使用早期的小鼠胚胎组织特异性基因的染色质免疫沉淀检测
2011年4月29日
我们展示了染色质免疫沉淀（ChIP）的方法来识别组织特异性基因表达的组织特异性基因的小鼠胚胎组织中的发病因素相互作用期间或之后。此协议应广泛适用的组织特异性基因的激活的研究，因为它在正常胚胎发育过程中发生。
该程序的总体目标是分离 E 8.5 小鼠胚胎，用于染色质、免疫沉淀或 ChIP 测定。这是通过首先分离小鼠胚胎并制备单细胞悬液来实现的。该程序的第二步是将 DNA 结合的蛋白质化学交联到基因组 DNA 上，然后超声处理以片段化 DNA。
该程序的第三步是免疫沉淀蛋白质染色质复合物并分离纯化的 DNA。该程序的最后一步是通过常规 PCR 或定量实时 PCR 分析纯化的免疫沉淀 DNA。最终，可以获得显示蛋白质与发育组织和器官分化程序启动期间分化特异性基因的调节序列相互作用的结果。
本学期可以通过识别与分化特异性基因的调节序列相互作用的调节因子来帮助回答有关胚胎发生过程中分化程序启动的好问题。为了开始此过程，从胚胎第 8.5 天处死的小鼠中取出子宫角。根据批准的方案，使用剪刀将组织放入含有新鲜切片培养基的培养皿中。
单独切割每个植入部位，并将它们放入含有新鲜解剖培养基的培养皿中，以避免过多的血液。用镊子八，从每个植入部位去除子宫层，以暴露使用镊子分离单个胚胎的 de sidu 。在发育的这个阶段，胚胎被顶叶卵黄袋包围，该卵黄袋接触 Deum 组织、内脏卵黄袋和羊膜。
羊膜是与胚胎直接接触的透明膜。内脏卵黄袋位于羊膜和壁叶卵黄袋之间，在 8.5 吃 9.5 胚胎中很容易区分，因为存在滋养胚胎的突出血管。从其周围的膜中取出每个胚胎，并单独转移到含有解剖培养基的新板中，以去除多余的血液。
然后将每个胚胎转移到含有 200 微升解剖培养基的 1.5 毫升 einor 管中。分离胚胎的匀浆从添加 200 微升胶原酶开始。对每个含有胚胎的 einor管 type two 溶液。
在 37 摄氏度摇床中以 100 RPM 的速度轻轻摇动样品 20 分钟。然后通过抚摸来重悬样品以破坏细胞团块。将细胞悬液涂抹在 40 微米网孔大小的无菌细胞过滤器的顶部，该过滤器放置在 1.5 mL eend rph 管上。
立即将 600 微升室温 X-D-P-B-S 涂在细胞过滤器顶部以完成分离。过滤悬浮液后，丢弃细胞过滤器，将样品在 4， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。离心后，丢弃上清液 reus。
将每个沉淀悬浮在 1 毫升室温 1 X-D-P-B-S 中。然后将样品在室温下以 4， 000 G 离心 1 分钟。第二次丢弃 snat 后，将每个上颚重悬于 200 微升室温解剖培养基中，向 200 微升样品中加入 5.6 微升 37% 甲醛，使染色质交联，最终浓度为 1%。
孵育后，在室温下孵育样品 10 分钟，将样品在 4， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 3 分钟，然后弃去上清液。用含有 80 μL/mL 蛋白酶抑制剂混合物或 PIC 的冷 X-D-P-B-S 重悬细胞。然后将样品在 4， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 3 分钟。
弃去上清液后，样品可在零下 80 摄氏度下冷冻，并在超声处理前稳定数月，在冰上解冻冷冻细胞沉淀或将上一步的沉淀置于冰上。复苏悬浮后，将细胞调色板重新悬浮在 100 微升室温 SDS 裂解缓冲液中。再加入 100 μL 室温 SDS 裂解缓冲液，并通过移液和倒置重悬样品。
将细胞悬液在冰上孵育 10 分钟。孵育后，设置仪将交联 DNA 剪切至 200 至 500 个碱基对。在本演示中，使用了 DIO 基因生物断裂 UCD 200。
对被冰浆包围的样品进行超声处理。不要让它升温到 4 摄氏度以上或冷冻离心机。在 4 摄氏度下以 14， 000 G 的浓度对样品进行超声处理 10 分钟。
将上清液转移到新鲜的 eend DPH 管中，在冰上预冷。将超声处理的样品分成最多五份等分试样。在零下 20 摄氏度下储存一份等分试样，以保留他的输入以进行交联反转。
步骤：在含有新鲜添加的 PIC 的 ChIP 稀释缓冲液中以每 800 微升缓冲液 1 微升的速度将其他等分试样稀释 10 倍。首先，根据要用于 ChIP 检测蛋白的抗体确定哪些空气动力学速度将用于预清除。这里使用 A 珠子是因为用于 ChIP 的抗体是狂犬病的。
通过添加 75 微升 50% 鲑鱼精子、DNA 和蛋白质来预先清除稀释的超级蛋白。a aero speed 孵育 4 摄氏度并旋转孵育 1 小时，然后以 2， 500 G 离心样品，在 4 摄氏度下离心 1 分钟。将仰卧位转移到新的预冷端 DPH 管中。
将每个样品 4 μg 抗体添加到预先澄清的 Eloqua 中，并在 4 摄氏度下旋转孵育过夜。首先向每个样品中加入 60 微升鲑鱼精子、DNA 蛋白、aeros 珠子悬浮液，并在 4 摄氏度下旋转孵育 1 小时。将样品在 4 摄氏度下以 1000 G 离心 1 分钟。
离心后。小心地去除仰卧并丢弃，将 DNA 蛋白珠复合物保持在冰上。按照书面方案中的说明，使用缓冲液 1 到 4 进行复苏、悬浮和清洗托盘。
每次洗涤包括 5 分钟的孵育期，旋转，然后以 1000 G 离心 1 分钟，洗涤后去除上清液。通过 Resus 洗脱染色质抗体复合物 将洗涤后的染色质蛋白珠复合物悬浮在 250 μL 新鲜制备的洗脱缓冲液中，将每个样品剧烈涡旋 5 秒，然后在室温下孵育样品 15 分钟，然后在 2， 500 G 离心后旋转 1 分钟。在室温下，将每支洗脱液转移到新的 eph 管中。
重复 Elucian 过程，并将每个样品的洗脱液混合在同一 eph 管中。为了逆转交联，向每 500 微升洗脱液中加入 20 微升 5 摩尔氯化钠。对于先前保留的起始对照，每毫升添加 40 微升 5 摩尔氯化钠。
在 65 摄氏度的水浴中加热 EIT 4 小时。要在 2%aeros 凝胶上对 0.1 至 1 千碱基对的大小标记物上运行 10 微升起始量，以检查DNA片段大小。DNA 将显示为弥散条带，而不是尖锐的条带。
使用 kaya 快速凝胶提取试剂盒从每 500 μL 样品中回收 DNA。首先加入 600 μL qg 缓冲液，以优化 Kaya 快速离心柱中硅胶膜对 DNA 的吸收，然后在上样柱之前加入 200 μL 异丙醇。检查混合物以确定是否存在任何 SDS 沉淀。
如果发生 SDS 沉淀，则应在 42 °C 水浴中加热样品，直到沉淀消失。然后将样品涂在色谱柱上，并按照制造商的说明洗脱 DNA。SDS 会干扰 PCRT 聚合酶的活性，因此应在进行 PCR 之前完全去除。
将每个 DNA 样品在冰上孵育以沉淀任何残留的 SDS，并在 4 摄氏度下以 14， 000 G 离心 1 分钟。将 SANE 转移到新的浓度管中。DNA EIT 可以通过常规 PCR 或定量实时 PCR 或具有特异性引物的 QPCR 进行检测 对于每个要分析的序列，使用总 DNA IIT 中的 5 至 10 微升进行一次 PCR 或 QPCR 反应，PCR 和 QPCR 条件会有所不同。
然而，有限量的起始材料需要额外的 PCR 循环才能进行常规 PCR 检测，从 40 个循环开始，然后根据需要进行调整。使用该协议，已从 E 8.5 和 E 9.5 胚胎进行芯片处理。通过常规 PCR 和定量实时 PCR 分析芯片纯化的 DNA。
结果表明，在 E 8.5 和 E 9.5 胚胎中，生肌因子和调节因子存在于生肌因子和启动子上。相比之下，在未表达产肌的橡树囊中没有发生肌和与生肌和启动子结合的迹象。干扰素 γ 启动子包含与肌原结合位点匹配的序列，如预期的那样用作阴性序列对照 在任何测试的组织样品中，肌源性均未与干扰素 γ 启动子结合。
结果表明，Myogenic 在 E 8.5 和 E 9.5 胚胎体节中的 Myogenic 启动子处结合，因为 myo Genin 在体节中特异性表达在这些阶段，看完这个视频，你应该对如何分离和准备 EA 0.5 小鼠胚胎进行染色质沉淀评估有一个很好的了解，这将确定在发育组织中发现的组织特异性基因的调节因子。
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概述
本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，用于研究小鼠胚胎组织中组织特异性基因的因子相互作用。该协议旨在分析正常胚胎发育过程中的基因激活。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 遗传学
背景
- 染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于研究蛋白质-DNA相互作用的技术。
- 组织特异性基因表达对于正常胚胎发育至关重要。
- 了解这些相互作用可以为分化过程提供见解。
- 本研究关注特定发育阶段（E 8.5）的小鼠胚胎组织。
研究目的
- 分离E 8.5小鼠胚胎用于ChIP检测。
- 识别分化特异性基因调控序列的蛋白质相互作用。
- 分析发育组织分化启动过程中的基因激活。
使用的方法
- 分离E 8.5小鼠胚胎并制备单细胞悬液。
- DNA结合蛋白与基因组DNA的化学交联。
- 超声波处理以碎裂DNA。
- 蛋白质-染色质复合物的免疫沉淀和纯化DNA的分离。
主要结果
- 成功从胚胎组织中分离出DNA-蛋白质复合物。
- 识别了蛋白质与调控序列的相互作用。
- 结果可以使用常规PCR或定量实时PCR分析。
- 发育组织和器官中分化程序的见解。
结论
- ChIP方法对于研究组织特异性基因激活是有效的。
- 研究结果有助于理解胚胎发育和分化。
- 该协议可以应用于发育生物学的各种研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) in early-stage mouse embryos enables direct interrogation of protein-DNA interactions underlying tissue-specific gene activation during embryogenesis. This capability supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for developmental gene regulation. The approach is strategically positioned for discovery-stage programs focused on differentiation pathways and tissue lineage specification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables identification of regulatory factor binding at differentiation-specific gene promoters in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying when and where transcription factors engage target loci.
- Provides functional evidence for tissue-specific gene activation during lineage commitment.
- Facilitates triage of candidate targets based on direct chromatin engagement in relevant cell populations.
Screening & Assay Development
- Generates validated chromatin samples for downstream quantitative PCR analysis of factor occupancy.
- Establishes reproducible workflows for limited primary tissue, supporting assay standardization.
- Enables quantitative comparison of protein-DNA interactions across developmental stages or conditions.
- Prepares the foundation for screening regulatory factor perturbations in embryonic contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin state analysis with disease-relevant developmental windows.
- Supports continuity from discovery of regulatory mechanisms to preclinical models of tissue specification.
- Provides a platform for evaluating the impact of genetic or pharmacological interventions on gene activation.
- Enables risk-adjusted advancement of targets with validated developmental engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This ChIP protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct measurement of regulatory factor binding during early tissue specification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for transcription factor involvement in gene activation during embryogenesis.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts of chromatin engagement for assay development.
- Analytics: Provides PCR-based quantification of factor occupancy at specific promoters.
- Translational Research: Bridges mechanistic discovery with preclinical validation in disease-relevant developmental stages.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable protocol adaptable to diverse tissue-specific gene regulation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming in vivo chromatin interactions.
- Operational Value: Standardizes workflows for low-input embryonic tissue, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of regulatory engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional chromatin data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and chromatin handling.
- Demands access to sonication, immunoprecipitation, and quantitative PCR instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility with limited tissue input.
- Adaptable to various developmental stages and tissue types with protocol optimization.
- Limited by cell-type heterogeneity, as interactions are detected at the tissue rather than single-cell level.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Isolation of Embryos
2:35
Homogenization of the Isolated Embryo and Chromatin Crosslinking
4:21
Sonication
5:38
Pre-clearing and Immunoprecipitation
6:25
Washing and Elution of the Chromatin
7:34
Reverse Cross-link and Recover DNA
8:47
Analysis of Recovered DNA
9:39
ChIP Assay Results for E8.5 and E9.5 Embryos
10:35
Conclusion
