Name: 单细胞的转录组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习使用微吸管技术从大鼠原代神经元培养物中分离单细胞，结合aRNA扩增进行转录组分析。该方法可揭示单个神经元间的基因表达差异，适用于PCR和下一代测序等应用。

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感谢 Kevin Miyashiro 在细胞培养的铺板与维护方面的工作，感谢 Terri Schochet 博士为本文所含图片提供细胞培养样本。此外，感谢 Kevin Miyashiro、Peter Buckley 博士和 Tiina Pertiz 对 aRNA 实验步骤提出的建议。本研究的资助来自美国国家老龄化研究所、美国国家精神卫生研究所以及宾夕法尼亚州人力资源事实调查基金。

1. 细胞培养
本实验室在以下实验中使用原代大鼠海马神经元培养物。下文描述的是用于建立和维持这些细胞培养物的改良Banker法9。当然，这些细胞培养技术存在大量不同的操作变体，任何针对特定实验室需求而优化、并能持续提供健康细胞的成熟方法均可作为合适的替代方案。
<ol>
 <li>将五个经高压灭菌的圆形12 mm盖玻片放入35 mm培养皿中，用含80 μg/mL聚-D-赖氨酸（分子量70-150,000）的硼酸盐缓冲液过夜（O/N）包被，用细胞培养级水冲洗，再用1 μg/mL层粘连蛋白（Laminin）的硼酸盐缓冲液过夜（O/N）包被，然后再次用水冲洗。加入NG培养基（含Earle's盐和GlutaMAX的MEM，补充葡萄糖（0.6% w/v）、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）和马血清（10% v/v）），将培养皿置于培养箱中（37°C，5% CO2）保存。PDL150/层粘连蛋白作为分离神经元单层生长的基质。盖玻片可在接种前最多两周内完成包被。</li>
 <li>接种当天，将来自胚胎第18天大鼠海马的原代神经元以100,000个细胞/mL的悬液浓度接种于NG培养基中，每皿加入1.5 mL。接种后4至6小时，每35 mm培养皿加入0.75 μL的5 mM阿糖胞苷（cytosine beta-D-arabinofuranoside, ara-C），以抑制任何污染性胶质细胞的生长。24小时后，更换为含Earle's盐和L-谷氨酰胺的MEM培养基，补充0.6% w/v葡萄糖、1 mM丙酮酸钠和B27。细胞需培养至少两周后方可用于实验，以确保神经突起的充分发育。</li>
</ol>
2. 准备移液管
关于RNase的注意事项：皮肤、唾液甚至呼吸都是RNase（降解RNA的酶）的主要来源。从本实验方案的这一步开始，必须严格遵守无RNase操作技术，以防止样品被RNase污染而导致RNA降解。这包括操作样品和试剂时始终佩戴手套，不得在样品或试剂上方讲话，以及使用全新的无菌移液器吸头和离心管。通常，未专门指定用于RNA实验的移液器可通过使用RNase去除溶液（如RNase AWAY（Molecular Bioproducts））擦拭进行去污染。然而，这些溶液会抑制后续的酶促反应，因此也必须注意避免样品被这些处理溶液污染。
<ol>
 <li>将外径（O.D.）为 1.5 mm 的玻璃移液管进行高压灭菌。</li>
 <li>使用微量移液管拉制仪将移液管拉至适合电生理记录的直径，具体尺寸可能因所用拉制仪、加热丝和移液管的不同而有所调整10。由于在细胞采集前会将尖端折断，因此内径大小并不十分关键。</li>
 <li>将移液管小心存放于无尘环境中，确保其尖端保持完整（建议使用微量移液管储存罐）。</li>
 <li>为实现对尖端的可控折断，用一只手将擦拭纸（kimwipe）绷紧，另一只手将移液管尖端极其轻柔地在纸上划过 1 至 2 次。所形成的开口直径应约为目标细胞大小的 75–100%。请根据实际效果调整操作，直至达到理想开口尺寸。</li>
</ol>
3. 培养物、试管和显微镜的准备
<ol>
 <li>准备所需数量的 1.7 mL Eppendorf 管。每管中加入 2 μL PBS，若收集的材料将用于单细胞扩增，则加入第一条链缓冲液，或加入其他适用于储存收获材料的溶液。</li>
 <li>进行细胞收集时，需使用配备 40 倍物镜和显微操作器的光学显微镜。使用带有柔性管路的移液器支架，并将管路固定在稳定表面上，以防止收集过程中移液器发生不必要的移动。在管路末端插入一根针头，以便连接带有鲁尔锁扣的 1 mL 注射器，并可在不同操作者之间更换注射器。</li>
 <li>若使用盖玻片，请一次仅处理一张盖玻片。如有必要，将单张盖玻片转移至新的含有 PBS 或选定培养基的 35 mm 培养皿*中。细胞离开培养箱的时间越长，其状态将越不健康，mRNA 表达谱也将越偏离健康细胞的状态。在不操作时，务必将其他盖玻片保持在培养箱内，以维持细胞的健康状态。细胞在培养箱外的操作应尽可能迅速。</li>
</ol>
*使用我们的装置时，必须使用35 mm培养皿的盖子，因为培养皿的实际侧壁过高，会阻碍微量移液器向盖玻片方向正常推进。
4. 收集细胞
<ol>
 <li>将微量移液器固定在移液器支架上，并将支架安装到显微操作仪的插槽中。设置40倍物镜。</li>
 <li>将培养皿置于显微镜载物台上，找到适合采集的细胞区域。对于原代神经元培养物，目标细胞应相对孤立于邻近细胞，以避免采集到周围细胞和/或突起。胞体与突起之间的mRNA转录本群体存在差异，因此若仅关注胞体mRNA，需特别注意防止突起污染胞体样本。将拟采集的细胞置于视野中央。</li>
 <li>使用显微操作仪将微量移液器向前推进至培养皿溶液中并进入光路。将移液器尖端下放至溶液内。从此刻起，通过注射器轻轻吹气施加正压。通过目镜观察，移液器应在视野中呈现为阴影。在远高于细胞焦平面的位置，调整移液器尖端位置，使其进入视野，并使用粗调焦旋钮对准尖端进行聚焦。此时应评估移液器孔径是否过大或过小。通过练习采集操作，可逐步掌握在此阶段判断是否已获得合适孔径的能力。</li>
 <li>现在，将移液器向细胞所在焦平面推进。注意不可过快推进尖端，以免其在拟采集区域断裂。为避免此情况，应在使用显微操作仪推进移液器尖端前，先通过粗调焦旋钮移动焦平面。当接近细胞时，改用细调焦旋钮，直至细胞与移液器尖端均清晰聚焦。在接近细胞平面之前停止施加正压，以防将细胞吹离盖玻片。</li>
 <li>使用显微操作仪调整移液器尖端位置，使其接触拟采集的细胞胞体。</li>
 <li>通过注射器用嘴施加轻柔吸力，直至细胞进入移液器尖端。若细胞未进入移液器，可轻微将尖端向细胞靠近并下压，直至细胞从盖玻片上脱离并被吸入。</li>
</ol>
5. 拯救细胞
<ol>
 <li>使用显微操作仪立即将移液管向上移出溶液。</li>
 <li>从移液管架上取下移液管。</li>
 <li>用一只手握住1.7 mL Eppendorf管，另一只手轻轻在管壁底部附近将移液管尖端折断。（目标位置为0.1 mL刻度处。）</li>
 <li>将折断的移液管尖端居中置于管内，将连接1-3 mL注射器的针头插入移液管顶部开口。迅速推动注射器活塞，使移液管内的溶液喷射入管中。细胞应保留在移液管最尖端，此操作足以有效排出细胞。注意不要让移液管尖端接触管壁上的液体，否则毛细作用会将液体重新吸入移液管内。</li>
 <li>迅速使用台式微量离心机离心管内内容物，随后立即冷冻（-80°C保存）或置于冰上以备后续处理（推荐做法）。</li>
</ol>
6. aRNA 扩增
<ol>
 <li>第一轮第一链 cDNA 合成： 
 创建 mRNA/cDNA 杂交体。
 <ol>
 <li>对于每一个 5 μL 单细胞收集体积的1倍体积，向收集管（置于冰上）中加入以下试剂。反应体系可根据较大的收集体积进行相应放大（2倍体积时按2倍比例放大） 10 μL 收集体积等）。通过将以下试剂乘以收集管的数量再增加10-20%以弥补移液误差，配制主混合液。aRNA扩增程序中的每一步后续反应均需如此操作。
 <ul>
 <li>冰上</li>
 <li>1.2 μL dNTP（各2.5 mM）</li>
 <li>2.4 μL 5x 第一链缓冲液</li>
 <li>0.3 μL T7-寡聚(dT)引物（100 ng/μL）μL)</li>
 <li>1.2 μL DTT（100 mM）</li>
 </ul>
 </li>
 <li>加液体至终体积 10.25 μL 用无核酸酶水。用移液器吹打混匀，然后使用微量离心机短暂离心。</li>
 <li>孵育5分钟 70°C 以变性mRNA的任何二级结构。立即将其置于冰上至少5分钟。</li>
 <li>再次使用主混合液添加：
 <ul>
 <li>0.3 μL RNasin（40 U/μL)</li>
 <li>0.45 μL Superscript III (200 U/μL)</li>
 <li>1 μL 无核酸酶水</li>
 </ul>
 </li>
 <li>移液混匀，短暂离心。在1小时温育 42°C.</li>
 <li>孵育于 70°C 孵育15分钟以灭活Superscript。继续进行下一步操作。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>第一轮第二链 cDNA 合成 
 从 mRNA/DNA 杂交体的 mRNA 部分生成 RNA 引物，以促进双链 cDNA 的合成。
 <ol>
 <li>
 <ul>
 <li>置于冰上</li>
 <li>加入到 12 μL 第一链反应，加入：</li>
 <li>8 μL 无核酸酶水</li>
 <li>5.6 μL 5x 第二链缓冲液</li>
 <li>0.75 μL dNTP 混合液（每种 2.5 mM）</li>
 <li>0.25 μL DNA连接酶（10 U/μL)</li>
 <li>1 μL DNA聚合酶I（10 U/μL)</li>
 <li>0.25 μL RNase H（2 U/μL）μL)</li>
 </ul>
 用移液器充分混匀，短暂离心。在2小时内孵育 16°C.</li>
 <li>添加： 1 μL T4 DNA聚合酶（5 U/μL）。用移液器混匀并短暂离心。继续在原温度下孵育10分钟 16°C.</li>
 <li>使用 Qiagen MinElute 试剂盒，按照生产商说明书进行反应产物纯化，仅作轻微修改： 11 洗涤 2 次 500 μL 用洗液缓冲液替代仅洗涤一次 750 μL用无核酸酶水洗脱。</li>
 <li>浓缩至2-4 μL 使用Speedvac或乙醇沉淀法进行浓缩。对于乙醇沉淀，糖原作为核酸载体，适用于沉淀少量DNA或RNA。乙酸钠中的钠离子有助于中和DNA骨架的负电荷，促进沉淀。常规沉淀操作中无需配制预混液。
 <ul>
 <li>添加 40 μL DEPC 水</li>
 <li>1 μL 糖原（3 mg/mL）</li>
 <li>1/10 体积（3 μL3 M 醋酸钠</li>
 <li>2.5 体积（约125 μL冷的100%乙醇</li>
 </ul>
 充分混匀，在 -80°C （30 分钟至过夜）</li>
 <li>离心20分钟 4°C.</li>
 <li>去除上清液，并用缓冲液洗涤沉淀 800 μL 70% 乙醇。务必通过移液或涡旋充分悬浮沉淀，以帮助去除多余的盐。</li>
 <li>再次离心20分钟，转速为 4°C. 去除上清液和空气。</li>
 <li>重悬于 4 μL 的无核酸酶水。储存于 -20 或 -80 °C 或继续进行下一步。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>第一轮 体外 体外转录（IVT）： 
 从整合到双链cDNA中的T7启动子合成反义RNA。
 <ol>
 <li>该反应使用 Ambion MEGAscript T7 试剂盒，按照生产商说明书进行操作，但按比例缩放至 10 μL 而不是一个 20 μL 反应。12 必须在室温下组装该反应，并在组装过程中保持缓冲液处于室温。若提供的缓冲液温度过低（冰冻），会导致DNA沉淀。NTPs和酶混合物在不使用时应置于冰上保存。
 <ul>
 <li>在室温下</li>
 <li>将重悬的双链 cDNA 转移至薄壁 PCR 管中。</li>
 <li>添加 4 μL NTP 混合液（每种 18.75 mM）</li>
 <li>1 μL 10x 反应缓冲液</li>
 <li>1 μL 10x 酶混合液</li>
 </ul>
 </li>
 <li>孵育14小时，温度为 37°C 在热循环仪（推荐）或培养箱中。</li>
 <li>该反应可通过两种不同方法进行纯化，随后使用Speedvac或乙醇沉淀对样品进行浓缩。若使用试剂盒进行纯化，请参见方法A；若采用标准的酚/氯仿抽提法进行纯化，请参见方法B。</li>
 <li>方法 A：
 <ol type="a">
 <li>使用 AMBION Megaclear 试剂盒按照生产商说明书进行反应体系纯化，但需进行部分修改13：用……洗涤2次 500 μL 洗涤缓冲液，而非仅洗涤1次 750 μL洗脱步骤中，加入 50 μL 向柱子中心加入无核酸酶水，孵育于 70 °C 10分钟。在10,000g下离心1分钟。在新的离心管中重复操作。合并洗脱液。将样品浓缩至2-4 μL 使用Speedvac或乙醇沉淀法。</li>
 <li>乙醇沉淀时：此处使用乙酸铵替代乙酸钠，因其能有效防止游离核苷酸与核酸共沉淀。这一点尤为重要，因为体外转录（IVT）反应中使用的NTP浓度较高，可能抑制后续反应。
 <ul>
 <li>2 μL 糖原（5 mg/mL）</li>
 <li>0.1 体积（10 μL5 M 醋酸铵</li>
 <li>2.5 体积（约275 μL) 冷乙醇</li>
 </ul>
 </li>
 <li>-80 °C 沉淀80°C （30 分钟至过夜）。*</li>
 <li>离心20分钟，转速为 4°C.</li>
 <li>去除上清液，并用缓冲液洗涤沉淀 800 μL 70% 乙醇（溶于无核酸酶水中）。务必充分悬浮沉淀，以去除所有过量盐分。</li>
 <li>再次离心20分钟，转速为 4°C.</li>
 <li>移除上清液并空气干燥。</li>
 <li>重悬沉淀于 4 μL 无核酸酶水 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>方法B：
 <ol type="a">
 <li>或者，可用标准的苯酚/氯仿抽提法对aRNA进行纯化。
 <ul>
 <li>添加 90 μL DEPC 水</li>
 <li>2 μL 糖原（5 mg/mL）</li>
 <li>0.1 体积（10 μL5 M 醋酸铵</li>
 <li>1 个体积 (100 μL苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1（平衡至 pH 7.8–8.0）</li>
 </ul>
 </li>
 <li>涡旋15秒。在台式微量离心机中以半最大速度离心1.5分钟。将上层水相转移至含有2.5体积（245 μL) 冷乙醇。</li>
 <li>-20℃沉淀80°C （30 分钟至过夜）</li>
 <li>离心20分钟，转速为 4°C.</li>
 <li>移除上清液，并用缓冲液洗涤沉淀 800 μL 70% 乙醇（溶于无核酸酶水中）。务必充分悬浮沉淀物，以去除所有过量盐分。</li>
 <li>再次离心20分钟，转速为 4°C.</li>
 <li>移除上清液并空气干燥。</li>
 <li>重悬沉淀于 4 μL 无核酸酶水 样品在此温度下过夜孵育时可能会结冰。已有研究表明，这实际上可增加核酸的得率。</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
<ol start="4">
 <li>第二轮第一链 cDNA 合成
 <ol>
 <li>
 <ul>
 <li>冰上</li>
 <li>添加 1 μL 随机引物（0.05 mg/mL）*</li>
 </ul>
 </li>
 <li>加热至 70°C 10 分钟。立即置于冰上，至少 5 分钟。</li>
 <li>
 <ul>
 <li>添加 2 μL 5x 第一链缓冲液</li>
 <li>1 μL DTT（100 mM）</li>
 <li>0.5 μL dNTP（各2.5 mM）</li>
 <li>0.5 μL RNasin（40 U/μL)</li>
 <li>1 μL Superscript III (200 U/μL)</li>
 </ul>
 </li>
 <li>用移液器充分混匀，短暂离心。室温下静置10分钟。此步骤旨在反转录反应开始前，确保短随机引物充分延伸。</li>
 <li>37 °C孵育30分钟 42°C.</li>
 <li>加热5分钟 95°C 以变性DNA/RNA杂交体中的RNA。置于冰上至少5分钟。储存于-20°C 或 -80°C 或立即进入下一步。 随机引物的浓度非常重要。如果浓度过高，每轮扩增产物将出现更多的截短。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>第二轮第二条链 cDNA 合成
 <ol>
 <li>
 <ul>
 <li>置于冰上</li>
 <li>添加 2 μL T7-oligo(dT) 引物（10 ng/μL）μL)*</li>
 </ul>
 </li>
 <li>5分钟内加热至 70°C立即置于冰上至少5分钟。短暂离心。</li>
 <li>
 <ul>
 <li>添加 43.5 μL 无核酸酶水</li>
 <li>15 μL 5x 第二链缓冲液</li>
 <li>1.5 μL dNTP 混合液（各 2.5 mM）</li>
 <li>2 μL DNA聚合酶I（10 U/μL)</li>
 </ul>
 </li>
 <li>用移液器充分混匀，短暂离心。在2小时温育 16°C.</li>
 <li>添加 2 μL T4 DNA 聚合酶（5 U/μL)</li>
 <li>用移液器充分混匀，短暂离心。再于室温孵育10分钟 16°C.</li>
 <li>使用Qiagen Minelute试剂盒按照第6.2.3节的方法纯化反应产物。</li>
 <li>浓缩至2-4 μL 使用Speedvac或乙醇沉淀法，如6.2.4至6.2.8节所述。 *注意T7-oligo(dT)引物的储存浓度与第一轮第二链cDNA合成时的不同。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>第二轮 体外 转录 操作步骤同第6.3节。
 <ol>
 <li>重复第6.4至6.6节所需次数。需注意，每一轮后续扩增均会导致aRNA产物变短，因此应限制扩增轮数。通常，进行两到三轮扩增即可将单个细胞中提取的材料扩增至足以用于微阵列分析的量。若进行微阵列分析，第三轮体外转录（IVT）反应应按照生产商说明书使用Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit进行。该程序将生物素标记的UTP掺入aRNA，随后用于微阵列芯片上的检测。</li>
 <li>使用 Nanodrop 或配备 Nano RNA 试剂盒的 Agilent Bioanalyzer 测定第三轮 aRNA 的浓度。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
7. 代表性结果
根据操作熟练程度，从原代神经元培养物中成功分离单个细胞可在不到2分钟内完成（见图1）。然而，不同系统之间以及受实验操作干扰时，分离所需时间会有所差异。将单个细胞进行aRNA扩增（见图4A和4B）后，可获得微克级的总扩增aRNA，在生物分析仪检测中呈现特征性的宽峰（见图3）。三轮扩增最快可在三天内完成，从而实现对单细胞基因表达的快速分析。
<img src="/files/ftp_upload/2634/2634fig1.jpg" alt="使用微移液管技术进行神经元显微观察的三图示例。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 显示的是成功分离单个神经元的示例。我们选择了一个相对低密度的区域（A），并将移液管尖端移向目标细胞（B）。第三幅图像（C）展示了细胞被分离后的视野。请注意，周围的突起仍保留在盖玻片上。
<img src="/files/ftp_upload/2634/2634fig2.jpg" alt="神经元细胞电生理学、玻璃微电极装置、显微镜图像、神经活动分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
 图2. 所示为两个微电极尖端的图像，其尺寸均不适合有效收获细胞。这些电极尖端将分别导致收获不完全（A）和收获到周围环境成分（B）。
<img src="/files/ftp_upload/2634/2634fig3.jpg" alt="RNA分析结果，图示与电泳条带：RNA浓度249 ng/μl，纯度已验证。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
 图3. 收获并扩增后，建议使用生物分析仪对扩增RNA的分布情况和数量进行分析。由单细胞材料成功扩增得到的RNA总量通常在低微克水平，其分布图谱应平滑且宽广。
<img src="/files/ftp_upload/2634/2634fig4.jpg" alt="基因编辑工作流程。带有T7启动子、DNA聚合酶和逆转录酶的RNA转录示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4. 显示了aRNA实验的第一轮（A）和第二轮（B）的示意图。

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<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
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</ol>

Eberwine 博士是 aRNA 专利的发明人，该专利已授权给 LBS Technologies 公司，而 Eberwine 博士是该公司的股东。

注意事项与故障排除
<ul>
<li>在分离目标细胞前后，建议拍摄图像，以显示目标细胞已被成功分离，且周围的半暗带区域保持未受干扰。</li>
<li>若在收集过程中有过多溶液进入移液管，可使用三通鲁尔锁接头，并利用注射器推杆在管路中维持正压。所需体积因处理类型而异，但大多数应用中不超过 5 μl 即可。</li>
</ul>
分子生物学技术的一般提示
<ul>
<li>在将试剂加入反应体系前，需对所有母液管进行涡旋振荡并短暂离心。切勿对酶类进行涡旋振荡。</li>
<li>在加入酶之前，应充分混匀反应体系，以确保缓冲液浓度达到所需水平。</li>
<li>若条件允许，应使用分层冷却器（stratacooler）将酶母液保存在 -20°C；否则应在使用前立即取出，置于冰上，并在使用后立即放回 -20°C 保存。</li>
<li>在准备多个反应时，应始终配制主混合液（master mix），以减少移液误差。根据样本数量计算所需体积，并额外增加 10–20%。</li>
<li>将 RNA 储存于 -80°C 以延缓其降解。在缓冲液中储存 RNA 可使其保持最稳定状态，从而减缓在酸性条件下发生的 RNA 脱嘌呤反应。</li>
</ul>
aRNA 实验流程的总体概述
图4A展示了aRNA实验的第一轮过程。在第一链反应中，T7-oligo(dT)引物的poly-T部分通过结合mRNA的polyA尾，选择性地捕获mRNA分子（长白色矩形）。部分microRNA也具有多聚腺苷酸化修饰，因此也会被该方法捕获。然而更重要的是，细胞中最丰富的RNA——核糖体RNA——则不会被此方法捕获。该引物可作为逆转录酶的启动子，以mRNA为模板合成互补的cDNA链（长灰色矩形）。T7-oligo(dT)引物中的T7序列部分将T7 RNA聚合酶启动子整合到与原始mRNA序列反向互补的序列中，该结构将在后续的体外转录反应中发挥作用。
接下来，上一步骤中生成的 mRNA/DNA 杂交链中的 mRNA 被 Rnase H 部分水解，形成类似于滞后链 DNA 合成过程中产生的冈崎片段的 RNA“引物”（小白色矩形）。DNA 聚合酶 I 利用这些 RNA 片段作为引物，以与 mRNA 互补的 DNA 为模板启动 DNA 合成。当其到达下一个 RNA 片段时，通过其 5' 至 3' 核酸酶活性切除核糖核苷酸，并以脱氧核糖核苷酸取而代之。随后加入 DNA 连接酶，连接那些替换尚未完全完成的链段。再加入 T4 DNA 聚合酶，填补 RNA 片段最初作为 DNA 聚合酶 I 引物所留下的空缺区域，从而生成平末端的双链 cDNA，随后在进行体外转录（IVT）反应前对该产物进行纯化。
在体外转录（IVT）反应中，T7 RNA聚合酶结合到双链cDNA中所包含的T7启动子，并以正义链为模板合成反义RNA分子（长黑色矩形）。此步骤实现了扩增，即从每条双链cDNA分子可产生数千条反义RNA分子（图4A）。
第二轮扩增如图4B所示，起始于一个与第一轮略有不同的逆转录反应，因为起始的RNA为反义链（实心黑色矩形），缺乏第一轮中T7-oligo(dT)引物所靶向的多聚腺苷酸尾。因此，本反应使用随机引物（灰色小矩形）进行启动，随后使RNA变性。第二条链的合成则由T7-oligo(dT)引物启动，该引物结合于上一轮逆转录反应生成的正义RNA 3'端的多聚A序列。随后以与第一轮相同的方式进行另一次体外转录（IVT）反应。通常需要至少重复一次第二轮反应，从而实现单个细胞中三轮扩增。
应用
本文介绍的技术可应用于多种研究领域。单细胞分离方案可稍作修改后用于急性脑片制备14。尽管该方法在技术上更具挑战性，但其基本原理在该替代方案中仍然适用。此外，若略微调整移液管的尺寸，可在收集细胞前进行细胞生理特性的记录，从而实现对生理输出背后分子机制的严格控制研究。另一种微小的改进是分离细胞突起与胞体15。在此应用中，先用一根移液管收集细胞胞体，再换一根新的移液管，每管收集100–300个已识别的树突或轴突16。
细胞收获后，可在不同细胞群体之间甚至同一细胞群体内部进行mRNA丰度和组成的比较。在第三轮aRNA合成中掺入生物素标记的UTP，可实现微阵列分析，以确定这些相对mRNA丰度。在完成aRNA扩增后，也可利用高通量测序技术确定原始mRNA群体的组成。扩增得到的aRNA还可用于验证细胞表型转化研究，该研究由本实验室开发，称为TIPeR17，其方法是将一种细胞类型的全套mRNA转染至另一种细胞类型中，以诱导后者细胞的表型向前者转变。此类研究对于疾病状态和细胞表型的分析特别有用，目前本实验室正在开展相关研究。可对扩增产物进行RT-PCR或qPCR，以确认细胞特异性基因的表达。此外，还可于单细胞水平评估转染或转导效率。
优点与局限性
正如摘要所述，分离单个细胞进行分析可消除对异质细胞群体分析时出现的平均化效应。这种平均化效应会因过度代表高丰度转录本，同时平均化并掩盖许多低丰度转录本，从而错误反映单个细胞内的mRNA丰度。流式细胞术可用于分选单个细胞，但该方法需要已知细胞特异性标记物以及昂贵的设备。18 激光显微切割技术（无论是紫外或红外激光捕获显微切割系统）均可实现单细胞甚至亚细胞水平的捕获，但要求目标细胞位于极薄切片的表面。19 与流式细胞术类似，激光捕获显微切割同样需要昂贵的设备。
上述基于电极的采集技术的主要优势之一是，可以在收获细胞之前从目标细胞获得宝贵的电生理数据，从而能够在同一个细胞上进行功能分析和转录组分析。20 该技术的一个缺点是需要操作者具备使用显微操作器的经验。熟悉显微操作器的研究人员会发现该技术非常直观；然而，缺乏此类经验的操作者则需要逐步适应所要求的精细操作。
任何扩增技术本身都存在基于转录本大小和核苷酸组成的偏好性扩增问题4,6,7。基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，如逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE），会导致转录本的指数级扩增，而aRNA扩增程序则产生线性扩增。因此，aRNA方法的一个主要优势在于其能够更好地保留mRNA转录本的相对丰度，因为它仅对扩增过程中出现的误差或偏差进行线性放大，而不是将其指数级放大。
aRNA 方法结合微阵列分析可用于比较形态相似或不同、经处理或未经处理的单个细胞之间的 mRNA 丰度。此外，扩增产物还可用于下一代测序5,8。然而，在此类分析中需谨慎，因为与使用随机引物的方法不同，上述以寡核苷酸-dT 引物启动的扩增过程会偏向于扩增 mRNA 的 3' 末端，并且通常在每一轮扩增中导致扩增产物轻微缩短。在使用标准方法分析微阵列结果时应特别注意，因为扩增产物的轻微缩短可能导致一些假阴性结果。此外，尽管测序结果确实能够提供大部分原始 mRNA 的完整 5' 序列，但某些 mRNA 的 5' 序列仍可能被遗漏。因此，扩增轮数应加以限制。

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>Spiegelgas 盖玻片</td><td>卡罗来纳生物</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 35×10 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用水</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>用于配制细胞培养及清洗盖玻片的溶液</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸 MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白，超纯</td><td>BD 生物科学</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>含Earle's平衡盐溶液的MEM&amp;rsquo;s 盐和 GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>用于细胞接种</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>含Earle's平衡盐溶液的MEM&amp;rsquo;s 盐和 L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>B27无血清添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm，长度100 mm）</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>只要达到合适的内径尺寸，任何硼硅酸盐玻璃移液管均可使用。 </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>任何溶液均可使用，只要其成分不会&amp;rsquo;t 不会干扰任何后续处理（即不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 或 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>1毫升注射器</td><td>BD 生物科学</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>量程取决于移液管的直径</td></tr><tr><td>dNTP混合液</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 寡核苷酸</td><td>自定义</td><td>米德兰认证</td><td></td></tr><tr><td>第二链缓冲液（5×）</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>提供第二链缓冲液</td></tr><tr><td>大肠杆菌DNA连接酶</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA聚合酶I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>随机引物</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>试剂盒（18080-044）包含第一链缓冲液（Y02321）和 DTT</td></tr><tr><td>MEGAclear 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute 反应纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter 拥有多种其他型号，其中许多在食谱手册中有所讨论</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td></td><td>许多其他显微操作器也可使用，例如较新型号的 Eppendorf 产品</td></tr><tr><td>移液器架</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>将根据显微操作仪和移液管外径的不同而有所变化</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

单细胞转录组分析

Transcriptome Analysis of Single Cells

许多基因表达分析技术依赖于从组织匀浆或培养细胞中获得的异质性细胞群体所提取的材料1,2,3。以大脑为例，海马等脑区包含多种不同类型的细胞，这些细胞以复杂的结构排列，每种细胞具有独特的mRNA表达谱。能够分离单个细胞，使得研究人员可以更深入地探究细胞群体之间及内部的分子差异。本文介绍一种简单且快速的细胞采集方法，用于后续实验处理。该方法利用电生理实验中常用的玻璃移液管，通过负压抽吸分离目标细胞，并将其直接转移至Eppendorf管中，以便后续进行各种分子生物学操作。我们的实验方案可稍作修改，用于从细胞培养物中收集树突，甚至从急性脑片中分离单个细胞。
我们还描述了aRNA扩增方法，作为单细胞分离的主要下游应用。该方法此前由本实验室开发，作为逆转录或实时聚合酶链式反应（PCR）等其他基因表达分析技术的替代方案4,5,6,7,8。该技术能够从仅数飞克（femtograms）起始材料开始，对带有多聚腺苷酸尾的RNA进行线性扩增，最终获得微克量级的反义RNA。与PCR的指数扩增相比，线性扩增产物能更准确地反映分离细胞转录组中各组分的相对丰度。该基本操作包括两轮扩增。简而言之，首先将T7 RNA聚合酶启动子序列引入由mRNA转录本合成的双链cDNA中；随后进行过夜的体外转录（IVT）反应，由T7 RNA聚合酶从双链cDNA模板生成大量反义RNA转录本。第二轮扩增重复此过程，但由于起始材料为反义RNA，技术细节上略有不同。通常需重复第二轮扩增，共完成三轮扩增。第三轮体外转录反应常使用生物素标记的核苷三磷酸，以便所产生的反义RNA可用于微阵列杂交与检测7,8。

本文介绍了一种从大鼠原代神经元培养物中分离单细胞并利用aRNA扩增技术进行后续转录组分析的简单方法。该方法可推广应用于任何细胞类型。

许多基因表达分析技术依赖于从组织匀浆或混合细胞群体中分离出的材料……

本实验的总体目标是从单个细胞制备用于转录组分析的样品。首先需找到适合分离的细胞，随后将微移液管置于待分离细胞的旁边。接着对注射器施加负压，直至将细胞吸入微量移液管的尖端。该操作步骤的最后一步是将微量移液管的尖端折断并放入收集管中，排出微量移液管内剩余的内容物至管内。最终，可通过微阵列分析经arna扩增方法（该方案中亦有描述）扩增的材料，获得显示不同细胞间mRNA群体差异的结果，也可用于PCR或下一代测序等其他应用。尽管该方法能够提供单个细胞之间的差异信息，也可应用于树突或树突类别等亚细胞区室，从而为树突功能提供重要信息。本实验操作将由我实验室的博士后 Jennifer Singh 演示。在本方案开始之前，已将取自胚胎第18天大鼠海马体的原代神经元接种于35毫米培养皿中的12毫米盖玻片上，并按照书面方案所述条件进行培养。为准备收获用移液管，需使用微量移液管拉制仪将经高压灭菌的玻璃移液管拉制成适合电生理实验的直径。使用制造商预设的程序时，孔径大小并不关键，因为在收集细胞前尖端会被折断。请将移液管小心存放于无尘环境中，例如微量移液管储存罐，以确保在准备收获细胞时尖端保持完整。准备所需数量的1.7毫升离心管，并在每管中加入两微升磷酸盐缓冲液（PBS），用于储存收获的样本材料。在组织培养罩内，从培养箱中取出一个含有盖玻片的 35 毫米培养皿。迅速将其中一张盖玻片转移至另一个含有 HBSS 的新 35 毫米培养皿的盖子上。未进行操作的盖玻片必须及时放回培养箱，因为细胞长时间暴露会变得不健康。若长时间放置在外。进行细胞收集时，需要使用配备40倍物镜并装有显微操作仪的倒置显微镜。使用带有柔性导管的移液器架，并将导管固定在稳定表面上，以防止收集过程中移液器发生不必要的移动。在管路末端插入一根针头，以便连接带有锁紧接头的一毫升注射器，并可在不同使用者之间更换。准备微量移液器时，用一只手的指间绷紧一张Kim擦拭纸，将移液器尖端轻轻在纸上划过一到两次，以可控方式将尖端折断。开口直径应约为目标细胞大小的75%至100%。将微量移液器固定在微量移液器支架上，并将支架安装到显微操作器的插槽中。最后，装上40倍物镜。将培养皿置于显微镜载物台上，找到适合收获的细胞区域。对于原代神经元培养物，应使待采集的细胞与其邻近细胞相对隔离。为避免收获周围细胞或其突起，需将待采集的细胞置于视野中央。使用显微操作器将微移液管推进至培养皿中的溶液，并进入光路。将移液器吸头放入溶液中。通过目镜观察，移液器应在视野中呈现为一个阴影。从此刻开始，通过轻轻吹动注射器，在细胞平面之上施加正压。调整移液管尖端的位置，直至其进入视野，并使用粗调焦旋钮对准移液管尖端进行聚焦。此时，评估移液管的孔径是否过大或过小。如果孔径不合适，应更换另一支微移液管，直至找到合适的孔径，以防止移液管在收集区域发生断裂。使用粗调焦旋钮在通过显微操作器将移液管尖端移向细胞之前，先调整焦平面。当细胞逐渐接近时，改用细调焦，直至细胞和移液管尖端均清晰对焦。在接近目标细胞前停止施加正压，以避免将细胞吹离盖玻片。使用显微操作器将移液器尖端定位，使其接触待采集的细胞胞体。通过注射器用嘴轻轻施加负压，直至细胞进入移液器尖端。如果细胞未进入移液器，可轻轻将尖端向细胞靠近并向下移动，直至细胞从盖玻片上脱离。使用显微操作器立即将移液管向上移出溶液。将移液管从 holder 上取下。一手握住已准备好的 1.7 毫升离心管，另一只手轻轻在管壁靠近底部的位置折断移液管的尖端。将破损的吸头尖端对准离心管中心，并使其接近0.1毫升刻度线处。将连接1毫升注射器的针头插入移液管顶部开口中，迅速下压活塞，使移液管内的溶液喷出并进入离心管内。注意避免吸头接触管壁上已有的液体。由于毛细作用会将液体重新吸入移液管中，细胞应保留在移液管的最尖端，这样足以确保细胞被充分排出。使用台式微量离心机快速离心管内物质，然后置于干冰上冷冻，或放置在冰上以进行后续处理或其他应用，如PCR或下一代测序。此处展示的是成功分离单个神经元的示例。首先，选择一个细胞密度相对较低的区域。然后将移液器尖端推进至目标细胞。此处显示的是细胞采集后的视野。请注意，周围的组织仍保留在盖玻片上。相反，本图展示了两个移液器吸头的图像，其尺寸不适合有效收获。使用该吸头将导致收获不完全，而此处所示的吸头则会收获周围环境中的物质。收获后，建议使用生物分析仪对RNA进行扩增分析，以检测扩增RNA的分布情况和产量。由单细胞材料成功扩增出的RNA总量通常在低微克级别，其分布图谱应平滑且范围广泛。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数分钟内完成整个流程；在进行该操作时，务必采用无RNA酶的技术方法。

Research

科研

JoVE Journal

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