Medicago truncatula 复合植株的制备及其在结瘤实验中的应用

大家好，我是来自丹植物科学中心的Oliver Yu。今天我们将向您展示如何通过农杆菌介导法培育Ute果酱植物。该技术由目前就职于俄亥俄州立大学的Chris Taylor博士引入丹中心。

多年来，我的多位前课题组成员对这些技术进行了改进，如今，我现任课题组成员 Dr. Stone 和 Mao 制作了本视频，以展示哈利根复合植株的制备过程。农杆菌 ZOS 与根癌农杆菌非常相似，二者均可将外源 DNA 导入植物，但 ZOS 能够诱导野生型组织形成更多的根，从而产生如本例所示的复合植株。因此，在这些植株上，部分根为转基因组织，而地上部分仍为野生型。

因此，该技术不会产生转基因种子。然而，高根癌农杆菌转化率植物具有三个主要优势，使得该技术非常有用。首先，许多植物物种，尤其是双子叶植物，可以通过根癌农杆菌进行转化。

其次，我们在转化前无需建立组织培养。我们可以直接取用植物的多种部分，如幼苗、茎芽和子叶，以直接生成转基因植株。最后，我们可在数周内获得转基因根组织。

对于大豆和百脉根的发根转化，我们最快可在三周内获得转基因根系，比OPIS转化方法更快。总体而言，发根植株技术是研究基因功能及根部相关表型的非常有用的工具。您好，我叫Ong。

大家好，我叫，这位是我的摄像师比尔。今天我们将介绍Harry根复合植株实验方案。是的，我们在多个项目中都使用了该实验方案。

我们已经开始了，是的。在本次演示中，我们将以芥菜苔（meta cargo Tula）为例。这些是成熟的芥菜苔豆荚。

将荚果置于研磨盒中，然后用长而有力的动作研磨荚果。通过轻轻摇晃将种子与荚果分离，并将种子放入50毫升离心管中。然后加入5毫升浓硫酸。

非常小心地进行划伤处理。耗时约10分钟。用酸涡旋振荡管子两到三次。

在酸处理过程中，种皮会变为黄色。从离心管中去除硫酸，并用无菌水至少冲洗种子五次。将种子在室温下的去离子水中浸泡六小时，然后在4摄氏度下放置两天。

为了同步萌发，将20至30粒种子均匀铺在培养皿中湿润的滤纸上。五到六天后，将萌发的种子移栽至土壤中，并在温室中继续生长四周。

进行复合植株转化时，我们通常使用农杆菌Zony K599菌株。可按照标准的农杆菌肿瘤诱导转化方案，将穿梭载体或双元载体转化至K599菌株中。接种农杆菌后，在30摄氏度下培养16至24小时。培养结束后，将菌液转移至50毫升离心管中，离心收集菌体。

在5,000 G条件下离心30分钟。用无氮营养液重悬沉淀。确保将农杆菌细胞稀释至OD 600为0.3。

该浓度对于实现最高转化效率至关重要。我们使用岩壁作为支撑基质。使用这种材料对于实现高频转化至关重要。

将岩棉壁切割成合适大小的插块，在顶部打一个直径约1.5至2厘米的孔。使用移液器吸头，向每个插块中加入5毫升重悬的农杆菌Zony溶液。

选择一段带有两到三个侧芽的茎，斜向切割。将茎段插入岩壁的孔洞中。将扦插的植物置于培养室或实验台中培养三周。

每10天向每个育苗块中加入5毫升营养液。三周后，根部将从切割面再生。将植株浸泡在水中。

小心去除软化的岩壁，避免损伤根部。务必彻底清除所有岩壁。可将毛状根复合植株转移至沙子或珍珠岩中进行共生实验，在30°C条件下，于酵母提取物甘露醇培养基中培养根瘤菌七天。

收集zoia细胞并重悬。用无氮营养液重悬沉淀物，并将溶液稀释至OD 600为0.08。

向每个复合植株培养物中加入10毫升ZOA溶液，继续培养植株额外两到三周，以允许根瘤形成。通过拔出并清洗复合植株以去除沙子。利用绿色荧光蛋白表达来检测转基因根。

您将使用荧光显微镜进行此项操作。我们所有的毛状根载体均含有一个组成型表达的GFP表达盒，用于筛选转基因株系。此图片显示的是在荧光显微镜下观察到的表达GFP的毛状根复合植株。

具有更亮绿色荧光的转基因根易于与非转基因根区分开来。在复合植株的毛状根中形成了根瘤。以下是完整的实验方案。

再次强调，产生毛状根复合植株是一种快速且简便的方法，可用于获得大量转基因组织，尤其适用于双子叶植物。尽管该方法无法获得转基因种子，但可在数周内产生转基因材料。该方法特别适用于那些难以建立组织培养和遗传转化体系的植物。

多年来，我们利用该技术研究了基因功能、启动子功能、微小RNA（microRNA）、主根及侧根发育、防御反应与抗生素胁迫响应、结瘤及其他共生过程。我们还利用转基因嵌合根系植株，开展了激素响应、代谢谱分析、基因表达谱分析以及蛋白质组学分析。我们希望本视频能够帮助您将该系统应用于您所关注的物种。

如有与此技术相关的问题，欢迎随时与我们联系，祝您顺利。