基因小鼠胚胎干细胞的基础含量为心源性诱导效率量化
April 22nd, 2011
我们描述了一个小鼠胚胎干细胞实验，以确定Wnt信号/β- catenin和BMP期间心感应信号激活的关键时间窗。该方法提供了一个标准化的平台，可靠的量化心源性效率，它是适用于其他细胞谱系的研究。
以下实验的总体目标是确定小鼠胚胎干细胞中心肌细胞分化所需的关键时间调节。这是通过首先在 96 孔圆底板中形成胚胎体来实现的，以标准化 EB 形成作为第二步。在预定的时间过程中将蛋白质或化学调节剂添加到 EBS 中，这将允许对所检查的通路进行时间控制。
接下来，手动量化跳动的 EBS 以确定各种信号调制方案的感应效率。获得的结果表明，基于跳动 EBS 形成的百分比和使用悬滴法进行确认，显示了心肌细胞分化的基本信号通路的时间需求。与悬滴等现有方法相比，该技术的主要优点是它标准化和简化了劳动密集型程序，并允许直接读取以进行定量。
该方法可以帮助回答干细胞生物学领域的关键问题，例如识别引导分化至所需细胞类型的基本信号传导凝固 开始此程序。在 10 cm 细胞培养板中加入补充有白血病抑制因子的小鼠 ES 细胞培养基中的 Gro 小鼠胚胎干细胞。当 ES 细胞达到 50% 至 70% 汇合时，即可使用。
去除 ES 培养基，用 5 毫升无菌 PBS 冲洗细胞一次。向每个板中加入 2 毫升 0.05% tripsin EDTA，并在 37 摄氏度下孵育板 3 到 5 分钟。接下来，用每板 3 毫升 ES 培养基在 EDTA 中淬灭行程，并将细胞转移到 50 毫升离心管中。
以每分钟 1000 转的速度旋转 3 分钟。离心后，去除脊髓突起物，并用所需量的 EB 培养基重悬细胞沉淀。计数细胞数量，然后将细胞稀释至每毫升 10 至 3 个细胞的 5 倍。
在使用多通道移液器的 EB 培养基中，将 100 微升含有细胞的 EB 培养基添加到 96 圆底孔微量滴定板的每个孔中。所需的 96 孔板数量将取决于实验的条件和时间点的数量。将 96 圆底孔微量滴定板放入加湿的 37 摄氏度 5% 二氧化碳培养箱中，以确定心脏发生的关键信号通路的关键时间窗口。
特异性信号通路的调节剂被添加到 ES 细胞中。在 96 个圆底孔板中加入信号调节剂，其在培养基中在不同时间点稀释到每个孔中。每个 96 孔板中的一半孔用于处理的每个起始时间点。
在每个时间点向其他 48 个孔添加载体控制在不同的停止点，我们将通过更换培养基从每个孔中洗掉信号调节剂，这样做时必须非常小心，以防止破坏胚胎体在不同的停止时间点。通过更换孔的 EB 培养基来洗去调节剂。将 96 孔板倾斜约 10 度角，然后用多通道移液器轻轻地从孔中取出培养基。
然后将不含调节剂的 EB 培养基加回每个孔中，用于超过 48 小时的任何处理。每两天更换补充有新鲜调节剂的 EB 培养基，直到所需的停止时间。通过将 ES 细胞转移到 96 孔板诱导 EBS 7 天后，在显微镜下检查 EB 收缩。
将收缩 EBS 的井评分为阳性，以获得每个不同治疗时间过程中收缩 EBS 的百分比。由 96 孔板实验鉴定的心脏发生的信号传导的时间窗口可以在由悬挂液滴制成的 EBS 中验证，以制造悬挂的 EB 液滴。首先通过添加 3 到 4 毫升 PBS 来准备培养皿，以防止液滴的畸变。
接下来，将最终密度为 2.5 倍 10 比每毫升 4 个细胞制备的 ES 细胞悬液倒入细菌培养皿中，以便于取用。使用多通道移液器将 20 微升 ES 细胞滴到培养皿的倒置盖子上。不要让单个液滴相互接触。
通常，一个盖子最多可容纳 80 滴。然后将盖子翻转回含有 PBS 的培养皿上，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 48 小时，以形成 EB。48 小时后，用 3 mL EB 填料冲洗每个盖子上悬挂的液滴形成的 EBS。
将两个 EBS 盖子拉入新的培养皿中。第四天将培养皿在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 4 天，通常将悬浮液中的 EBS 转移到 0.2% 明胶涂层的六孔板上。在制备悬液滴后 7 天，在从 96 孔板实验中确定的时间段将 30 EBS 转移到每个孔中孵育信号调节剂。
在显微镜下观察 EBS 的 EB 收缩情况，在 96 孔板的圆底孔中生长的 ES 细胞将形成 EBS，如第 4 天形成的 EB 的代表性图像所示。ES 心动发生的关键时间点是与载体对照相比，包含信号调节剂治疗的收缩 EBS 百分比最高百分比的时间窗口。此处显示的是 96 孔微量滴定板上分化第 10 天由背侧吗啡处理的 ES 细胞形成的心肌细胞的自发收缩病灶。
观看此视频后，您应该对如何有效识别 ES 心脏发生中关键时间调节、关键信号通路的窗口有很好的了解。
概述
本研究概述了一种基于小鼠胚胎干细胞的检测方法，用于确定心脏发生诱导过程中Wnt/β-catenin和BMP信号传导的关键时间窗。该方法增强了心脏发生效率的量化，并可适用于其他细胞谱系。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 心脏发生
- 信号转导
背景
- 理解心肌细胞分化对再生医学至关重要。
- 信号通路的时间调控对于有效分化至关重要。
- 现有方法可能耗时较长且缺乏标准化。
- 本研究旨在简化和标准化该过程。
研究目的
- 识别心肌细胞分化的关键时间调控。
- 提供一个可靠的平台来量化心脏发生效率。
- 探索信号通路调控对分化的影响。
使用的方法
- 在标准化的96孔板格式中形成胚胎体（EBs）。
- 在预定时间内应用蛋白质或化学调节剂。
- 手动计数跳动的EBs以评估诱导效率。
- 使用悬滴法验证结果。
主要结果
- 确定了心脏发生过程中信号传导的关键时间窗。
- 标准化的方法允许简单地量化结果。
- 展示了将小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率。
- 通过多种实验方法确认结果。
结论
- 该检测方法为研究心脏发生分化提供了可靠的方法。
- 信号通路的时间控制对于有效分化至关重要。
- 该方法可应用于心肌细胞之外的其他细胞谱系。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay addresses a key challenge in stem cell-based drug discovery: the need for standardized, quantitative readouts of differentiation efficiency. By enabling temporal mapping of signaling pathway requirements, it supports mechanistic de-risking in early target validation and lead identification workflows. The 96-well format enhances reproducibility and scalability for enterprise R&D applications in cardiotoxicity screening and regenerative medicine pipeline development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying critical time windows for Wnt/β-catenin and BMP signaling in cardiomyocyte differentiation.
- Operational Value: Standardizes embryonic body formation and modulation in a 96-well plate format, reducing variability in pathway activation studies.
- Predictive Value: Quantifies cardiogenic induction efficiency via beating embryonic body scoring, supporting go/no-go decisions in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized platform for preparing validated biological systems for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Generates percentage-based readouts of contracting embryonic bodies, enabling dose-response and time-course analyses.
- Scalability: The 96-well format supports medium-throughput testing of signaling modulators and compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Generates cardiomyocyte-containing embryonic bodies that model human heart development and disease mechanisms.
- Translational Continuity: Results verified via hanging drop method ensure robustness across assay formats, supporting preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Temporal signaling data informs stage-appropriate progression of candidates from discovery to preclinical testing.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for cardiogenic pathways and differentiation-based therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of signaling pathway roles in lineage specification and biological de-risking of targets.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of compound effects on differentiation efficiency over defined time courses.
- Analytics: Delivers quantifiable dependent variable measurements (percentage of beating EBs) that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by providing disease-relevant cellular models validated through orthogonal methods.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized capability for studying multiple lineages beyond cardiogenesis, increasing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by clarifying mechanistic dependencies on temporal signaling dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across teams and sites through defined EB formation and quantification protocols.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early detection of ineffective or toxic modulators in differentiation pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on their ability to modulate critical signaling windows in cardiogenesis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, embryonic body formation, and microscopic assessment of contraction.
- Depends on access to 96-well round-bottom plates, incubators, and microscopy equipment for EB monitoring.
- Necessitates standardization of modulator timing, washout procedures, and scoring criteria across users.
- Adaptation to other lineages may require optimization of EB media, modulator types, and contraction scoring parameters.
- Manual quantification limits throughput; automation potential remains dependent on image-based contraction detection systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Embryonic Body (EB) Formation Using 96-round Bottom Well Microtiter Plates
3:24
Identification of Critical Time Windows of Key Signaling Pathway(s) for Cardiogenesis
5:04
Verification of Time Windows of Signaling for Cardiogenesis in EBs Made from Hanging Dropets
7:06
Determination of Critical Time Points for ES Cardiogenesis
7:45
Conclusion
