利用小鼠早期胚胎对组织特异性基因进行染色质免疫沉淀实验

本实验的总体目标是分离 E 8.5 小鼠胚胎，用于染色质免疫沉淀或芯片分析。首先分离小鼠胚胎并制备单细胞悬液。实验的第二步是通过化学交联将DNA结合蛋白与基因组DNA交联，随后进行超声处理以打断DNA。

该实验步骤的第三步是免疫沉淀蛋白质-染色质复合物，并分离纯化的DNA。最后一步是通过常规PCR或定量实时PCR分析经免疫沉淀纯化的DNA。最终可获得结果，显示在发育中的组织和器官启动分化程序期间，蛋白质与分化特异性基因的调控序列之间的相互作用。

本学期可通过鉴定在分化特异性基因获得转录能力时与其调控序列相互作用的调控因子，帮助回答胚胎发生过程中分化程序启动的相关重要问题。开始该实验步骤时，从一只在胚胎第8.5天被处死的小鼠中取出子宫角。根据已批准的实验方案，使用剪刀将组织放入含有新鲜切片培养基的培养皿中。

逐一剪下每个植入部位，并将其置于含有新鲜解剖液的培养皿中，以避免过多血液。用镊子剥离每个植入部位的子宫层，暴露蜕膜组织，进而用镊子分离出单个胚胎。在此发育阶段，胚胎周围包裹着壁层卵黄囊，该结构与蜕膜组织、内脏卵黄囊以及羊膜相接触。

羊膜是一种透明的膜，直接与胚胎接触。卵黄囊的脏层位于羊膜与壁层卵黄囊之间，在8.5至9.5天的胚胎中，可通过其上明显的血管结构轻易识别，这些血管为胚胎提供营养。将每个胚胎从其周围的膜结构中分离，分别转移至含有解剖培养基的新培养皿中，以去除多余的血液。

然后将每个胚胎转移至含有200微升解剖培养基的1.5毫升离心管中。分离胚胎的匀浆步骤始于向每根含有胚胎的离心管中加入200微升胶原酶II型溶液。

将样品置于37摄氏度、100 RPM的摇床中轻轻振荡20分钟。然后通过轻拍重悬样品，以分散细胞团块。将细胞悬液加至置于1.5毫升离心管上方的无菌40微米孔径细胞筛上。

立即在细胞筛上加入 600 微升室温的 1× D-PBS，以完成分离。待悬液过滤后，弃去细胞筛，将样品在 4 摄氏度下以 4,000 ×g 离心 5 分钟。离心后，弃去上清液。

将每个沉淀重悬于1毫升室温的1×D-P-B-S中。然后在室温下以4,000 G离心样品1分钟。第二次弃去上清后，将每个沉淀重悬于200微升室温的解剖培养基中。通过向200微升样品中加入5.6微升37%甲醛，使染色质交联，最终甲醛浓度为1%。

孵育样品在室温下10分钟，孵育结束后，在4,000 G离心3分钟（温度为4摄氏度），弃去上清液。用预冷的含蛋白酶抑制剂混合物（PIC，每毫升80微升）的1×D-P-B-S重悬细胞。然后在4,000 G、4摄氏度条件下离心3分钟。

弃去上清液后，样品可在-80摄氏度下冷冻，并在超声处理前数月内保持稳定；将冷冻的细胞沉淀置于冰上解冻，或将前一步骤获得的沉淀置于冰上。在100微升室温SDS裂解缓冲液中重悬细胞沉淀，重悬后，再加入100微升室温SDS裂解缓冲液，通过移液和倒置混匀使样品重新悬浮。

将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。孵育结束后，设置超声破碎仪，将交联的DNA剪切至200至500个碱基对之间。本实验中使用DIO geno bio rupture UCD 200仪器。

将样品置于冰浴中进行超声处理。注意避免样品温度升至4摄氏度以上或发生冷冻离心。在4摄氏度条件下，以14,000 ×g离心10分钟。

将上清液转移至预冷的冰上新鲜 eend DPH 管中。将超声处理后的样品最多分为五份等份。取其中一份等份储存于 -20 摄氏度，以保留其输入用于交联逆转。

将其他等分试样在含有新鲜添加的PIC（每800微升缓冲液中加入1微升）的芯片稀释缓冲液中进行十倍梯度稀释。首先，根据芯片实验所用抗体确定用于预清除的aero转速。此处使用A beads，因为芯片实验所用抗体为rabid。

加入75微升50%的鲑鱼精子DNA-蛋白质溶液至稀释后的上清液中进行预清除。在4摄氏度下以旋转孵育1小时，随后在4摄氏度下以2,500 ×g离心1分钟。将上清液转移至新的预冷的EP管中。

每份样品中加入四微克抗体至预清除的Eloqua中，4°C条件下旋转孵育过夜。首先，向每份样品中加入60微升鲑鱼精子DNA-蛋白质A/蛋白质G磁珠悬浮液，在4°C条件下旋转孵育一小时。在4°C条件下以1000 ×g离心一分钟后收集样品。

离心后，小心移除上清液并弃去，将DNA-蛋白质-磁珠复合物置于冰上。按照书面实验方案中的描述，使用缓冲液一至缓冲液四重悬并洗涤沉淀。

每次洗涤包括在旋转条件下孵育五分钟，然后在1000 G离心一分钟，并在洗涤后弃去上清液。通过将洗涤后的染色质-蛋白珠复合物重悬于250微升新鲜配制的洗脱缓冲液中，洗脱染色质-抗体复合物，每个样品剧烈涡旋5秒，然后在室温下旋转孵育15分钟，随后在2,500 G离心一分钟。在室温下，将每个洗脱液转移至新的EP管中。

重复洗脱过程，并将每个样本的洗脱液收集到同一个离心管中。为逆转交联，向每500 µL洗脱液中加入20 µL 5 M氯化钠。对于之前保留的输入对照，每毫升加入40 µL 5 M氯化钠。

将EITs置于65摄氏度水浴中加热四小时。取每个样本10微升，在2%琼脂糖凝胶上与0.1至1千碱基对大小标记物相邻进行过夜电泳，以检测DNA片段大小。DNA将呈现为弥散条带，而非清晰锐利的条带。

使用kaya快速胶回收试剂盒从每个500 µL样品中回收DNA。首先向样品中加入600 µL QG缓冲液，以优化DNA在kaya快速离心柱硅胶膜上的吸附，然后在上样前加入200 µL异丙醇。检查混合物中是否存在SDS沉淀。

如果出现 SDS 沉淀，应将样品置于 42°C 水浴中温育，直至沉淀消失。然后按照制造商说明书将样品加入层析柱并洗脱 DNA。SDS 可能会干扰 PCRT 聚合酶的活性，因此在进行 PCR 前必须完全去除。

将每个DNA样品置于冰上孵育，以沉淀任何残留的SDS，并在4°C下以14,000 G离心一分钟。将上清液转移至新的离心管中。DNA EITs可通过常规PCR或定量实时PCR（QPCR）进行检测，需使用针对每个待分析序列的特异性引物。每个PCR或QPCR反应使用总DNA IIT中的5至10微升，PCR和QPCR的反应条件会有所不同。

然而，起始材料的量有限，因此常规PCR检测需要增加PCR循环次数，起始可设为40个循环，并根据需要进行调整。使用本方案，已成功对E 8.5和E 9.5胚胎来源的样品进行了ChIP实验。ChIP纯化的DNA通过常规PCR和定量实时PCR进行分析。

结果表明，在 E 8.5 和 E 9.5 胚胎中，成肌调节因子存在于成肌基因及其启动子区域。相比之下，在成肌基因不表达的卵黄囊中，未检测到成肌调节因子与成肌基因启动子的结合。作为阴性序列对照，干扰素γ启动子含有与成肌因子结合位点匹配的序列，正如预期，在所有检测的组织样本中，成肌因子均未结合干扰素γ启动子。

结果表明，在 E 8.5 和 E 9.5 胚胎的体节中，Myogenic 结合于 Myogenic 启动子区域，此时 myo Genin 在体节中特异性表达。观看本视频后，您应充分了解如何分离和制备 E 8.5 小鼠胚胎，用于染色质免疫沉淀实验，以鉴定发育组织中组织特异性基因的调控因子。