ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

以下实验的总体目标是利用一种新的快速信号放大方法在流感芯片、低密度微阵列平台上检测和表征流感病毒亚型。这是通过掺入生物素化的 DTP 并使用具有五个引物磷酸端的引物来扩增流感 RNA 提取物中的基质基因片段和非结构基因片段来实现的。PCR 之后进行酶消化和片段化，生成短的单链生物素化和扩增的病毒产物，然后在杂交后与阵列杂交。

Fox 检测使用光聚合在发生杂交的地方生长大的聚合物点，并使用差异杂交模式来检测流感病毒亚型。与标准荧光检测等现有方法相比，该技术的主要优点是它相当便宜，并且提供肉眼可见的快速结果，对荧光具有相似的分析灵敏度。尽管这种方法可以使用流感芯片深入了解流感病毒的特征，因为它是一种通用的检测方法。

Ampl Fox 还可用于各种其他系统，例如其他基于 DNA 和蛋白质的低密度微阵列芯片。理论上，任何生物素化产品都应该能够使用 amox 进行检测。演示该程序的是 Endeavor 的副科学家 Amber Taylor 和研究助理 Kevin Moulton，他们在过去几年中一直是 Fox 仪器和检测化学开发的核心。

使用病毒 RNA 提取试剂盒和制造商的方案从 200 μL 病毒分离物中提取病毒 RNA。洗脱 60 μL 最终体积，并将提取物储存在零下 70 摄氏度或更低温度下以备后用。然后根据制造商的方案在 ICE 上制备 R-T-P-C-R 预混液。

使用生物素化的 DNTP 混合物，添加流感芯片引物混合物，其中包含预混液中显示的浓度。每组中的一个引物应包含一个 5 引物磷酸基团，以促进酶消化。流感 A 引物组产生 1032 碱基对产物，流感 B 引物组产生 811 碱基对产物。

短暂涡旋并将 18 μL 预混液分配到薄壁 PCR 管中。然后向每个反应管中加入 2 μL RNA 模板。将 PCR 管转移到热循环仪上，并使用具有适当跪姿温度的循环曲线。

该测定中使用的循环曲线如下所示。每个 PCR 反应将 2.2 μL 酶反应缓冲液、0.8 μL 无核酸酶水和 1.0 μL λ核酸外切酶混合，制备酶消化混合物。从热循环仪中取出样品，并向每个 PCR 管中加入 4 微升。

将样品放回热循环仪中，如图所示将热循环仪编程至 37 摄氏度 15 分钟，然后是 95 摄氏度 10 分钟。接下来，在要杂交的微阵列周围应用一次性杂交孔。然后在定轨摇床上用 110 mL 纯净水洗涤玻片 5 分钟。

用纸巾轻轻接触孔边缘，擦干载玻片。将 22 μL 的 2 x 杂交缓冲液与每个片段化的单链 DNA 产物短暂混合混合，然后将 40 μL 移液到微阵列孔中。杂交后，让载玻片在湿度室中杂交一小时，从湿度室中取出载玻片，并用两毫升洗涤缓冲液短暂冲洗每张载玻片 D.将载玻片放入载玻片架中。

接下来，使用轨道摇床将 110 毫升洗涤缓冲液 A 和 B 添加到分离的容器中。在缓冲液 A 中以 60 至 90 RPM 的速度洗涤玻片架，该速度用于所有后续洗涤，持续 1 分钟。然后从洗涤缓冲液 A 中取出玻片架，用洗涤缓冲液 D 短暂冲洗，将玻片架转移到洗涤缓冲液 B 中，并在轨道摇床上洗涤 5 分钟。

洗涤后，用纸巾轻轻擦干每张载玻片上的阵列，并将干燥的载玻片放入湿度室中。在准备 fox 色度检测步骤时，为每个要处理的阵列混合 10 微升振幅、20 微升 2 x 振幅缓冲液和 10 微升纯化水，将 40 微升标记混合物转移到每个阵列中，并允许标记反应在密闭的湿度室中进行 5 分钟在杂交过程中， 在容器中制备 110 mL 洗涤缓冲液 C。标记后，立即用洗涤缓冲液 D.将每个载玻片放入载玻片架中，在缓冲液海洗后，在轨道振荡器上洗涤缓冲液 C 5 分钟，将载玻片架短暂浸入纯化水容器中 3 次。

要去除盐残留物，如前所述干燥阵列。将阵列储存在深色载玻片盒中，直到光激活和成像，这应在 24 小时内完成。接下来，打开 Amli Fox 阅读器并确保 Amli 视图软件在阵列样品检测之前已准备好进行光激活。

首先，通过遵循简短的校准程序确定所有样品的最佳光激活时间。每天使用一次，然后将 Amplify 溶液加热至室温并短暂涡旋，将 3 微升 Amplify 增强剂移液管混合到扩增瓶中并彻底涡旋。在 10 秒内，将 40 微升 Amplify 溶液均匀地涂抹在一张玻片上，一次只涂在一张玻片上，确保没有气泡。

将微阵列玻片插入 Amplify Reader 的照片激活槽中。通过选择开始光激活，在 PL view 软件中使用校准过程中确定的光激活时间启动。完成后，用 2 毫升纯净水冲洗微阵列芯片以去除多余的扩增，现在在含有目标 DNA 的斑点上已经形成了透明的聚合物，但可视化效果更好。

染色后，让聚合物斑点干燥 2 分钟。然后将两滴 Amply Red 滴到阵列上，让染色进行两分钟染色后，用纯净水快速冲洗载玻片并如前所述干燥，将载玻片插入 Amli Fox 阅读器的成像槽中，以使用 amli 软件收集图像以处理结果。左图显示了 Amli Fox 对 2009 年新型 H one N one 标本的检测。

虽然右侧的图像使用共聚焦荧光微阵列扫描仪生成的传统荧光，但两种方法都可以很容易地看到相同的整体检测模式。但是，Amli fox 的结果是肉眼可见的。这些图像显示了来自人类源性的流感芯片结果，H 3 N 2 人源性，H 1 N 1，猪源性，H 1 N 1，以及缺乏可检测流感的阴性狐狸阵列。

以蓝色勾勒出的序列 2 和 3 产生所有流感的信号。显示了一个亚型，但右下角以红色勾勒的序列仅产生猪来源的信号，H one N one 标本。阴性样品在内部对照序列上显示绿色轮廓的信号，表明 R-T-P-C-R 反应没有抑制或失败。

掌握后，从样品瓶提取到 amox 检测和最终结果解释的整个过程可以在大约 6 小时内完成。按照此程序，该程序的 Ampl Fox 检测部分（包括仪器校准）可以在大约 30 分钟内完成。可以执行其他方法，如部分或全基因组测序，以回答其他问题。

该流感检测旨在作为初步筛选，特别是对于产生独特杂交模式的样品。由于检测是一种通用检测方法，我们希望研究人员能够发现新的和有趣的低密度微阵列芯片应用，检测可以增加其价值。