使用 BMP4 下游信号效应复合物的检测 原位 PLA，一种邻近连接检测技术

以下实验的总体目标是可视化并定量组织培养细胞中的BMP信号传导。BMP结合细胞表面的受体，并磷酸化三种Smad效应分子：Smad1、Smad5和Smad8。这些分子与Smad4形成复合物，并转位至细胞核，在细胞核中调控转录过程。

在此，我们采用 PLA 技术在组织培养细胞中可视化内源性 SMA 效应分子与 Smad4 在有或无 BMP 刺激条件下形成的复合物。该方法首先平行使用两种一抗，其中一种识别全部三种磷酸化的 SMA 效应分子，另一种识别 Smad4；随后加入称为 PLA 探针的二抗，每种二抗均连接有一条独特的短 DNA 链，这些二抗会结合至对应的一抗上。当 PLA 探针彼此靠近时，所连接的 DNA 链可通过后续加入的两条成环 DNA 寡核苷酸发生相互作用。

通过酶促连接将这些片段连接在一起，形成环状结构，在扩增反应后通过滚环复制进行扩增。标记的互补寡核苷酸探针杂交后可显示出与每个环化DNA产物扩增相关的荧光信号点，扩增产物易于观察。

在荧光显微镜下观察时，这些斑点对应于效应分子、SEDS 和 Smad4 之间的复合物，表明细胞内存在活跃的 BMP 信号传导。与现有方法相比，PLA 的主要优势在于操作简便、灵敏度高、无背景干扰，并可用于原位定量检测活跃的 BMP 信号传导。BMP 信号通路对于多种器官和组织的发育以及干细胞增殖与分化等过程至关重要。

PLA 可用于研究 BMP 信号通路的动力学、表达水平及亚细胞定位等关键问题，也可用于疾病诊断。由于该通路与多种疾病相关，BLA 可用于研究 BMP 或其他信号通路中的其他信号转导组分，并可调整用于组织切片或完整胚胎。开始原位邻近连接实验时，需准备细胞培养物：Neuro2a 细胞在添加了 10% FBS、1 倍非必需氨基酸、1 倍丙酮酸钠和 1 倍 L-谷氨酰胺的 GMEM 培养基中培养。

使用胰酶消化细胞，并将每孔15,000至20,000个细胞接种。在16孔板中，于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养细胞24小时。24小时后。

将培养基更换为添加了补充物的无血清GMEM，对照组继续培养两到三小时。第二次孵育后，保留三孔细胞在正常培养条件中。通过使用2 µM dorsa morphine处理细胞以抑制BMP通路，或使用BMP4处理细胞10至60分钟以激活信号通路。

细胞刺激后，从孔中吸去培养基，并用 PBS 轻柔洗涤细胞，以避免细胞脱落。切勿将 PBS 直接滴加到细胞上。然后吸去 PBS 并移除小室，但保留围绕孔周围的硅胶环。

向孔中加入 50 微升新鲜配制并过滤的 4% 多聚甲醛，室温下静置固定 10 分钟。固定后，在 Coplin 瓶中用 PBS 室温振荡洗涤细胞 5 分钟。重复洗涤两次，共洗涤三次。

接下来，将细胞置于含有0.5% Triton X-100的PBS中，在Coplin瓶内室温孵育10分钟，期间不进行震荡。随后用0.05% Tween 20和TB缓冲液洗涤细胞，在耦合瓶中每次洗涤5分钟，共洗3次，每次均需震荡。通过轻敲玻片以去除最后一次洗涤液，开始封闭步骤。

注意不要让细胞干燥。向每孔的封闭液中加入一滴DUO link，然后在37摄氏度的预热加湿环境中孵育细胞30分钟，加湿环境由一个装有蒸馏水的空移液枪头盒构成。

配制一抗溶液时，将抗磷酸化 SMAD1/5/8 和抗 SMAD4 抗体用 DuoLink 二抗稀释液分别稀释至 1:100。每种抗体可单独使用，也可联合使用。轻敲玻片以去除封闭液，然后向相应的孔中加入 40 微升抗体溶液，阴性对照孔中仅加入稀释液。

此步骤需快速完成，以免细胞干燥。将玻片置于预热的湿盒中，在 37 摄氏度下孵育一小时。孵育期间，用稀释液稀释两种 PLA 探针。

每种反应体系中加入八微升探针和24微升稀释液，使探针在溶液中按1:5比例稀释。室温下在耦合罐中振荡孵育一小时后，倾去一抗溶液，用Duo link洗涤缓冲液A将载玻片洗涤两次，每次五分钟。洗涤完成后，倾去载玻片上残留的洗涤缓冲液A，每张载玻片上加入40微升PLA探针溶液。

现在将载玻片置于预热的湿盒中，在37摄氏度下孵育。孵育一小时，同时将Duo Link连接至连接反应原液，并准备连接反应混合物体积。首先将Duo Link连接反应原液涡旋混匀，然后用高纯度水稀释至一倍浓度。

请注意，连接酶在此溶液中的添加比例为1:40，每孔需要40 µL混合液。孵育结束后，从玻片上轻轻倾去PLA探针溶液，并用洗涤缓冲液洗涤两次。在最后一次洗涤时，室温下于耦合瓶中振荡洗涤5分钟；同时，从冷冻区取出Duo link连接酶，加入连接反应液中，使其终浓度为1:40，随后涡旋混匀。

现在从载玻片上吸去洗涤缓冲液A的最后体积，每张载玻片加入40微升连接反应混合物。加入酶后轻轻混匀。将载玻片置于预热的湿盒中，37°C孵育30分钟。

在37摄氏度下解冻DUO连接扩增原液，并在孵育期间通过将DUO Link扩增原液用高纯度水稀释至1倍浓度来准备扩增步骤。试剂需避光保存，因其对光敏感。连接步骤完成后，弃去溶液，于室温下在耦合瓶中用洗涤缓冲液A振荡洗涤载玻片两次，每次两分钟；在最后一次洗涤时，向扩增溶液中加入DUO Link聚合酶，使其终稀释度为1:280，并涡旋混匀。弃去洗涤缓冲液后，向每个孔中加入40 µL扩增混合液，将载玻片置于预先加热的黑暗湿化 chamber 中，在37摄氏度下孵育100分钟。

扩增孵育完成后，从载玻片上轻轻甩去聚合酶溶液，然后在杂交罐中用洗涤缓冲液B洗涤两次，每次10分钟，洗涤过程中需避光，因为试剂对光敏感。两次洗涤后，再将载玻片浸入0.1倍的洗涤缓冲液B中一次。随后，彻底去除16孔载玻片上的硅胶，每孔加入约40微升的Duo溶液。

将带有封片剂的盖玻片轻轻覆盖在样本上，轻压使其下方无气泡，然后使用指甲油将盖玻片固定并密封在载玻片上，成像前至少静置15分钟。这些是细胞经2 µM dorsomorphin（BMP通路抑制剂）处理，或经25 ng/mL BMP4处理60分钟后的共聚焦图像。

使用针对磷酸化 Smad 1 58 和 Smad 4 的抗体来检测活化的 Smad 复合物，呈现为红色斑点。细胞核经 DAPI 染色呈蓝色。PLA 信号通过 DUO link image tool 软件进行计数，图中显示了每个细胞核内斑点的平均数量。

当单独使用任一抗时均未见染色，表明 PLA 探针无背景信号，且后续寡核苷酸连接反应未发生。同样，在另一项阴性对照实验中，即使同时使用两种一抗，也未检测到任何信号点。在 Neuro2a 细胞中，SDS-PAGE 免疫印迹显示未经处理及 BMP 处理的细胞均存在磷酸化相关的 SMAD1/5/8。

然而，经背侧吗啡处理的细胞中磷酸化 Smad 的水平显著降低。抗 PCNA 抗体用于上样对照。观看本视频后，您应充分了解如何遵循我们建议的步骤和设置，以便在细胞固定后的六小时内获得结果。

总之，这些步骤包括封闭、一抗孵育、PLA探针孵育、连接扩增以及封片成像。