单细胞的转录组学分析
2011年4月25日
在这篇文章中，我们描述了一个简单的方法从大鼠原代神经元的文化和随后的转录组学分析使用ARNA扩增单细胞的收获。这种方法推广到任何类型的细胞。
该程序的总体目标是从单细胞中制备样品以进行转录组分析。这是通过首先找到适合分离的细胞来实现的。然后将微量移液器放置在要分离的细胞旁边。
接下来对注射器进行抽吸，直到细胞被拉入微量移液器的尖端。该程序的最后一步是将微量移液器的尖端折入收集管中，并将微量移液器的剩余内容物倒入管中。最终，通过对使用 arna 扩增方法扩增的材料进行微阵列分析，可以获得显示细胞之间 mRNA 群差异的结果，该方法在方案中也有描述，或者用于其他应用，例如 PCR 或下一代测序。
虽然这种方法可以提供见解和单细胞之间的差异，但它也可以应用于亚细胞区室，例如树突或树突类别，并为树突功能提供重要信息。演示该程序的是我实验室的博士后 Jennifer Singh在本协议开始之前，将胚胎第 18 天大鼠 Hippo Campi 的原代神经元接种在 35 毫米培养皿中的 12 毫米盖玻片上，并按照书面协议中的说明进行维护。要准备用于收获的移液器，请使用微量移液器拉出器将高压灭菌玻璃移液器拉至适合电生理学的直径。
使用制造商的预设程序，孔径并不重要，因为尖端会在细胞收集之前断裂。小心地将移液器存放在无尘环境中，例如微量移液器储存罐，当准备收获细胞时，吸头将保持完整。通过添加 2 微升 PBS 来制备所需数量的 1.7 毫升 einor 管，以储存收获的材料。
从组织培养罩中的培养箱中取出 1 个 35 毫米的盖玻片培养皿。将一张盖玻片从该培养皿快速转移到含有 HBSS 的新 35 毫米培养皿的盖子上。当细胞变得不健康时，将未被处理的盖玻片送回培养箱至关重要。
如果长时间放置。细胞收获需要具有 40 倍物镜且配备微型纵器的倒置光学显微镜。使用带有柔性管的移液器支架，将管子固定在稳定的表面上，以防止移液器在收集过程中意外移动。
在管路末端，插入针头，以便可以在用户之间连接和更换带有诱饵锁连接的 1 毫升注射器。准备微量移液器，方法是用一只手的手指拉紧 Kim 抹布，然后非常轻轻地将移液器的尖端刷过纸张一到两次，以受控方式折断吸头。开口应约为目标细胞大小的 75% 至 100%。
将微量移液器固定在微量移液器支架中，并将微量移液器支架固定在微量作器上的插件上。最后，设置 40 x 目标。将培养皿放在显微镜载物台上，找到适合收获的细胞区域。
在原代神经元培养物的情况下，细胞应与其邻居相对隔离。为防止收获周围的细胞和/或过程，请将要收获的细胞放在视野的中心。使用微型纵器将微量移液器推向培养皿中的溶液，使其进入光路。
将移液器吸头放入溶液中。通过目镜观察，移液器应在视野中显示为阴影。从这一点开始施加正压，轻轻吹过位于细胞平面上方的注射器。
调整移液器吸头的位置，使其处于视野内，并使用航向聚焦旋钮聚焦在移液器吸头上。此时，评估移液器的孔径是太大还是太小。如果孔径不正确，请更换为另一支微量移液器，直到找到正确的孔径，以防止移液器在收集区域破损。
在使用 microm纵器将移液器吸头推进到细胞之前，使用课程重点推进焦平面。当细胞越来越近时，使用精细聚焦，直到细胞和移液器吸头都聚焦。在到达原告细胞之前停止施加正压，以避免将其从盖玻片上吹落。
用微型纵器定位移液器吸头，使其接触要收获的细胞胞体。使用注射器，用嘴轻轻吸吮，直到细胞进入移液器吸头。如果细胞未进入移液器，请轻轻地将吸头移近细胞并向下移动，直到其从盖玻片上抬起。
使用微型纵器立即将移液器向上移出溶液。从支架上取下移液器。一只手握住准备好的 1.7 毫升 einor 管，然后轻轻地将管侧的移液器尖端朝底部折断。
以 0.1 毫升标记为目标，将破损的尖端置于试管内的中央，将连接到 1 毫升注射器的针头插入移液器的顶部开口。快速按下柱塞，迫使移液器中的溶液喷出到试管中。注意不要将尖端接触管侧面的任何液体。
由于毛细管作用会将液体带回移液器中，因此细胞应保持在移液器的最尖端，这应该足以正确排出细胞。使用台式微量离心机快速离心管内容物，然后在干冰上冷冻或置于冰上进行进一步处理或用于其他应用，如 PCR 或下一代测序。这里显示的是成功收获分离神经元的示例。
首先，选择了一个相对低密度的细胞区域。然后将移液器吸头推进到所需的细胞。这里显示了细胞收获后的视野。
请注意，周围的过程保留在盖玻片上。相反，该图显示了移液器吸头的两个图像，这两个吸头的尺寸不适合有效收集。此提示将导致不完全收获，而此处显示的提示将导致周围环境的收获。
在收获和 A RNA 扩增分析后，建议使用生物分析仪检查扩增 RNA 的分布和数量。从单细胞材料中成功扩增将产生低微克的总量，并且分布平滑而宽 一旦掌握，如果在执行此程序时正确执行，该技术可以在几分钟内完成，使用无 RNA 技术很重要。
概述
本文介绍了一种从大鼠原代神经元培养中收集单个细胞进行转录组分析的方法，该方法使用aRNA扩增。该技术适用于各种细胞类型，允许对单细胞水平的基因表达进行详细研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 转录组学
背景
- 单细胞分析提供了对细胞异质性的洞察。
- 了解基因表达差异对神经科学研究至关重要。
- 原代神经元培养对于研究神经元功能至关重要。
- 收集技术对于准确的转录组分析至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的单神经元分离方法。
- 促进个体细胞的转录组分析。
- 增强对神经元中基因表达可变性的理解。
使用的方法
- 使用微移液器技术分离单个细胞。
- 应用aRNA扩增进行转录组分析。
- 使用倒置光显微镜进行细胞观察。
- 使用微操作器进行精确的移液器定位。
主要结果
- 成功从原代培养中分离出单个神经元。
- 展示了分离的细胞之间mRNA种群的差异。
- 在PCR和下一代测序中的潜在应用。
- 通过有针对性的收集对树突功能的洞察。
结论
- 该方法允许对单细胞水平进行详细的转录组分析。
- 它可以适用于神经元以外的各种细胞类型。
- 这种方法增强了我们对神经组织细胞多样性的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptome analysis enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and uncover gene expression differences that are masked in bulk tissue assays. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and prioritizing disease-relevant cell populations in early discovery. Integrating robust single-cell workflows strengthens predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression at the resolution of individual cells, clarifying pathway activity and target engagement.
- Supports biological de-risking by distinguishing molecular signatures between cell types and subcellular compartments.
- Improves predictive confidence for target selection by revealing heterogeneity within disease-relevant tissues.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated single-cell samples for downstream transcriptomic assays.
- Enables reproducible isolation and amplification of RNA from individual cells, supporting quantitative assay development.
- Provides scalable input material for microarray, PCR, or next-generation sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neuronal subtypes or compartments, supporting translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling single-cell resolution analyses.
- Reduces risk of advancing non-representative targets by confirming expression in relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell isolation and aRNA amplification workflow bridges early discovery and preclinical research, providing high-resolution transcriptomic data for target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling gene expression analysis at the single-cell level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs suitable for downstream high-throughput assays.
- Analytics: Generates amplified RNA for microarray or sequencing, enabling robust comparison of gene expression across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neuronal subtypes or compartments.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for diverse cell types and experimental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and amplification, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated cellular relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell handling and RNA-free technique to prevent contamination.
- Needs access to micro-manipulation instrumentation and analytical platforms for RNA quantification and analysis.
- Demands cross-team standardization of isolation and amplification protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and subcellular compartments with protocol modifications.
- Sample integrity and RNA yield are sensitive to handling and timing, requiring careful workflow management.
