Name: 分离果蝇睾丸 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: 学习使用解剖针和冰冷PBS从0至3日龄雄性黑腹果蝇中快速分离睾丸的技术。该方法可在显微镜下高效获取完整睾丸组织，适用于后续的RNA提取、蛋白质分离及免疫荧光染色等分子生物学分析。

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作者感谢 Vasia Vagin 将该技术引入我们的实验室。

<ol>
	<li>制备带有黑色背景的玻璃显微镜载玻片：将20#白纸裁剪成与显微镜载玻片相同尺寸。使用永久性记号笔（例如 Sharpie）将纸的一面涂成黑色。在黑色面涂上白胶（Elmer's），然后将纸粘贴到载玻片上。该载玻片可重复使用。使用¾英寸标签胶带（Fisherbrand）将载玻片（玻璃面朝上）固定在 CO2 果蝇操作垫上，以固定其位置。</li>
	<li>收集0至3日龄的雄性果蝇。</li>
	<li>准备一桶冰、磷酸盐缓冲液（PBS）和解剖针。</li>
	<li>使用CO2气流麻醉50–100只果蝇，并将其从培养瓶或小管转移至显微镜载玻片附近的果蝇操作垫上。</li>
	<li>用移液器吸取约50 μl冰浴PBS，滴在载玻片中央。</li>
	<li>用解剖针轻轻挑起一只雄性果蝇——先将解剖针浸入PBS中，然后轻轻触碰果蝇腹面（即靠近翅膀处），再将其放入PBS液滴中。</li>
	<li>将一根解剖针置于果蝇胸部与腹部之间中部位置，用力下压。另一根解剖针插入第六（A6）与第七（A7）腹节之间（从底部数第二和第三条条纹处），将腹部从胸部拉离。</li>
	<li>将睾丸与其他器官（尤其是肠道）分离。特别是在white突变体中，睾丸与肠道外观相似。关键区别在于：睾丸总是成对出现；每侧睾丸具有螺旋状结构，且颜色比肠道更白。</li>
	<li>将分离出的睾丸保存在装有冰浴PBS的聚丙烯微量离心管中。</li>
</ol>
代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="静态平衡图；DNA结构；教学示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 雄性生殖系统的背侧视图，来自 flybase.org/reports/FBim0000074.html。Flybase 来源说明：“改编自 Miller (1950) 第508页图38A。A. Miller. 黑腹果蝇成虫的内部解剖与组织学。载于 M. Demerec 编，《果蝇生物学》，第6章，第420–534页。冷泉港实验室出版社，影印版，1994年。©1994 冷泉港实验室出版社版权所有。经冷泉港实验室出版社（CSHL Press）许可使用。详见 <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a>。”

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们提供一种从成年雄性黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中分离睾丸的实验方案。由于该技术需要双手协调操作，熟练程度只能通过练习获得。

<table><tbody><tr><td>解剖针</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>普通载玻片</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>显微镜光源</td><td>工具</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 垫板</td><td>工具</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>台式 Flowbuddy 完整系统</td><td>工具</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>气泡加湿器</td><td>工具</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>球状填充针</td><td>工具</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#190;&amp;#8221; 标签胶带</td><td>耗材</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster 睾丸的分离

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster 的睾丸是研究干细胞维持与分化、减数分裂以及体细胞-生殖细胞相互作用的重要模型。通常从羽化后0-3天的成年雄性果蝇中分离睾丸。野生型果蝇的睾丸因其呈黄色而易于与其他组织区分，但实验室常用遗传背景的 white 突变体果蝇的睾丸在形状和颜色上均与果蝇肠道相似。在具有黑色背景的玻璃显微镜载片上进行解剖可显著提高睾丸的辨识度。使用解剖针从果蝇体内取出睾丸。与使用镊子解剖睾丸的方法相比，本方法速度更快，熟练操作者每小时可解剖200-300只野生型果蝇，获得400-600个睾丸。而 white 突变体果蝇或睾丸尺寸较小的突变体果蝇的睾丸较难解剖，通常每小时可获得200-400个睾丸。

Drosophila melanogaster 的睾丸可通过解剖针从成年雄性个体中快速高效地分离。经过练习，可在一至两天内分离出足量的睾丸组织，用于高通量测序或更传统的分子生物学方法对 DNA 或 RNA 进行分析，或用于基于抗体或酶学检测的蛋白质分析。

Drosophila melanogaster 睾丸的分离

黑腹果蝇的睾丸为研究干细胞维持与分化、减数分裂以及体细胞-生殖细胞相互作用等过程提供了重要的模型系统。

本实验的总体目标是从零到三天大的雄性黑腹果蝇中分离睾丸。具体操作是将雄性果蝇麻醉后，在显微镜下利用两枚解剖针，在一滴冰冷的PBS中进行解剖：用解剖针将果蝇的腹部从胸部拉开。最后将睾丸从其他组织中仔细分离，并收集用于多种分析技术，如免疫荧光、染色，或总RNA和蛋白质提取。该方法的可视化演示至关重要，因为分离出的睾丸较难辨认，容易与肠道组织混淆。本实验操作将由我实验室的技术员 shemei ma 进行示范。首先准备一桶冰、解剖针以及约100毫升磷酸盐缓冲液。将PBS置于冰桶中预冷。通过将白色20磅纸裁剪至适合载玻片的大小，制作具有黑色背景的显微镜载玻片。然后将其中一侧涂成黑色。使用永久性记号笔将纸张固定在载玻片上，并将载玻片固定到 CO2 垫上。在解剖显微镜下，用一股 CO2 气流使一瓶 0 至 3 日龄的果蝇麻醉，并将其倾倒至垫上。在固定好的显微镜载玻片附近，通过其特有的深色交配钩识别雄性果蝇，并挑选出50至100只。用移液器吸取约50微升冰冷的PBS，滴加到显微镜载玻片中央，形成液滴。将解剖针浸入PBS液滴中，轻轻触碰雄性果蝇的腹面，使其粘附在针上，从而拾取果蝇。将果蝇置于 PBS 液滴中，用一根针牢固地压住果蝇胸部与腹部之间的位置。将另一根针压在第六和第七腹节之间，然后将腹部从胸部拉开。将睾丸与其他器官（尤其是肠道）分离，肠道外观与睾丸相似，需仔细区分以帮助辨认睾丸。请注意，睾丸总是成对出现，具有特征性的螺旋形状，且颜色比肠道组织更白。将睾丸收集到含有冰冷 PBS 的微量离心管中，并置于冰上保存，可在冰上保存数小时。一旦熟练掌握，按照本方法一只果蝇的解剖可在一分钟内完成。还可以进行其他方法，例如小干扰RNA或微小RNA的深度测序，以回答更多问题，例如：在特定突变果蝇中，RNA的组成如何发生变化？

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生物学

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Drosophila melanogaster 睾丸的分离

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