Name: 复合植物代苜蓿truncatula /em用于检测结瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 学习利用发根农杆菌介导转化技术快速制备蒺藜苜蓿转基因复合植株，无需传统组织培养即可在数周内获得大量转基因根系，用于研究根瘤形成及植物-根瘤菌互作机制。

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作者谨此感谢 Chris Taylor 博士（俄亥俄州立大学）将毛根技术引入本实验室，感谢 Senthil Subramanian 博士（南达科他州立大学）、Zhang Juan 博士（中国山东鲁东大学）对本实验方案的改进。我们还感谢 Cheng Hao 博士（南京农业大学）在制作本视频过程中提供的帮助。本研究工作部分得到了美国能源部（DOE，项目号 DE-SC0001295）、美国国家科学基金会（NSF，项目号 MCB-0923779）和美国农业部（USDA，项目号 2010-65116-20514）向 O.Y. 提供的资助。

以下方案已用于在一种豆科模式植物中生成毛状根复合植株 M. truncatula. 类似的实验方案已适用于至少八种植物物种 1-4我们使用了 M. truncatula 毛状根复合植株用于研究根和根瘤发育中的基因功能。该实验方案分为四个部分：1）植物材料的准备；2）毛状根复合植株的构建；3）共生 根瘤菌 感染；以及4）转基因根系鉴定。我们使用了含有双元载体的 绿色荧光蛋白 (gfp)基因作为报告基因用于筛选嵌合植株中的转基因根 3与基于抗生素的筛选相比，基于GFP的筛选快速、简便且成本低廉。在我们的载体中，内质网表达优化的 gfp 该基因由超级泛素启动子驱动，在转基因根中产生强烈的组成型GFP信号，便于轻松区分转基因根与非转基因根。
1. 准备植物材料
<ol>
	<li>从温室种植的植株（50% 相对湿度，16/8 小时光照/黑暗，22/18°C 昼/夜温度）中收获 M. truncautla 种子。成熟种子可在 4°C 下保存。</li>
	<li>约 100 粒种子在 10 ml 浓硫酸（95–98%，Sigma-Aldrich，MO）中进行刻蚀处理，持续 10 分钟，并定期振荡。</li>
	<li>用无菌水轻轻振荡冲洗种子 5–7 次。</li>
	<li>将种子在室温水中浸泡 6 小时，随后置于 4°C 环境中 36–48 小时，以同步萌发。</li>
	<li>将约 20–30 粒种子均匀铺在放置于培养皿中的湿润滤纸上。在 22°C、16/8 小时光照/黑暗周期、光照强度为 40 μmol·m-2·s-1 的条件下培养 5–6 天。</li>
	<li>将已萌发的幼苗移栽至土壤中，并在温室中继续培养一个月。</li>
</ol>
2. 生成毛状根复合植株
<ol>
	<li>使用标准方法将携带目的基因的双元载体转化至A. rhizogenes中。我们构建了一系列含有gfp基因作为标记的双元载体，便于转基因组织的筛选。这些载体包含多种启动子，并均具有Gateway克隆位点（Invitrogen, Carlsbad, CA），可用于目的基因的过表达或沉默3,5。</li>
	<li>将A. rhizogenes在50 ml LB培养基中于28°C条件下培养16–24小时，培养基中需添加适当的抗生素进行筛选。</li>
	<li>收集菌体并重悬于无氮植物营养液中（表1及6），调整菌液浓度至OD600=0.3。</li>
	<li>为支持毛状根再生，将灭菌的支撑基质（“Rock Wool”，Hummert International, Earth City, MO）切成约3 cm3的块状。每个培养皿中放置4块。</li>
	<li>用移液器吸头在每块基质顶部打孔，以便插入外植体。向每块基质中加入5 mL A. rhizogenes菌液。</li>
	<li>通过斜切方式切取带有2–3个腋芽的茎段作为外植体。将外植体插入基质孔中，在22°C下培养约三周。前10天不浇水培养Medicago外植体，之后根据需要添加5 ml无氮营养液。我们发现去除顶端分生组织可能会减少不定根的形成。</li>
</ol>
3. 共生根瘤菌（Sinorhizobium Meliloti）侵染
<ol>
	<li>三周后，部分不定根将从岩棉中长出。将毛状根复合植株转移至沙子或蛭石（已灭菌）中，可保留或不保留岩棉。植株在温室中培养于 22°C，16/8 小时光照/黑暗循环，以及 300 μmol.-2。-1 再持续光照强度一周。</li>
	<li>在根瘤菌感染之前 S. meliloti 1201 在酵母提取物-甘露醇培养基中于 50 ml 条件下培养 7 天 30 °C （表2，以及 6,7).</li>
	<li>重新悬浮的根瘤菌细胞稀释至终浓度为OD600=0.08，使用无氮营养液。取10 ml新鲜悬浮液S. meliloti 每个复合植株均施用以诱导根瘤形成。</li>
</ol>
4. 转基因根鉴定
<ol>
	<li>接种根瘤菌两周后，通过水洗将复合植株拔出。根系可在水中轻松地与沙子或珍珠岩分离。</li>
	<li>我们将毛状根置于紫外显微镜下观察（Nikon SMZ1500，激发光波长 460-500 nm，分色镜 505 nm，阻断滤光片大于 510 nm）。转基因根呈 GFP 阳性，而不定根呈 GFP 阴性。随后根据 GFP 信号收集根系，统计根瘤数量，测量根长，并计算侧根密度。GFP 阴性根作为对照使用。</li>
</ol>
5. 代表性结果
在我们的实验中，外植体在接种A. rhizogenes后2-3周内长出新的毛状根。在紫外显微镜下，携带gfp基因的转基因根表现出强烈的绿色荧光（图1）。再生根的数量以及GFP阳性根的比例取决于外植体的状态和复合植株的生长环境。平均而言，所产生的根中有25%为转基因毛状根3。为提高转化效率，需注意以下两点：1）如视频所示，使用塑料罩足以在最初几天内维持培养托盘内的湿度，植株在最初几天仅需少量水分，过度浇水不利于毛状根的形成；2）农杆菌（Agrobacterium）接种液的浓度对转化至关重要，菌体数量过多不利于毛状根或根瘤的形成。对于根瘤的形成，浇灌溶液必须不含氮，否则将极少形成根瘤。
可以通过子叶或完整幼苗作为起始材料来获得毛状根复合植株。利用其他组织产生毛状根仅需对上述方案进行少量修改8。重要的是，每条毛状根均为一次独立的转化事件。因此，在单个复合植株中观察到的表型是多个转化事件共同作用的结果，需通过在多个复合植株中重复实验来加以验证。
 <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="荧光显微镜图像；A、B 显示真菌菌丝结构及高亮区域。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. A. 可从毛状根中筛选出转基因根。B. 毛状根复合植株中形成了根瘤。 我们将4周龄的M. truncatula毛状根植株置于紫外显微镜下，可轻松识别出GFP阳性根。（红色箭头：GFP根；黄色箭头：非GFP根）
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>储备液</td>
			<td>克/200毫升</td>
			<td>每升培养基添加储备液体积（毫升）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>12.3</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O</td>
			<td>14.7</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4.3H2O</td>
			<td>6.8</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>11</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3.6H2O</td>
			<td>0.49</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微量元素</td>
			<td>见下文</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>微量元素</td>
			<td>克/升</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>0.142</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4.H2O</td>
			<td>0.077</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>0.1725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>0.037</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4. H2O</td>
			<td>0.024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2. H2O</td>
			<td>0.0025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiSO4</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 无氮营养液
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>0.5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0.1g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>0.2g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酵母提取物</td>
			<td>0.4g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘露醇</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH=6.8</td>
			<td>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 酵母提取物甘露醇培养基（每升）

<ol><li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.</li>
<li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li>
<li>Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

产生毛状根复合植株是一种快速简便的方法，可用于获得大量双子叶植物的转基因材料。尽管该方法不能产生转基因种子，但可在数周内获得转基因材料。该方法特别适用于难以建立组织培养体系或获得稳定转化植株的植物。多年来，我们已利用该技术研究基因功能、启动子功能、微小RNA、主根及侧根发育、防御反应与非生物胁迫响应、结瘤及其他共生过程、激素响应、代谢谱分析、基因表达谱分析、蛋白质组学分析以及其他生物学过程。该实验方案稳定且可重复。

medicago truncatula 复合植株的制备及其在结瘤实验中的应用

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）类似，发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）也可基于其自主的根诱导（Ri）质粒将外源DNA转入植物细胞。A. rhizogenes 能在植物组织上诱导产生毛状根，并在转化后形成嵌合植株。在这些嵌合植株中，部分再生的根为转基因根，携带野生型T-DNA和人工构建的双元载体；而地上部的茎叶仍为非转基因组织，可为植株提供能量和生长支持。这些毛状根嵌合植株不会产生转基因种子，但其具有多项重要特性，使其在植物研究中极具应用价值。首先，发根农杆菌具有广泛的宿主范围，能够转化多种植物物种，尤其是双子叶植物，从而可在多种物种中实现遗传改造。其次，A. rhizogenes 可直接侵染植物组织和外植体，获得嵌合植株无需在转化前进行组织培养，因此特别适用于难以转化的植物物种。此外，转基因根组织可在数周内获得。对于蒺藜苜蓿（Medicago truncatula），我们可在短短三周内获得转基因根，比常规的拟南芥花序浸染法更快。总体而言，毛状根嵌合植株技术是一种灵活且实用的工具，可用于研究基因功能及与根相关的表型。本文将演示如何利用毛状根嵌合植株研究难转化物种 M. truncatula 中的植物-根瘤菌互作及结瘤过程。

我们展示了如何利用毛状根复合植株在难以转化的物种Medicago truncatula中研究植物与根瘤菌的相互作用及结瘤过程。

Medicago truncatula 复合植株的制备及其在结瘤实验中的应用

与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）类似，发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）也能基于其自主诱导根形成的（Ri）……将外源DNA转入植物细胞

大家好，我是来自丹植物科学中心的Oliver Yu。今天我们将向您展示如何通过农杆菌介导法培育Ute果酱植物。该技术由目前就职于俄亥俄州立大学的Chris Taylor博士引入丹中心。多年来，我的多位前课题组成员对这些技术进行了改进，如今，我现任课题组成员 Dr. Stone 和 Mao 制作了本视频，以展示哈利根复合植株的制备过程。农杆菌 ZOS 与根癌农杆菌非常相似，二者均可将外源 DNA 导入植物，但 ZOS 能够诱导野生型组织形成更多的根，从而产生如本例所示的复合植株。因此，在这些植株上，部分根为转基因组织，而地上部分仍为野生型。因此，该技术不会产生转基因种子。然而，高根癌农杆菌转化率植物具有三个主要优势，使得该技术非常有用。首先，许多植物物种，尤其是双子叶植物，可以通过根癌农杆菌进行转化。其次，我们在转化前无需建立组织培养。我们可以直接取用植物的多种部分，如幼苗、茎芽和子叶，以直接生成转基因植株。最后，我们可在数周内获得转基因根组织。对于大豆和百脉根的发根转化，我们最快可在三周内获得转基因根系，比OPIS转化方法更快。总体而言，发根植株技术是研究基因功能及根部相关表型的非常有用的工具。您好，我叫Ong。大家好，我叫，这位是我的摄像师比尔。今天我们将介绍Harry根复合植株实验方案。是的，我们在多个项目中都使用了该实验方案。我们已经开始了，是的。在本次演示中，我们将以芥菜苔（meta cargo Tula）为例。这些是成熟的芥菜苔豆荚。将荚果置于研磨盒中，然后用长而有力的动作研磨荚果。通过轻轻摇晃将种子与荚果分离，并将种子放入50毫升离心管中。然后加入5毫升浓硫酸。非常小心地进行划伤处理。耗时约10分钟。用酸涡旋振荡管子两到三次。在酸处理过程中，种皮会变为黄色。从离心管中去除硫酸，并用无菌水至少冲洗种子五次。将种子在室温下的去离子水中浸泡六小时，然后在4摄氏度下放置两天。为了同步萌发，将20至30粒种子均匀铺在培养皿中湿润的滤纸上。五到六天后，将萌发的种子移栽至土壤中，并在温室中继续生长四周。进行复合植株转化时，我们通常使用农杆菌Zony K599菌株。可按照标准的农杆菌肿瘤诱导转化方案，将穿梭载体或双元载体转化至K599菌株中。接种农杆菌后，在30摄氏度下培养16至24小时。培养结束后，将菌液转移至50毫升离心管中，离心收集菌体。在5,000 G条件下离心30分钟。用无氮营养液重悬沉淀。确保将农杆菌细胞稀释至OD 600为0.3。该浓度对于实现最高转化效率至关重要。我们使用岩壁作为支撑基质。使用这种材料对于实现高频转化至关重要。将岩棉壁切割成合适大小的插块，在顶部打一个直径约1.5至2厘米的孔。使用移液器吸头，向每个插块中加入5毫升重悬的农杆菌Zony溶液。选择一段带有两到三个侧芽的茎，斜向切割。将茎段插入岩壁的孔洞中。将扦插的植物置于培养室或实验台中培养三周。每10天向每个育苗块中加入5毫升营养液。三周后，根部将从切割面再生。将植株浸泡在水中。小心去除软化的岩壁，避免损伤根部。务必彻底清除所有岩壁。可将毛状根复合植株转移至沙子或珍珠岩中进行共生实验，在30°C条件下，于酵母提取物甘露醇培养基中培养根瘤菌七天。收集zoia细胞并重悬。用无氮营养液重悬沉淀物，并将溶液稀释至OD 600为0.08。向每个复合植株培养物中加入10毫升ZOA溶液，继续培养植株额外两到三周，以允许根瘤形成。通过拔出并清洗复合植株以去除沙子。利用绿色荧光蛋白表达来检测转基因根。您将使用荧光显微镜进行此项操作。我们所有的毛状根载体均含有一个组成型表达的GFP表达盒，用于筛选转基因株系。此图片显示的是在荧光显微镜下观察到的表达GFP的毛状根复合植株。具有更亮绿色荧光的转基因根易于与非转基因根区分开来。在复合植株的毛状根中形成了根瘤。以下是完整的实验方案。再次强调，产生毛状根复合植株是一种快速且简便的方法，可用于获得大量转基因组织，尤其适用于双子叶植物。尽管该方法无法获得转基因种子，但可在数周内产生转基因材料。该方法特别适用于那些难以建立组织培养和遗传转化体系的植物。多年来，我们利用该技术研究了基因功能、启动子功能、微小RNA（microRNA）、主根及侧根发育、防御反应与抗生素胁迫响应、结瘤及其他共生过程。我们还利用转基因嵌合根系植株，开展了激素响应、代谢谱分析、基因表达谱分析以及蛋白质组学分析。我们希望本视频能够帮助您将该系统应用于您所关注的物种。如有与此技术相关的问题，欢迎随时与我们联系，祝您顺利。

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