流动小鼠减数分裂细胞的流式细胞仪净化
April 15th, 2011
一种有效的方法，从小鼠睾丸中获得高度纯化的可行减数分裂分数描述，一个精细胞分解协议相结合的荧光激活细胞分选（FACS）。这种方法需要利用DNA含量和核密度的离散减数分裂分数的差异。
以下实验的总体目标是从小鼠成年睾丸中一次性以高纯度纯化各种有丝分裂细胞，以研究在这个独特的细胞周期中发生的动态过程。这是通过在 DNA 存在下用胶原酶和胰蛋白酶进行一系列酶消化来有效地解离睾丸细胞来实现的。第二步是获得单细胞 testy 悬液。
testy 悬浮液用 Hulk 的 3 33 42 荧光活 DNA 染料染色，该染料可以根据 DNA 含量和密度区分各种肌细胞类型。接下来，通过荧光激活细胞分选分析有丝分裂细胞，以识别和纯化进一步分析所需的所有组分，例如细胞遗传学或基因表达分析。获得的结果表明，基于全面的细胞遗传学和表达阵列研究，可以以高纯度高效纯化难以获得的有丝分裂细胞群。
与离心、迭代或重力沉降等现有方法相比，这种基于事实的方案的主要优点是它允许以非常高的纯度收集最多有微粒的馏分。刚接触这种方法的人必须结合非常不同的技能组合来执行有效的测试解离和站立，然后进行最佳细胞分选，准备细胞的人和流式细胞术作员之间的良好互动，以及很好地理解该协议的基本原理对于成功至关重要。演示细胞解离方案的将是 I Gatun 博士，他是我们实验室的高级博士后，他大大改进了该方案。
BVN 托雷斯。我们的流式细胞术作员将引导您完成高效细胞分选的最佳设置。在该方案中，将证明两个成年小鼠睾丸的解离，但体积可以相应地适应幼年或其他睾丸。
从 3 毫升凝视平衡盐溶液开始，每毫升含有 120 单位的 1 型胶原酶进入试管高效、美味的 dis 缔合对于正确染色和麻烦地诉诸细胞至关重要。添加足够的 G nase one 以及在搅拌过程中将试管放置在水平位置，这对于有效的测试解离非常重要。将一个封装的睾丸放入 15 毫升试管中。
将 10 微升 DNA 加入睾丸中，用手用力摇动试管，直到看到睾丸小管开始解离 下一个位置，将试管水平固定在旋转摇床上，并以最大 120 RPM 的速度在 33 摄氏度下搅拌试管 15 分钟，15 分钟后在 33 摄氏度下， 在室温下垂直倒出 1 分钟。然后使用一次性移液器丢弃上清液。向样品中加入 3 毫升含有 1 型胶原酶的凝视平衡盐溶液以及 10 微升 D nase 1。
再次用手摇动试管几次。像之前一样，在 33 摄氏度下以最大 120 RPM 的速度水平搅拌试管 15 分钟，在室温下垂直倾析 1 分钟，然后弃去上清液。接下来，加入 2.5 毫升含有胶原酶的 GBSS。
第一型 50 μL 胰蛋白酶和 10 μL dase将试管倒置数次，在 120 摄氏度下以最大 33 RPM 的速度水平搅拌 15 分钟。搅拌 15 分钟后，使用带有宽口的一次性塑料移液管轻轻上下移液样品 3 分钟。
此时不应看到任何束。然后加入 30 微升胰蛋白酶、10 微升 DNA 1 和 40 微升重悬于 DMSO 中的绿巨人 3 33 42。将试管倒置数次。
在 15 摄氏度下以最大 33 RPM 的速度水平搅拌 15 分钟。样品搅拌完成后，加入 400 μL 胎牛血清，倒置试管混合以灭活胰蛋白酶。要进行最终染色，请添加 50 微升恶作剧 3 33 42 和 10 微升 DNA。
再次，在 15 摄氏度下以最大 33 RPM 的速度水平搅拌试管 33 分钟。然后将解离的睾丸样品通过两个 40 微米的一次性过滤器，该过滤器在 50 毫升锥形管上预先用 GBSS 包裹。向样品中加入 5 微升碘化丙啶溶液，并用一次性糊状移液器移液数次轻轻混合。
接下来，通过 18 号针头将样品转移到 5 毫升塑料注射器中。然后用 22 号针头替换 18 号针头进行样品输送。最后，将注射器存放在冰上并避光保存，直到样品准备好进行传真处理。
在本实验中，在 Backin Dixon 区域进行细胞分选。第二种，使用细胞分选仪的条件与以前用于配备 360 纳米紫外氩激光器和 488 纳米氩激光器的流式细胞仪的条件进行了调整。最终，流式细胞仪设置必须由细胞分选仪作员进行优化。
由于 Becton Dixon Aria two U 没有紫外激光器，因此使用 405 纳米紫色激光调整了检测鹰染色的方案。Hooks 由 405 纳米紫色激光器激发，488 纳米蓝色激光器用于 PI 激发以及前向和侧面散射检测。此外，对用于 hos 检测的滤波器进行了修改，以限制一些红色激光泄漏，从而提高散点图的清晰度。
紫色激光器配置有 4 50 40 纳米波段通，用于检测恶作剧的蓝色发射，以及 5 85 42 纳米波段通，用于恶作剧的红色发射。5 0 2 纳米长的通用于分离蓝色和红色荧光。此处显示了使用两个不同过滤器集的区别。
5 85 42 纳米滤光片比 6 30 30 纳米滤光片提供更紧凑的细胞群。因此，作员应准备好在自己的仪器上尝试不同的组合，以获得最佳的折衷方案。使用 100 微米喷嘴，液滴驱动频率为每秒 28， 000 滴。
采样阈值速率约为每秒 4， 000 个事件，流速在 1 到 3 之间，以保持更高的分辨率。将样品分装成从注射器中分配的约 750 μL 等分试样在这些暂停期间，将注射器中剩余的样品放在冰上并避光。将分选后的样品收集到 12 x 75 毫米的玻璃 Borisy 收集管中，其中含有 250 微升 DMEM，并补充有 10% FCS。
为了将收集管中的样品保持在 4 摄氏度，请在整个分选期间使用温度控制选项。此外，在 200 RPM 下使用样品搅拌功能，以防止样品在整个分选过程中沉淀。每次加入等分试样的主要样品时，也必须轻弹收集管，以保持收集细胞的完整性。
此处显示了代表性事实概况，其中野生型减数分裂的所有主要步骤都在此散点图中确定，其中显示了门控细胞，成年睾丸中存在大量碎片，其中大部分包含空膜和精子尾。代表性的碘化丙啶图显示样品中存在的碘化丙啶阳性细胞的数量非常有限。典型的步态在这个代表性的野生型骗局 3 33 42 传真配置文件中表示。
可以使用这种方法纯化以供进一步研究的各种肌细胞群是精原细胞、前瘦素、瘦素、合子、pacu、diplotene 和圆形 sperate。最后两个事实概况来自 13 日龄小鼠的 SPO 11 N 睾丸和野生型睾丸。SPO 11 是引导双联链打破其有丝分裂重组热点位点的有丝分裂核酸内切酶，如此处观察到的，SPO O 11 的缺失导致明显的有丝分裂失败，因为无法检测到瘦素合子早期 PACU 之后的阶段。
相比之下，13 天野生型雄性小鼠的轮廓显示高浓度的瘦素受精卵细胞。正如清晰可见的那样，第一波肌病是相当异步的。使用这种方法 在进行此实验时，使用足够数量的 DNA 很重要。
该市的无故障分拣中心。虽然研究人员最初不愿意使用它，但添加 DNA 会降低样品粘度并增强细胞分离和染色，而且完整细胞不会受到损害。用于 MATIC 细胞的 FOX 方法可用于广泛的下游应用，例如，用于研究基因表达动力学的 D-N-A-R-N-A 提取，或用于染色质免疫沉淀技术以建立各种表观遗传学谱。
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概述
本文描述了一种使用精细的细胞解离协议结合荧光活化细胞分选（FACS）从小鼠睾丸中纯化活性减数分裂分数的高效方法。该方法利用了减数分裂细胞类型之间的DNA含量和核密度差异。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生殖生物学
- 遗传学
背景
- 理解减数分裂过程对于研究生殖至关重要。
- 纯化特定细胞类型有助于研究细胞动力学。
- 荧光染料可以根据DNA特性区分细胞类型。
- 荧光活化细胞分选（FACS）是一种强大的细胞分析工具。
研究目的
- 实现从小鼠睾丸中高纯度分离减数分裂细胞。
- 促进细胞遗传和基因表达谱的进一步分析。
- 改进研究细胞周期动力学的方法。
使用的方法
- 使用胶原酶和胰蛋白酶对睾丸细胞进行酶解分离。
- 用荧光活体DNA染料染色细胞悬液。
- 荧光活化细胞分选（FACS）用于细胞纯化。
- 进行全面的细胞遗传和表达谱分析研究。
主要结果
- 成功纯化了高纯度的减数分裂细胞群体。
- 根据DNA含量识别不同的减数分裂分数。
- 结果支持了所提出方法的有效性。
- 获得了减数分裂细胞周期动态过程的洞察。
结论
- 该方法为纯化减数分裂细胞提供了一种可靠的方法。
- 研究结果有助于理解减数分裂过程。
- 在细胞遗传和基因表达研究中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-purity isolation of mouse meiotic cells using flow cytometry addresses a critical bottleneck in reproductive biology and genetic research by enabling detailed molecular analysis of distinct cell populations. This capability enhances predictive confidence in early discovery and target validation workflows, supporting robust mechanistic de-risking and portfolio triage. The method's reproducibility and scalability position it as a reusable asset for enterprise R&D teams focused on cell differentiation and gene regulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of meiotic differentiation pathways through isolation of defined cell populations.
- Supports functional target validation by providing pure fractions for downstream molecular assays.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct comparison of gene expression and chromatin states across meiotic stages.
- Improves predictive confidence in early-stage research by reducing sample heterogeneity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, homogeneous cell populations for quantitative gene expression and cytogenetic assays.
- Standardizes sample input for reproducible assay development and screening workflows.
- Enables high-throughput analysis of molecular changes during meiosis using purified fractions.
- Supports reliable evaluation of candidate compounds or genetic perturbations in defined cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns purified meiotic populations with disease-relevant models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling molecular profiling of developmental stages.
- Reduces biological risk in preclinical studies by ensuring sample purity and stage specificity.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on robust molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based purification method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling detailed molecular characterization at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific meiotic stages for analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of gene expression and chromatin dynamics across cell populations.
- Translational Research: Connects purified cell populations to disease models and biomarker strategies when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for repeated use across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell differentiation studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell purification workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-quality molecular data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation and flow cytometry operation.
- Demands access to advanced cell sorting instrumentation and fluorescence detection capabilities.
- Necessitates cross-team coordination for sample preparation and instrument setup.
- May require protocol adaptation for different mouse ages or testis sizes.
- Sample viscosity and cell integrity must be managed to ensure sorting efficiency and purity.
