德吸管，轻柔吹打3分钟，此时不应有可见的团块。</li>
	<li>加入30 μl胰蛋白酶、10 μl DNA酶I，以及40 μl溶于DMSO的Hoechst 33342（10 mg/ml），并反复倒置混匀数次。</li>
	<li>在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。</li>
	<li>加入400 μl胎牛血清（FCS），通过反复倒置混匀以灭活胰蛋白酶。</li>
	<li>通过加入50 μl溶于DMSO的Hoechst 33342（10 mg/ml）和10 μl DNA酶I（1 mg/ml）进行最终染色。</li>
	<li>在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。</li>
	<li>将解离后的睾丸样品通过两个预先用GBSS润湿的40 μm一次性滤膜，滤入一个50 ml的锥形离心管中，然后加入5 μl碘化丙啶（PI）溶液，并用一次性巴斯德吸管轻轻吹打数次以混匀样品。</li>
	<li>将样品通过18号针头转移至一个5 ml塑料注射器中。更换为22号针头用于样品输送。将注射器置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞术（FACS）处理。</li>
</ol>
2. 流式细胞分选设置与纯化
<ol>
	<li>分选在 Becton-Dickinson Aria IIu 细胞分选仪上进行。因此，当使用不同设备时，所述条件应仅作为起始参考，特别是此前已描述过的条件7,8。</li>
	<li>由于 Aria IIu 不具备紫外激光器，我们对检测 Hoechst 染色的方案进行了调整，使用 405 nm 紫色激光进行检测，同时使用 488 nm 蓝色激光进行前向散射和侧向散射检测。此外，部分滤光片经过修改，以减少红色激光的串扰，从而提高散点图的清晰度。</li>
	<li>紫色激光配置为使用 450/40 nm 带通滤光片检测 Hoechst 蓝色发射光，使用 585/42 nm 带通滤光片检测 Hoechst 红色发射光。采用 502 nm 长通滤光片将蓝色与红色荧光分离。</li>
	<li>使用 100 μm 喷嘴，液滴驱动频率为 28,000 滴/秒。样本阈值速率约为 4000 事件/秒。在整个分选过程中，使用温度控制功能将样本和收集管维持在 4°C。此外，样本搅拌功能以 200 rpm 运行，以防止样本在分选过程中发生沉降。</li>
	<li>通常每 6 小时分选处理两到三个睾丸，可为每个细胞群收集 0.5–2.0×106 个细胞（见代表性结果部分）。</li>
	<li>样本以大约 750 μl 的分装量从注射器中分选。在这些暂停期间，收集管保持在 4°C，避光保存，并在恢复分选前轻轻混匀。</li>
	<li>分选后的样本收集至含有 250 μl DMEM（补充 10% FCS）的 12×75 mm 玻璃硼硅酸盐收集管中。</li>
</ol>
3. 代表性结果：
典型的流式细胞分选（FACS）图谱如图1所示。减数分裂的所有主要阶段均已标识，并在图例中予以说明。如果Hoechst 33342染色效果不理想，整体图谱将显得更加紧凑且分辨率降低。一个常见问题是DNA酶添加量不足，这会导致细胞快速聚集。在所有指定步骤中补充额外的DNA酶通常可解决此问题。DNA酶储存液（保存于-20°C）应尽量避免反复冻融，否则会导致酶活性迅速丧失。
Spo11 是一种介导减数分裂的内切酶，可引导减数分裂重组热点位点处发生双链断裂12。图 2 展示了 Spo11 缺失型睾丸的典型图谱，其中未形成双链断裂，导致减数分裂中止12；同时也展示了 13 天龄小鼠青春期前的图谱，揭示了该减数分裂首波的异步特性。应首先采用联合免疫染色方法，结合联会复合体蛋白 3（SCP3）和磷酸化组蛋白 H2AX 抗体，对分选所得的减数分裂细胞进行标准的细胞遗传学分析，以确认细胞纯度及所处减数分裂阶段的特异性标志物，具体方法见其他文献11。
<img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="流式细胞术示意图；细胞在FSC、SSC、HOECHST图中的分布；数据分析可视化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 野生型减数分裂FACS图谱。A) 显示代表性散点图。图中已标出设门的细胞。注意成年睾丸样本中存在大量碎片，主要为无内容物的膜结构和精子细胞尾部。B) 代表性碘化丙啶（PI）图显示样本中PI阳性细胞极少。图中显示典型的设门区域。C) 代表性野生型Hoechst 33342 FACS图谱。图中指出了可通过该方法分离纯化用于后续研究的不同减数分裂细胞群体：精原细胞（Sp）、前细线期（pL）、细线期-偶线期（L/Z）、早期粗线期（eP）、中期粗线期（mP）、晚期粗线期（lP）、双线期（D）以及圆形精子细胞（RS）。
<img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="显示 Hoechst 蓝色与红色荧光强度的流式细胞术散点图，用于分析细胞 DNA 含量。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. Spo11 缺失型与野生型小鼠第13天减数分裂 FACS 分析图谱。A) 典型的 Spo11 缺失型图谱显示明显的减数分裂阻滞，无法检测到粗线期早期之后的任何阶段。B) 13天龄野生型雄性小鼠的图谱显示出大量细线期/偶线期细胞的集中分布。通过该方法可清晰观察到，这一轮减数分裂进程具有明显的异步性。

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方案能够从成年雄性小鼠中同时分离出整个减数分裂阶段的细胞，且纯度极高，使研究人员能够研究这一基本生物学过程的动态变化。所获得的纯化细胞可用于多种实验，包括RNA提取9,10、核小体定位11、重组分子检测、蛋白质分析等。然而，检测方法需根据所获得的减数分裂细胞数量进行相应调整。此外，由于该方法具有高度可重复性，可将不同日期独立分选的同一种细胞组分合并，以增加特定实验所需的材料量。同时，该方法为研究人员提供了减数分裂全过程的独特可视化图谱，可快速评估基因敲除、发育进程异常，或任何旨在影响减数分裂的处理（例如，辐照或小分子抑制剂处理）所产生的效应。
本方案中的关键步骤包括：(i) 使用足量的 DNA 酶，这能有效防止细胞结团和聚集，从而极大地方便细胞分选；(ii) 保持 Hoechst 33342 染色的一致性，这对于有效区分不同减数分裂阶段的细胞群体至关重要。此外，流式细胞分选（FACS）操作人员应熟悉减数分裂细胞分选的具体操作和特殊性，以便对仪器进行最佳设置，获得视频中详述的、如图1</stron...

<table><tbody><tr><td>Ⅰ型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>用GBSS溶解至12,000U/ml，4&amp;#x00B0;C保存</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>用1mM HCl溶解至50mg/ml，4&amp;#x00B0;C保存</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>饱和溶液（DMSO中10mg/ml），4&amp;#x00B0;C保存</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>用水/50%甘油溶解至1mg/ml，-20&amp;#x00B0;C保存</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;s平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>6&quot; 转移吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

流式细胞术纯化小鼠减数分裂细胞

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

睾丸中细胞类型的异质性以及缺乏减数分裂的细胞培养模型，一直是研究减数分裂期间特异性分化程序的重大障碍。目前已开发出两种主要方法，可在不同程度上从成年和未成熟动物中纯化各种减数分裂期细胞组分：离心淘析法或使用牛血清白蛋白（BSA）和/或Percoll梯度的Staput（沉降）法。这两种方法均依赖细胞的大小和密度来分离减数分裂细胞1-5。总体而言，除少数细胞群体外6，这些方案难以获得足够纯度的多种减数分裂细胞群体，而后者是进行详细分子分析所必需的。此外，这些方法通常一次只能纯化一种类型的减数分裂细胞，这在比较减数分裂细胞样本时，进一步增加了实验可重复性和均一性的复杂性。
本文介绍了一种经过优化的方法，通过结合Hoechst 33342染色与流式细胞分选技术（FACS），可简便地对从生殖细胞到圆形精子细胞的减数分裂细胞进行可视化观察、鉴定与纯化7,8。该方法能够全面呈现整个减数分裂过程的概貌，并可实现对减数分裂大多数阶段的活细胞进行高度纯化。随后，可对这些纯化的细胞进行深入分析，以研究伴随减数分裂进程发生的分子变化，例如基因表达的变化9,10，以及减数分裂重组热点区域核小体占据动态的变化11。

本文介绍了一种从小鼠睾丸中高效获取高纯度且具有活性的减数分裂细胞组分的方法，该方法结合了优化的细胞解离方案与荧光激活细胞分选技术（FACS）。此方法利用了不同减数分裂阶段细胞在DNA含量和细胞核密度上的差异。

睾丸中细胞类型的异质性以及缺乏减数分裂的细胞培养模型一直是研究……的重大障碍

以下实验的总体目标是一次性且高纯度地纯化来自小鼠成年睾丸的多种精母细胞，以研究在此独特细胞周期中发生的动态过程。该目标通过一系列含有DNA的胶原酶和胰蛋白酶消化液高效解离睾丸细胞来实现。第二步是获得单细胞睾丸悬液。将易激惹的悬浮液用Hulk's 3 33 42荧光活体DNA染料染色，可根据DNA含量和密度区分不同类型的有丝分裂细胞。随后通过荧光激活细胞分选技术分析有丝分裂细胞，以鉴定并纯化出用于进一步分析（如细胞遗传学或基因表达分析）所需的全部组分。实验结果表明，基于全面的细胞遗传学和表达谱芯片研究，可高效地高纯度分离难以获取的有丝分裂细胞群体。与现有的离心法、过滤法或重力沉降法等方法相比，本基于事实的方案主要优势在于能够以极高的纯度收集到绝大部分的有丝分裂细胞组分。初次使用该方法的研究人员需要综合掌握多种不同的技能，以实现高效的组织解离和孵育，随后进行最佳的细胞分选；这要求细胞制备人员与流式细胞术操作人员之间有良好的协作，同时对本方案的基本原理有充分的理解，这是成功的关键。本细胞解离方案将由我们实验室的高级博士后I. Gatun博士进行示范，他已对该方案进行了显著优化。BVN Tores。我们的流式细胞仪操作员将为您演示高效细胞分选的优化设置。本方案中将展示两只成年小鼠睾丸的解离过程，但可根据幼鼠或更多睾丸的情况相应调整体积。向试管中加入3毫升含有每毫升120单位I型胶原酶的Gaze平衡盐溶液。有效的组织解离对于细胞的正确染色和后续分离至关重要。加入足量的G酶I，并在振荡过程中将试管置于水平位置，这对实现高效的睾丸组织解离非常关键。将一个带有包膜的睾丸放入15毫升试管中。加入10 µL的DNase I至睾丸组织中，用手剧烈振荡试管，直至观察到睾丸小管开始解离。随后将试管水平固定于旋转摇床，于33°C、最高120 ×g条件下振荡15分钟。15分钟后，于室温下垂直静置1分钟，然后使用一次性移液器弃去上清液。向样品中加入3 mL含有I型胶原酶以及10 µL DNase I的Gaze平衡盐溶液。再次用手轻轻振荡试管数次。将试管在33摄氏度下水平摇动，转速不超过120转/分钟，持续15分钟，随后于室温下垂直静置1分钟，弃去上清液。接着加入含有胶原酶的2.5毫升GBSS。加入50微升胰蛋白酶和10微升DASE。轻轻翻转试管数次，在33摄氏度下以不超过120转/分钟的速度水平振荡15分钟。振荡15分钟后，使用带有宽口的一次性塑料移液管轻轻吹打样品3分钟。此时不应看到任何团块。然后加入 30 µL 胰蛋白酶、10 µL DNAs one 和 40 µL 用 DMSO 重悬的 Hulks 3 33 42。轻轻颠倒离心管数次。在33摄氏度下，以不超过120转/分钟的速度水平振荡15分钟。样品振荡完成后，加入400微升胎牛血清，通过倒置试管混匀以灭活胰蛋白酶。进行最终染色时，加入50微升Hoechst 33342和10微升DNase。再次于33摄氏度下，以不超过120转/分钟的速度水平振荡试管15分钟。随后将解离的睾丸样品经两个预先用GBSS润湿的40微米一次性滤器过滤至50毫升锥形管中。向样品中加入5微升碘化丙啶溶液，用一次性巴斯德吸管反复吹打数次，轻轻混匀。接下来，通过18号针头将样品转移至一个5毫升的塑料注射器中。然后将18号针头更换为22号针头以进行样品递送。最后，将注射器置于冰上保存，并避免光照，直至样品准备进行传真处理。本实验在Backin Dixon区域进行细胞分选。细胞分选仪的使用条件参考了此前配备360纳米紫外氩激光器和488纳米氩激光器的流式细胞仪所采用的参数。最终，流式细胞仪的设置需由细胞分选仪操作人员进行优化。由于 Becton Dixon Aria two U 未配备紫外激光器，因此采用 405 纳米紫激光来检测 hawk 染色。Hooks 可被 405 纳米紫激光激发，而 488 纳米蓝激光则用于 PI 激发以及前向散射和侧向散射的检测。此外，为了减少部分红激光的渗漏，从而提高散点图的清晰度，对 hos 检测所用的滤光片进行了调整。紫激光配置了450/40纳米带通滤光片用于检测伪蓝色发射，以及585/42纳米带通滤光片用于检测伪红色发射。使用502纳米长通滤光片来分离蓝色和红色荧光。此处展示了使用两组不同滤光片组合的差异。5 85 42 纳米滤光片相比 6 30 30 纳米滤光片可获得更紧凑的细胞群。因此，操作人员应准备在自己的仪器上尝试不同的组合，以达到最佳的折中效果。使用 100 微米喷嘴，液滴驱动频率为每秒 28,000 个液滴。样品的阈值速率约为每秒4,000个事件，流速应保持在1至3之间，以获得更高的分辨率。将样品分装成若干份，每份约750微升，从注射器中分次点样。在暂停期间，将注射器中剩余的样品置于冰上并避光保存。将分选后的样品收集至含有250微升DMEM（添加10% FCS）的12 × 75毫米玻璃硼硅质收集管中。为保持样品在收集管中处于4摄氏度，应在分选全程启用温度控制功能。此外，应以200 RPM的转速启用样品振荡功能，以防止样品在分选过程中发生沉降。每次向主样品中添加等分试样时，均需轻轻弹击收集管，以确保所收集细胞的完整性。此处展示的是代表性事实图谱，其中散点图中标记了已分选的细胞，可识别出野生型减数分裂的所有主要步骤。在成年睾丸中存在大量碎片，主要包括空膜结构和精子尾部。一个典型的碘化丙啶染色图显示样本中碘化丙啶阳性细胞数量极少。该代表性野生型 hoax 3 33 42 fax 图谱中标注了典型的步态特征。通过该方法可纯化并用于进一步研究的各种减数分裂细胞群体包括：精原细胞、细线期前、细线期、偶线期、粗线期、双线期以及圆形精子细胞。最后两个图谱数据来自13日龄小鼠的SPO11阴性睾丸和野生型睾丸。SPO11是一种介导减数分裂双链断裂的内切酶，决定了减数分裂重组热点的位置；正如此处所观察到的，SPO11的缺失导致明显的减数分裂失败，因为无法检测到细线期-偶线期早期粗线期之后的任何阶段。相比之下，13天龄野生型雄性小鼠的特征显示其瘦素合子细胞浓度较高。这一首次发生的减数分裂过程表现出明显的不同步性。采用该方法进行实验时，使用足量的DNA至关重要。该设备是实现无故障分选的核心。尽管研究者最初可能不太愿意使用，但添加DNA可降低样本黏度，增强细胞分离与染色效果，同时不会损伤完整细胞。FOX方法分离活细胞后，可用于多种下游应用，例如DNA-RNA提取以研究基因表达动态，或用于染色质免疫沉淀技术以建立多种表观遗传谱型。

flow-cytometry-purification-of-mouse-meiotic-cells

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

流动小鼠减数分裂细胞的流式细胞仪净化

基于流式细胞术的酿酒酵母（S. cerevisiae）合子纯化

本文介绍了一种新型的啮齿类动物睾丸细胞悬液机械制备方案，该方法无需使用酶和去污剂。该技术操作简便、快速、可重复性强，所获得的细胞悬液质量良好，适用于流式分选和RNA提取。...

制备睾丸细胞悬液的简易高效技术

我们描述了一种利用流式细胞术对小鼠精子细胞进行分选的策略。精子细胞被分为四个高纯度的群体，包括圆形精子细胞（精子形成阶段1-9）、早期伸长精子细胞（精子形成阶段10-12）、晚期伸长精子细胞（精子形成阶段13-14）以及伸长型精子细胞（精子形成阶段15-16）。分选依据包括DNA染色、细胞大小和颗粒度。...

通过流式细胞术对小鼠精子细胞进行分步分选

我们报道了一种利用荧光激活细胞分选技术从易患狼疮小鼠的骨髓中高纯度分离浆细胞样树突状细胞（pDC）的方案，用于pDC的功能研究。...

利用荧光激活细胞分选法从鼠骨髓中纯化浆细胞样树突状细胞

本研究描述了一种从不同哺乳动物物种的睾丸组织中获取纯化生殖细胞群体的方法的标准化流程。该方法是一种简便的实验方案，结合了睾丸组织的机械解离、Hoechst-33342和碘化丙啶染色以及荧光激活细胞分选（FACS），在雄性生殖生物学的比较研究中具有广泛的应用价值。...

通过机械组织解离与流式细胞术对多种哺乳动物雄性生殖细胞进行标准化纯化的方法

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

本文介绍了一种利用不连续的牛血清白蛋白密度梯度，结合常规实验室设备，从成年小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞、圆形精子细胞和伸长中的精子细胞的实验方案。...

利用常规实验室设备从小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞和精子细胞

本文介绍一种简单高效的方法，用于从成年小鼠睾丸中分离存活的减数分裂期及减数分裂后生殖细胞。通过使用低细胞毒性、紫光激发的DNA结合染料结合荧光激活细胞分选技术，可获得高度富集的生精细胞群体，适用于多种下游应用。...

使用紫光激发的细胞通透性DNA结合染料分离小鼠生精细胞

本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。...

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

本文介绍一种新型的流式细胞术方法，可直接从新鲜的小鼠骨髓和脾脏中前瞻性分离早期红系爆式集落形成单位（BFU-e）和红系集落形成单位（CFU-e）前体细胞。该实验方案基于单细胞转录组数据开发，是首个能够以高纯度分离出全部组织中红系前体细胞的方法。...

通过流式细胞术从小鼠组织中鉴定与分离红系爆式形成单位和集落形成单位祖细胞

为获得满足单细胞RNA测序（scRNA-seq）要求的小鼠脑皮层周细胞，我们提出了一种基于CD13⁺/CD31⁻筛选的 critically...

使用FACS从鼠脑皮层组织中分离周细胞用于单细胞测序

了解利用流式细胞仪从小鼠睾丸中高效纯化减数分裂细胞的方法。该技术结合酶解消化与荧光染色，可高纯度分离不同DNA含量的细胞群体，用于细胞遗传学和基因表达分析。

流式细胞术纯化小鼠减数分裂细胞

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