基因小鼠胚胎干细胞的基础含量为心源性诱导效率量化

以下实验的总体目标是确定小鼠胚胎干细胞中心肌细胞分化所需的关键时间调节。这是通过首先在 96 孔圆底板中形成胚胎体来实现的，以标准化 EB 形成作为第二步。在预定的时间过程中将蛋白质或化学调节剂添加到 EBS 中，这将允许对所检查的通路进行时间控制。

接下来，手动量化跳动的 EBS 以确定各种信号调制方案的感应效率。获得的结果表明，基于跳动 EBS 形成的百分比和使用悬滴法进行确认，显示了心肌细胞分化的基本信号通路的时间需求。与悬滴等现有方法相比，该技术的主要优点是它标准化和简化了劳动密集型程序，并允许直接读取以进行定量。

该方法可以帮助回答干细胞生物学领域的关键问题，例如识别引导分化至所需细胞类型的基本信号传导凝固 开始此程序。在 10 cm 细胞培养板中加入补充有白血病抑制因子的小鼠 ES 细胞培养基中的 Gro 小鼠胚胎干细胞。当 ES 细胞达到 50% 至 70% 汇合时，即可使用。

去除 ES 培养基，用 5 毫升无菌 PBS 冲洗细胞一次。向每个板中加入 2 毫升 0.05% tripsin EDTA，并在 37 摄氏度下孵育板 3 到 5 分钟。接下来，用每板 3 毫升 ES 培养基在 EDTA 中淬灭行程，并将细胞转移到 50 毫升离心管中。

以每分钟 1000 转的速度旋转 3 分钟。离心后，去除脊髓突起物，并用所需量的 EB 培养基重悬细胞沉淀。计数细胞数量，然后将细胞稀释至每毫升 10 至 3 个细胞的 5 倍。

在使用多通道移液器的 EB 培养基中，将 100 微升含有细胞的 EB 培养基添加到 96 圆底孔微量滴定板的每个孔中。所需的 96 孔板数量将取决于实验的条件和时间点的数量。将 96 圆底孔微量滴定板放入加湿的 37 摄氏度 5% 二氧化碳培养箱中，以确定心脏发生的关键信号通路的关键时间窗口。

特异性信号通路的调节剂被添加到 ES 细胞中。在 96 个圆底孔板中加入信号调节剂，其在培养基中在不同时间点稀释到每个孔中。每个 96 孔板中的一半孔用于处理的每个起始时间点。

在每个时间点向其他 48 个孔添加载体控制在不同的停止点，我们将通过更换培养基从每个孔中洗掉信号调节剂，这样做时必须非常小心，以防止破坏胚胎体在不同的停止时间点。通过更换孔的 EB 培养基来洗去调节剂。将 96 孔板倾斜约 10 度角，然后用多通道移液器轻轻地从孔中取出培养基。

然后将不含调节剂的 EB 培养基加回每个孔中，用于超过 48 小时的任何处理。每两天更换补充有新鲜调节剂的 EB 培养基，直到所需的停止时间。通过将 ES 细胞转移到 96 孔板诱导 EBS 7 天后，在显微镜下检查 EB 收缩。

将收缩 EBS 的井评分为阳性，以获得每个不同治疗时间过程中收缩 EBS 的百分比。由 96 孔板实验鉴定的心脏发生的信号传导的时间窗口可以在由悬挂液滴制成的 EBS 中验证，以制造悬挂的 EB 液滴。首先通过添加 3 到 4 毫升 PBS 来准备培养皿，以防止液滴的畸变。

接下来，将最终密度为 2.5 倍 10 比每毫升 4 个细胞制备的 ES 细胞悬液倒入细菌培养皿中，以便于取用。使用多通道移液器将 20 微升 ES 细胞滴到培养皿的倒置盖子上。不要让单个液滴相互接触。

通常，一个盖子最多可容纳 80 滴。然后将盖子翻转回含有 PBS 的培养皿上，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 48 小时，以形成 EB。48 小时后，用 3 mL EB 填料冲洗每个盖子上悬挂的液滴形成的 EBS。

将两个 EBS 盖子拉入新的培养皿中。第四天将培养皿在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 4 天，通常将悬浮液中的 EBS 转移到 0.2% 明胶涂层的六孔板上。在制备悬液滴后 7 天，在从 96 孔板实验中确定的时间段将 30 EBS 转移到每个孔中孵育信号调节剂。

在显微镜下观察 EBS 的 EB 收缩情况，在 96 孔板的圆底孔中生长的 ES 细胞将形成 EBS，如第 4 天形成的 EB 的代表性图像所示。ES 心动发生的关键时间点是与载体对照相比，包含信号调节剂治疗的收缩 EBS 百分比最高百分比的时间窗口。此处显示的是 96 孔微量滴定板上分化第 10 天由背侧吗啡处理的 ES 细胞形成的心肌细胞的自发收缩病灶。

观看此视频后，您应该对如何有效识别 ES 心脏发生中关键时间调节、关键信号通路的窗口有很好的了解。