Name: 基因小鼠胚胎干细胞的基础含量为心源性诱导效率量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 了解小鼠胚胎干细胞心肌分化的时间调控方法，通过96孔板标准化类胚体形成并量化收缩效率。该技术可精确识别Wnt/β-catenin和BMP信号通路的关键时间窗口，为心脏再生医学研究提供可靠平台。

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本工作由退伍军人事务部以及美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 5U01HL100398 和 1R01HL104040。

1. 使用96孔圆底微孔板形成拟胚体（EB）
<ol>
	<li>在含有LIF的鼠胚胎干细胞培养基中，将鼠胚胎干细胞培养于10 cm细胞培养皿中。</li>
 <li>当胚胎干细胞准备就绪（通常达到50–70%融合度）时，移除培养基，并用5 ml无菌PBS洗涤细胞一次。</li>
 <li>每皿加入2 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA，于37°C孵育3˜5分钟，然后加入3 ml胚胎干细胞培养基终止胰蛋白酶反应。</li>
 <li>将细胞转移至50 ml Falcon管中，以1000 rpm离心3分钟。</li>
 <li>弃去上清液，并用适量的拟胚体（EB）培养基重悬细胞沉淀。</li>
 <li>计数细胞数量，并用EB培养基将细胞稀释至5 × 103 个细胞/ml。</li>
 <li>使用多通道移液器将含细胞的EB培养基100 μl加入96孔圆底微孔板的每一孔中。</li>
 <li>将96孔圆底微孔板放入培养箱中培养。</li>
</ol>
2. 确定心脏发生关键信号通路的关键时间窗口
<ol>
	<li>在不同时间点（如第0天、第1天、第2天、第3天和第4天等），向含有胚胎干细胞（ES细胞）的96孔微孔板的各个孔中加入特定信号通路的调节剂以及溶剂对照。</li>
 <li>在不同的终止时间点，通过更换胚体（EB）培养基来清除调节剂，每48个孔对应一个终止时间点。例如，若要对从第0天开始的ES细胞进行两天处理，则在第2天清除调节剂。对于任何超过48小时的处理，在达到预期的终止时间点之前，每隔两天更换一次添加新鲜调节剂的EB培养基。</li>
 <li>在第7天后在显微镜下观察胚体（EB）的收缩情况。将出现收缩胚体的孔记为阳性孔，计算每种不同处理时间条件下收缩胚体的百分比。</li>
 <li>胚胎干细胞向心肌细胞分化的关键时间点，是指在使用信号通路调节剂处理后，相较于溶剂对照组，收缩胚体百分比达到最高的那些时间段。</li>
</ol>
3. 利用悬滴法形成的胚状体验证心脏发生信号通路的时间窗口
<ol> 
 <li>通过加入 3–4 ml PBS 准备培养皿，以防止蒸发。</li>
 <li>按照步骤 1.1 ˜ 1.5 操作，将 ES 细胞调整至终浓度为 2.5×104 个细胞 / ml。</li>
 <li>将细胞混合液倒入细菌培养皿中以便操作。使用多通道移液器，在倒置的皿盖上加入 20 μl 液滴（每滴约含 500 个细胞）。确保各液滴之间不相互接触。通常一个皿盖最多可容纳 80 个液滴。将皿盖翻转盖回含有 PBS 的培养皿上，于培养箱中孵育 24 小时或 48 小时，以形成拟胚体（EB）。</li>
 <li>用 3 ml EB 培养基将每个皿盖上形成的悬滴拟胚体冲洗下来，并将两个皿盖的拟胚体合并至一个新的培养皿中。加入 EB 培养基使总体积达到 10 ml。</li>
 <li>在第 4 天时，将悬浮培养的拟胚体转移至经 0.2% 明胶包被的 6 孔板中。一般每孔转移 30 个拟胚体。每孔加入 EB 培养基至终体积为 2 ml。</li> 
 <li>根据 96 孔板实验所确定的时间段，孵育信号通路调节剂。</li>
 <li>在第 7 天后通过显微镜观察拟胚体的收缩情况，必要时可通过 RT-PCR、免疫染色等方法进一步表征心脏分化情况。</li>
</ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

悬滴法一直是用于拟胚体形成和体外分化的常规方法。然而，该方法费时费力，且由于操作上的限制，实验灵活性较差。同样，由于悬滴状态下拟胚体的形成与操作高度依赖实验人员的技术水平，实验结果也更难验证。一种更简便的方法是在圆底96孔板中通过单步法形成拟胚体。该体系有利于体外分化的标准化，并因拟胚体形成及后续操作（如调节剂的添加或去除）简便，可容纳更多的实验条件。此外，96孔板体系还可优化为小鼠胚胎干细胞中高效的筛选工具。

<table><tbody><tr><td colspan="4">主要使用小鼠CGR8细胞。</td></tr><tr><td colspan="4">ES培养基：GMEM培养基添加10%热灭活FBS、2 mM L-谷氨酰胺、0.05 mM 2-巯基乙醇&amp;#8211;乙醇和200 U/ml小鼠LIF。</td></tr><tr><td colspan="4">EB 培养基：配制含 20% 热灭活 FBS、1.6 mM L-谷氨酰胺、0.08 mM 2-巯基乙醇的 IMDM 培养基&amp;#8211;乙醇和1倍MEM非必需氨基酸溶液</td></tr></tbody></table>

改良的小鼠胚胎干细胞检测法用于量化心脏诱导效率

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

多能干细胞的分化受到多种关键信号通路在时间和空间上的精确调控。理解这一过程的一个难点在于，目前尚缺乏统一的方法来关联关键信号事件的变化与分化效率之间的关系。本文描述了一种基于小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的检测方法，用于鉴定在心源性诱导过程中Wnt/β-catenin和BMP信号激活的关键时间窗口。通过在96孔板中对跳动的胚胎体（EBs）进行计数，我们能够快速定量心源性分化效率，并在特定信号调节剂处理后的时间进程中，确定Wnt/β-catenin和BMP信号激活的关键时段。此处阐述的原理不仅限于心源性诱导，还可应用于其他多种细胞谱系的研究。此外，96孔板格式具有进一步发展为高通量、自动化检测体系的潜力，从而支持更复杂实验假设的验证。

我们描述了一种基于小鼠胚胎干细胞的检测方法，用于确定在心源性诱导过程中Wnt/β-catenin和BMP信号激活的关键时间窗口。该方法提供了一个标准化平台，可可靠地量化心源性效率，并适用于其他细胞谱系的研究。

多能干细胞的分化受到多种关键信号通路在时间和空间上的精确调控。其中一个障碍……

以下实验的总体目标是确定小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中所需的关键时间调控机制。首先，在96孔圆底板中形成类胚体，以标准化类胚体的生成，作为第二步，将蛋白质或化学调节剂在预设的时间范围内添加到类胚体中，从而实现对所研究通路的时间控制。接下来，通过手动计数跳动的拟胚体（EBS）以确定不同信号调控方案的诱导效率。根据形成的跳动拟胚体所占百分比，并结合悬滴法验证，获得结果以揭示心肌细胞分化过程中关键信号通路的时间需求。该技术相较于现有的悬滴法等方法的主要优势在于，其标准化并简化了原本劳动密集的操作流程，且能够提供简单直接的定量读数。该方法有助于解答干细胞生物学领域中的关键问题，例如鉴定指导干细胞向目标细胞类型分化的关键信号通路。开始此操作时，将 Gro 小鼠胚胎干细胞在添加了白血病抑制因子的培养基中，于 10 厘米细胞培养皿中进行培养。当胚胎干细胞融合度达到 50% 至 70% 时，即可用于后续实验。移除 ES 培养基，并用 5 毫升无菌 PBS 洗涤细胞一次。每孔加入 2 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 孵育 3 至 5 分钟。随后，每孔加入 3 毫升 ES 培养基以终止胰蛋白酶 EDTA 的作用，并将细胞转移至 50 毫升离心管中。以每分钟1000转的速度离心3分钟。离心后，弃去上清液，并用所需体积的EB培养基重悬细胞沉淀。计数细胞数量，然后将细胞稀释至每毫升5 × 10³个细胞。使用多通道移液器，在EB培养基中向96孔圆底微孔板的每孔加入含有细胞的100微升EB培养基。所需96孔板的数量取决于实验的条件数和时间点数。将96孔圆底微孔板置于加湿的37°C、5% CO₂培养箱中，以确定心脏发生关键信号通路的关键时间窗口。向 ES 细胞中加入特定信号通路的调节剂。在 96 孔圆底培养板中，将用培养基稀释的信号调节剂在不同时间点分别加入各孔中。每块 96 孔板中一半的孔用于每个处理起始时间点。在每个时间点的其余48个孔中加入溶剂对照。在不同的终止时间点，我们将通过更换培养基来洗去各孔中的信号调节剂，在此操作过程中必须格外小心，以避免破坏胚胎体。在不同的终止时间点，通过更换胚胎体培养基来洗去调节剂。将96孔板倾斜约10度角，然后使用多通道移液器轻柔地移除孔中的培养基。对于超过 48 小时的处理，向每个孔中重新加入不含调节剂的 EB 培养基。每隔两天更换一次添加了新鲜调节剂的 EB 培养基，直至达到预期的终止时间。将胚胎干细胞转移至 96 孔板以诱导 EB 形成后第 7 天，通过显微镜观察 EB 的收缩情况。将出现收缩的拟胚体（EBS）所在的孔标记为阳性孔，以计算不同处理时间下收缩的拟胚体百分比。通过96孔板实验确定的心脏发生信号时间窗口，可在由悬滴法形成的悬滴拟胚体（EBS）中进行验证。首先，在培养皿中加入三到四毫升磷酸盐缓冲液（PBS），以防止后续悬滴发生变形。接下来，将制备好的胚胎干细胞悬液以每毫升2.5×10⁴个细胞的终浓度倒入细菌培养皿中以便操作。使用多通道移液器将20 µL胚胎干细胞悬液滴加到培养皿倒置的盖子上。注意各液滴之间不得相互接触。通常，一个皿盖最多可容纳80滴。然后将皿盖翻转，盖在含有PBS的培养皿上，在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育48小时，以促进拟胚体（EB）的形成。48小时后，用3毫升EB培养基将每个皿盖上由悬滴形成的拟胚体冲洗下来。将两个EBS盖子放入新的培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养4天。在第4天时，将悬浮状态的EBS转移至经0.2%明胶包被的6孔板中。每孔转移约30个EBS，并在悬挂液滴形成后第7天，根据96孔板实验确定的时间点加入信号调节剂进行培养。在显微镜下观察拟胚体（EBS）。在96孔板的圆底孔中培养的胚胎干细胞（ES细胞）将形成拟胚体，如本图所示为第4天形成的代表性拟胚体图像。胚胎干细胞向心肌细胞分化的关键时间点，是指在加入信号通路调节剂后，与对照组（溶剂处理组）相比，出现收缩性拟胚体比例最高的时间段。图中显示的是在96孔微量培养板上，经背部吗啡处理的胚胎干细胞在分化第10天时自发形成的心肌细胞收缩灶。观看本视频后，您应能够充分理解如何高效地识别胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中关键信号通路的重要时间调控节点和作用时间窗口。

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基因小鼠胚胎干细胞的基础含量为心源性诱导效率量化

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高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

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了解小鼠胚胎干细胞心肌分化的时间调控方法，通过96孔板标准化类胚体形成并量化收缩效率。该技术可精确识别Wnt/β-catenin和BMP信号通路的关键时间窗口，为心脏再生医学研究提供可靠平台。

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