从废弃的人类胎儿皮质组织中生成神经干细胞

本实验的总体目标是从废弃的额叶皮质组织中分离出人类神经干细胞。首先需提前配制所需的溶液和准备材料，然后解剖人类胎儿脑组织。随后对分离得到的神经干细胞进行培养，包括进一步扩增、鉴定以及开展相关实验研究。

长期保存是可行的，也可建立亚培养物以诱导前体细胞分化为神经元和胶质细胞类型。最终，可对来自正常中枢神经系统的细胞分化过程进行表征，并与已知神经系统疾病患者的中枢神经系统来源细胞的分化过程进行比较。该技术的应用前景涵盖任何人中枢神经系统疾病的治疗或诊断。

该技术为评估病理性S以及评价针对特定疾病的新型药物的药理学功效提供了一个简单且可靠的平台。由于多能细胞具有极高的价值，因此在开始实验方案之前，所有材料都需提前准备就绪。为最大限度降低样本受损风险，应预先准备好冷藏解剖工具、37摄氏度预热的培养基、冷藏的细胞以及用于长期保存的冷冻保存液。

用于解剖的冷冻保存样本，需提前准备好无菌高压灭菌的镊子、带手柄的手术刀片以进行细胞分离。准备移液枪、10 毫升移液管和 40 微米细胞筛网。另准备几个 10 厘米的培养皿用于解剖，放置一旁备用。

用于解离的50毫升离心管，用于组织储存的1.5毫升离心管，以及用于细胞冻存的冻存管。为确保成功，需在组织可获取后的两小时内收获18至22周龄的有活力组织。

理想情况下，可通过安排在选择性手术后立即采集，从而在组织可获取后的几分钟内获得胎儿组织。尽管这些组织常呈碎片状，但大脑的相当一部分仍保持完整。将大脑组织采集至一个装有冰冻解剖液的10毫升培养皿中。

通过解剖学标志识别皮层的不同区域。额叶与顶叶、枕叶皮层的边界由中央沟和外侧裂的延伸交点确定。使用手术刀从中央沟前方的额叶皮层以及沿外侧裂边缘处分离组织。

确保保持脑室完整且无损伤。现在，清除分离出的额叶皮层组织块上残留的血液和软脑膜。如果样本未过度破碎且体积足够大，可将组织块分割成若干较小样本，以保留部分用于组织学以及蛋白质或 mRNA 检测。

现在将一块脑组织转移至50毫升离心管中，并加入三倍于组织体积的冰上预冷的解剖液。使用移液器轻轻吹打组织，直至所有组织完全破碎成碎片。为充分悬浮细胞，需通过40微米细胞滤网进行过滤。

现在将细胞悬液离心，并将细胞沉淀重悬于10毫升新鲜的、预温的培养基中。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数，并计算出200万个细胞所需的体积。随后，将每份含有200万个细胞的体积转移至25平方厘米的培养瓶中。

用5毫升预热的培养基制备。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养一周。对于更长时间的培养，每周更换一半培养基。培养1至2周后，通常会形成神经球，其神经干细胞直径在200至400微米之间。

将神经球解离为单个细胞。用含EDTA的Hank's培养基孵育细胞15分钟。为制备悬浮细胞用于传代培养，离心收集细胞，用Hank's液洗涤，并将细胞重悬于温热的培养基中。

为启动分化，将解离后的细胞接种于多聚赖氨酸-层粘连蛋白包被的盖玻片上，接种密度为每张盖玻片100,000个细胞，孵育30分钟。这些细胞可轻松分化为少突胶质细胞、神经元或星形胶质细胞。

进行神经元分化时，将细胞在含B27的培养基中培养七天。进行星形胶质细胞分化培养时，将细胞在含FBS的培养基中培养七天。进行少突胶质细胞分化时，先将细胞在含有生长因子的改良培养基中培养两天，之后两天使用不含生长因子的相同改良培养基继续培养五天，以储存干细胞。

将离散的细胞悬液离心后，重悬并以每管1000万个细胞的浓度悬浮于冻存液中。每毫升样品先在-20摄氏度缓慢冷冻，随后于-80摄氏度冷冻以进行长期保存，最后转移至液氮中。

随后将细胞在37摄氏度水浴中快速解冻并重悬。用预热的D-M-E-M-F 12培养基加10%血清洗涤。将预热的细胞离心、吸除上清，再重悬于预热的培养基中。

来自正常胎儿的中等大小神经干细胞。在妊娠18周时，这些细胞被培养形成神经球，并转染了GFP。随后将神经球诱导分化为多种细胞类型，固定后用细胞标志物和rumine进行染色。

通过表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物，可观察到多向分化潜能。观看本视频后，您应能够充分理解如何从废弃的额叶皮质组织中分离、扩增和操控人类神经干细胞。该区域为研究人类皮质环境相关疾病的最大可能性提供了独特机会，并可用于测试药物治疗剂的潜在疗效。