Name: 自体血液的注入模型小鼠自发性脑出血 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学习利用自体血液双次注射技术建立小鼠自发性脑出血模型，通过立体定向注射将血液注入基底神经节，研究长期病理变化与神经行为学结果。该方法可有效减少血液回流风险，为脑卒中病理机制研究提供可靠工具。

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本研究由宾夕法尼亚大学转化医学与治疗研究所的博士后奖学金、宾夕法尼亚大学医学与工程研究所的培训项目资助（T32HL007954），以及康涅狄格大学健康中心 Marlene L. Cohen 和 Jerome H. Fleisch 学者奖（LHS）和美国国立卫生研究院 NS-029331 项目（FAW）资助。

1. 仪器设备的准备
<ol>
<li>用 75% 乙醇擦拭立体定位仪框架和泵，以尽量减少细菌污染。</li>
<li>对 Hamilton 注射器和熔融石英针进行灭菌。 
注意：若采用化学灭菌法，使用前务必用无菌水冲洗数次。</li>
<li>用 75% 乙醇擦拭石蜡纸表面，并静置晾干。</li>
</ol>
2. 注射前小鼠的准备
注意：请在手术前至少 7 天将小鼠运送至动物设施，以便它们适应新环境并减少应激。
<ol>
<li>称重小鼠以获取术前基线数据。</li>
<li>使用30%氧气、70%氧化亚氮和4%异氟烷诱导麻醉，直至小鼠对尾部夹捏无反应。</li>
<li>术后通过腹腔注射给予小鼠0.1 mg/kg的丁丙诺啡以进行镇痛。</li>
<li>剃除头皮毛发。</li>
<li>用无菌凡士林涂抹眼睛。</li>
<li>使用聚维酮碘溶液擦拭头皮三次进行消毒，然后让头皮自然干燥。</li>
<li>使用无菌外科手术刀在头皮正中矢状位做1 cm长的切口。 
注意：切口应足够大，以充分暴露颅骨解剖标志。</li>
<li>从尾部基底起始处向远端1 cm范围内剃除1 cm长的毛发，并用聚维酮碘溶液擦拭三次进行消毒。</li>
<li>将小鼠固定于立体定位仪上。 
注意：必须确保小鼠在立体定位仪中固定牢固，颅骨表面与仪器底座平行，前囟点暴露良好，并在其右侧留出至少3 mm的操作空间。</li>
</ol>
3. 脑内出血手术
注意事项：在整个手术过程中，小鼠通过30%氧气、70%一氧化二氮和1-3%异氟烷进行麻醉，并使用温控加热垫持续维持体温在37 ± 0.5°C，通过直肠温度计进行监测。
<ol>
<li>将无菌的27号针头安装在固定于支架上的1 cc注射器上。</li>
<li>调节立体定位仪机械臂，使针头精确对准前囟点（bregma）。</li>
<li>调整机械臂，使针头位于前囟点外侧+2.5 mm处，并下降至颅骨表面。</li>
<li>手动旋转注射器，在颅骨表面钻出骨孔，同时轻柔下压支架，注意不要完全穿透颅骨。</li>
<li>取出针头，随后用手动方式完成骨孔的钻取 
注意：手动完成骨孔可立即感知内板是否已被穿透，从而最大限度降低针头意外插入脑实质的风险。</li>
<li>使用无菌手术刀在尾部腹侧做横向切口，使2–3滴较大的动脉血滴落在石蜡纸上，然后立即用无菌纱布加压止血。</li>
<li>用Hamilton注射器吸取17 μL血液，并将注射器安装到泵上。</li>
<li>调节立体定位仪机械臂，使其相对于垂直轴向内倾斜5°。</li>
<li>仔细调节立体定位仪机械臂，使针尖对准颅骨上的骨孔，然后将针下降3.5 mm。</li>
<li>等待2分钟后，将针上提0.5 mm（使针尖深度为3 mm）</li>
<li>等待5分钟，使脑组织围绕针道重新扩张，以减少注射过程中血液沿针道反流的风险。</li>
<li>以1 μL/分钟的速度注入7.5 μL血液。</li>
<li>等待5分钟，使血液初步凝固并允许组织发生位移，以尽量减少颅内压升高。</li>
<li>以1 μL/分钟的速度注入剩余的7.5 μL血液。</li>
<li>保持针头留置25分钟，以促进血液充分凝固 
注意：若未等待足够时间使血液凝固，在拔出针头时会导致血液从针道反流。</li>
<li>缓慢拔出针头，并立即用热水冲洗，防止针头内残留血液凝固，确保针头可重复使用。</li>
<li>将小鼠从支架上取下，使用兽用外科胶水封闭尾部和头皮切口。</li>
<li>关闭麻醉装置。</li>
<li>在持续保温条件下让小鼠苏醒，并提供可自由取用的湿润食物。</li>
<li>待小鼠完全清醒后，将其与同笼伙伴一起放回饲养笼中，并将湿润的食物颗粒置于笼底，以帮助动物取食。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2618/2618fig1.jpg" alt="小鼠脑出血检查；生物组织分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 小鼠脑出血手术后15分钟的脑冠状切片。处死后立即对脑组织进行检查，依据针头插入部位的冠状切面肉眼观察判断脑出血是否成功。若出血沿针道向下延伸至脑底部、向上超过胼胝体或进入脑室，则视为手术失败，该小鼠将被排除在所有分析之外。在50只小鼠中，总体脑出血成功率为75–85%，死亡率为0%。
<img src="/files/ftp_upload/2618/2618fig2.jpg" alt="小鼠在圆筒实验中的行为分析结果，偏侧性指数图，假手术组与脑出血组对比。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 圆筒实验显示右侧基底节脑出血（ICH）后出现左侧偏瘫。（A）ICH 手术后小鼠后肢站立行为的示例。注意在左侧基底节 ICH 后，仅有右侧前肢接触圆筒壁。（B）对 ICH 手术后小鼠群体（n=5）与假手术组（n=4）进行圆筒实验1的结果图。假手术组接受了除注射血液外的所有操作（将针头插入脑内但不注血）。每只小鼠被放置于直径为 12 cm 的透明玻璃圆筒中，观察其 20 次后肢站立行为。每次后肢站立时，记录前肢首次接触圆筒壁的位置。后续动作（如侧向探索）不计分，直到小鼠回到地面并开始下一次后肢站立才重新计分。偏侧性指数计算公式为：（右侧前肢接触次数 － 左侧前肢接触次数）／（右侧接触次数 ＋ 左侧接触次数 ＋ 双侧同时接触次数），其中 0 表示无前肢使用偏好，1 表示仅使用右侧前肢。

<ol><li>Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Tests+After+Intracerebral+Hemorrhage+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat.</a> Stroke. 33, 2478-2484 (2002).</li>
<li>James, M., Warner, D., Laskowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Models+of+Intracerebral+Hemorrhage%3A+A+Translational+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocritical+Care%22%5BJournal%5D)">Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective.</a> Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).</li>
<li>Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Model+of+Warfarin-Associated+Intracerebral+Hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage.</a> Stroke. 39, 3397-3404 (2008).</li>
<li>Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+hemorrhage+in+mice%3A+model+characterization+and+application+for+genetically+modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).</li>
<li>Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+intracerebral+hemorrhage+using+autologous+blood+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion.</a> Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).</li>
<li>Wang, J., Fields, J., Doré, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+improved+preclinical+mouse+model+of+intracerebral+hemorrhage+using+double+infusion+of+autologous+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood.</a> Brain Research. 1222, 214-221 (2008).</li>
<li>Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoma+resolution+as+a+target+for+intracerebral+hemorrhage+treatment%3A+Role+for+peroxisome+proliferator-activated+receptor+%CE%B3+in+microglia%2Fmacrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages.</a> Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本研究采用自体尾动脉血在小鼠中建立脑内出血的手术模型，可重复地模拟自发性基底节区出血。小鼠脑出血模型的优势在于可利用转基因动物研究发病机制；然而，由于小鼠体型较小，神经外科手术操作较大型动物更具技术难度。
胶原酶模型和自体血注射模型是两种已建立的实验性脑出血（ICH）模型。尽管胶原酶模型操作简便且出血高度可重复2，但其所用的细菌蛋白会降解基底膜，可能影响对固有炎症反应的研究。此外，在药理学（例如神经保护）实验中，胶原酶破坏的血脑屏障（BBB）可能非生理性地促进药物进入脑组织。近年来还开发出一种华法林相关性ICH模型3，可用于研究该类患者的出血扩展情况。自体血注射模型的优点包括：存在与占位效应相关的机械性损伤、体系无菌且不含外源性蛋白、可消除抗凝状态以研究自发性出血后自然的凝血与炎症通路，以及对出血量大小实现精确控制。由于所有小鼠的出血量相同，因此可在相对较小的样本量下，精确研究治疗干预对组织和功能结局的影响。
本文所述手术方法与其他已发表的自体血注射模型类似(4-7)，本方案中的多个...

<table><tbody><tr><td>用于小鼠神经外科手术的立体定位仪（St&amp;#8211;lting，51925）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量输注泵及控制器（UMP-3 和 Micro4，World Precision Instruments，佛罗里达州萨拉索塔）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠保温垫（St&amp;#8211;lting，50300）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸入式小鼠麻醉系统（Braintree Scientific，EZ-AF9000）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 &amp;mu;L 气密型硼硅酸盐玻璃哈密尔顿注射器，带涂层推杆，无针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>（Hamilton 公司，内华达州里诺，1702RN 注射器：765401，卡套：30949，垫片：30946）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>熔融石英针头，截断至 2 cm 长度（Hamilton，17739）</td><td></td><td></td><td>注：若每次手术前均进行灭菌处理，哈密尔顿注射器和熔融石英针头可多次重复使用。这些材料对防止血液凝固至关重要。</td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科手术服、头帽和口罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘（Betadine）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌 27 号针头（一次性使用）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌 1 cc 注射器（一次性使用）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cidex（戊二醛消毒液）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡和异氟烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡蜡纸方块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兽用外科胶（Vetbond，3M，明尼苏达州圣保罗）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

自体血注射法建立小鼠自发性脑内出血模型

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

研究脑出血（ICH）后损伤的病理生理学机制需要一种可重复的动物模型。尽管脑出血占所有中风病例的10-15%，但目前仍缺乏特异有效的治疗方法。小鼠自体血注射模型通过立体定位将动脉血注入基底节区，模拟人类自发性高血压性脑出血。随后可在活体中研究出血后的反应，并对神经行为学缺陷进行量化，从而描述继发性病理变化并评估潜在治疗药物。本方案所述操作采用双次注射技术，以最大限度降低血液沿针道反流的风险，泵送系统中不使用抗凝剂，并消除系统中所有死腔和可扩张的管路。

本方案中描述的小鼠自体血注射脑出血模型采用双次注射技术，以最大限度降低血液沿针道反流的风险，泵系统中不使用抗凝剂，并且消除了系统中的所有死腔和可扩张的管路。

脑内出血（ICH）后损伤病理生理学的研究需要可重复的动物模型。尽管ICH占脑卒中病例的10-15%……

本实验的总体目标是建立小鼠自发性脑内出血模型，以在活体中研究其持久性病理变化及神经行为学结果。首先需进行术前准备，包括剃除小鼠尾腹部及头皮的毛发并进行清洁。接下来，利用颅骨的解剖标志，在颅骨上精确地钻一个骨孔。第三步，从尾动脉采集血液，并通过立体定位注射至基底节区域。随后小心拔出注射针，缝合切口。最终，可通过免疫组织化学、流式细胞术、功能测试及其他方法获得显示局部炎症、细胞死亡以及神经功能缺损的结果。通常，刚接触该操作的研究人员会在血液凝固问题上遇到困难，因为注射的少量血液在完成注射所需的时间内会在系统中发生凝固。使用异氟烷诱导麻醉后，剃除头皮毛发，并用碘伏擦拭皮肤三次。接下来，用无菌凡士林涂抹动物的眼睛。待头皮干燥后，腹腔注射术后镇痛剂。使用无菌手术刀在头皮正中矢状位做一长约1厘米的纵行切口。切口应暴露颅骨的所有解剖标志。现在开始准备尾部，从尾根部起始处向远端腹侧剃除约一厘米的毛发。用碘伏擦拭剃毛区域三次，随后可将准备好的小鼠牢固地固定于立体定位仪中。颅骨表面应与框架底座平行。眶下缘应充分暴露，且眶下缘右侧至少保留三毫米。保持小鼠处于麻醉状态，并使用温控加热垫将其体温维持在37摄氏度。使用直肠温度计监测体温。现在开始进行颅内出血手术。首先，将无菌的27号针头连接到固定在立体定位仪上的1 CC注射器上。在支架上。将针头置于比BMA略外侧2.5毫米处，并与颅骨表面齐平。现在旋转注射器，开始在颅骨表面钻孔。对颅骨施加轻柔的向下压力进行操作。注意不要完全穿透颅骨。一旦钻孔开始，应将钻针从手臂上取下，转为手动完成后续步骤，以最大限度降低钻针刺入脑实质的风险，直至感觉到穿透颅骨内板为止。然后停止。接下来，在尾巴下方放置一张石蜡纸，沿剃毛区域做一横向切口，从尾部采集血样。将两到三滴较大的动脉血收集在石蜡纸上。然后用无菌纱布加压迅速止血。用 Hamilton 注射器吸取 17 µL 血液样本。将注射器连接至泵，并固定在立体定位仪手臂上。将立体定位臂固定在支架上。将立体定位臂相对于垂直轴向内侧倾斜五度。调整臂的位置，使针尖位于钻孔上方，然后降低针头。进入脑部3.5毫米。等待两分钟，然后将针头回撤0.5毫米，使针尖深度为3毫米。等待另外五分钟，使脑组织在针周围重新扩张，从而在注射过程中尽量减少血液经针道反流的风险。五分钟后，以每分钟1微升的速度注射7.5微升血液。注射后，再等待五分钟，以允许血液初步凝固和组织发生位移。这一操作实质上可最大程度减轻不可避免的颅内压升高。以每分钟1微升的相同速率，再次注入7.5微升血液。将针头留置原位25分钟，以使血液充分凝固。否则，在拔出针头时，血液会从针头穿刺部位反流。待血液凝固后，缓慢拔出针头。如果希望立即重复使用针头，需用热水冲洗，否则残留的血液会凝固，导致针头损坏。现在将小鼠从固定架上取下。使用兽用外科胶水闭合尾部和头皮切口。关闭麻醉设

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自体血液的注入模型小鼠自发性脑出血

为了进一步了解出血性卒中并研究新的治疗策略，需要建立具有临床相关性的脑出血（ICH）动物模型。在本研究中，我们描述并评估了两种ICH模型，这两种模型通过向小鼠基底节（纹状体）单侧注射自体全血或细菌胶原酶来实施。...

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来源：Tang, X. 等. 通过自体血双次注射建立桥脑大量出血模型. J. Vis. Exp.

通过自体血注射在大鼠模型中诱导桥脑大量出血

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胚胎期、新生期、成年期、脑内注射、寨卡病毒、神经系统疾病、小鼠模型

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