单细胞转录组分析

本实验的总体目标是从单个细胞制备用于转录组分析的样品。首先需找到适合分离的细胞，随后将微移液管置于待分离细胞的旁边。

接着对注射器施加负压，直至将细胞吸入微量移液管的尖端。该操作步骤的最后一步是将微量移液管的尖端折断并放入收集管中，排出微量移液管内剩余的内容物至管内。最终，可通过微阵列分析经arna扩增方法（该方案中亦有描述）扩增的材料，获得显示不同细胞间mRNA群体差异的结果，也可用于PCR或下一代测序等其他应用。

尽管该方法能够提供单个细胞之间的差异信息，也可应用于树突或树突类别等亚细胞区室，从而为树突功能提供重要信息。本实验操作将由我实验室的博士后 Jennifer Singh 演示。在本方案开始之前，已将取自胚胎第18天大鼠海马体的原代神经元接种于35毫米培养皿中的12毫米盖玻片上，并按照书面方案所述条件进行培养。为准备收获用移液管，需使用微量移液管拉制仪将经高压灭菌的玻璃移液管拉制成适合电生理实验的直径。

使用制造商预设的程序时，孔径大小并不关键，因为在收集细胞前尖端会被折断。请将移液管小心存放于无尘环境中，例如微量移液管储存罐，以确保在准备收获细胞时尖端保持完整。准备所需数量的1.7毫升离心管，并在每管中加入两微升磷酸盐缓冲液（PBS），用于储存收获的样本材料。

在组织培养罩内，从培养箱中取出一个含有盖玻片的 35 毫米培养皿。迅速将其中一张盖玻片转移至另一个含有 HBSS 的新 35 毫米培养皿的盖子上。未进行操作的盖玻片必须及时放回培养箱，因为细胞长时间暴露会变得不健康。

若长时间放置在外。进行细胞收集时，需要使用配备40倍物镜并装有显微操作仪的倒置显微镜。使用带有柔性导管的移液器架，并将导管固定在稳定表面上，以防止收集过程中移液器发生不必要的移动。

在管路末端插入一根针头，以便连接带有锁紧接头的一毫升注射器，并可在不同使用者之间更换。准备微量移液器时，用一只手的指间绷紧一张Kim擦拭纸，将移液器尖端轻轻在纸上划过一到两次，以可控方式将尖端折断。开口直径应约为目标细胞大小的75%至100%。

将微量移液器固定在微量移液器支架上，并将支架安装到显微操作器的插槽中。最后，装上40倍物镜。将培养皿置于显微镜载物台上，找到适合收获的细胞区域。

对于原代神经元培养物，应使待采集的细胞与其邻近细胞相对隔离。为避免收获周围细胞或其突起，需将待采集的细胞置于视野中央。使用显微操作器将微移液管推进至培养皿中的溶液，并进入光路。

将移液器吸头放入溶液中。通过目镜观察，移液器应在视野中呈现为一个阴影。从此刻开始，通过轻轻吹动注射器，在细胞平面之上施加正压。

调整移液管尖端的位置，直至其进入视野，并使用粗调焦旋钮对准移液管尖端进行聚焦。此时，评估移液管的孔径是否过大或过小。如果孔径不合适，应更换另一支微移液管，直至找到合适的孔径，以防止移液管在收集区域发生断裂。

使用粗调焦旋钮在通过显微操作器将移液管尖端移向细胞之前，先调整焦平面。当细胞逐渐接近时，改用细调焦，直至细胞和移液管尖端均清晰对焦。在接近目标细胞前停止施加正压，以避免将细胞吹离盖玻片。

使用显微操作器将移液器尖端定位，使其接触待采集的细胞胞体。通过注射器用嘴轻轻施加负压，直至细胞进入移液器尖端。如果细胞未进入移液器，可轻轻将尖端向细胞靠近并向下移动，直至细胞从盖玻片上脱离。

使用显微操作器立即将移液管向上移出溶液。将移液管从 holder 上取下。一手握住已准备好的 1.7 毫升离心管，另一只手轻轻在管壁靠近底部的位置折断移液管的尖端。

将破损的吸头尖端对准离心管中心，并使其接近0.1毫升刻度线处。将连接1毫升注射器的针头插入移液管顶部开口中，迅速下压活塞，使移液管内的溶液喷出并进入离心管内。注意避免吸头接触管壁上已有的液体。

由于毛细作用会将液体重新吸入移液管中，细胞应保留在移液管的最尖端，这样足以确保细胞被充分排出。使用台式微量离心机快速离心管内物质，然后置于干冰上冷冻，或放置在冰上以进行后续处理或其他应用，如PCR或下一代测序。此处展示的是成功分离单个神经元的示例。

首先，选择一个细胞密度相对较低的区域。然后将移液器尖端推进至目标细胞。此处显示的是细胞采集后的视野。

请注意，周围的组织仍保留在盖玻片上。相反，本图展示了两个移液器吸头的图像，其尺寸不适合有效收获。使用该吸头将导致收获不完全，而此处所示的吸头则会收获周围环境中的物质。

收获后，建议使用生物分析仪对RNA进行扩增分析，以检测扩增RNA的分布情况和产量。由单细胞材料成功扩增出的RNA总量通常在低微克级别，其分布图谱应平滑且范围广泛。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数分钟内完成整个流程；在进行该操作时，务必采用无RNA酶的技术方法。