采用脉动流灌注的离体、通气并插管小鼠肺脏的表征

为了研究脉动性肺动脉压力与血流的关系。本方案介绍了如何分离、通气并灌注小鼠肺脏。通过手术暴露气管以进行通气。

然后分离心脏和肺，以插管肺动脉和左心房。接着对肺系统进行灌注。通过改变肺动脉的血流、幅度、波形和/或频率来进行实验。

记录所获得的肺动脉和左心房压力波形，以展示脉动性肺部压力-血流关系。该技术相较于现有方法（如在体 preparations）的主要优势在于，能够在容量状态、交感神经系统张力、活动状态以及麻醉影响均保持不变的情况下，获得压力-血流关系的变化。脉动性压力-血流关系可在上述因素不变的条件下被准确测定。

此外，大多数离体肺组织制备方法仅能测量稳态下的压力-流量关系，而我们的技术能够测定脉动状态下的压力-流量关系。该方法有助于回答肺生理学领域的一些关键问题，例如肺血管疾病如何影响脉动性肺血流动力学，或大肺动脉硬化如何影响右心室后负荷？该方法的可视化演示至关重要，因为暴露心脏和肺组织并将导管固定在肺动脉中的操作较难掌握。

仪器产生的过压可能导致肺部水肿，导管放置不当可能刺破肺动脉。在开始实验之前，必须准备好用于通气和灌注离体肺的IL one系统。应将管路连接至压力传感器。

使用预热至 37 摄氏度的蒸馏水彻底冲洗单泵和流量计系统，并清除管路中的任何气泡。然后用 1% PBS 预先润洗 Endur tech 泵管路。现在归零。

通过首先关闭每个P 75传感器通向IL系统的阀门并打开其通向大气的阀门，来对传感器进行压力归零。然后使用SIS放大器插头自动将压力调零，在准备动物之前，通过将陶瓷多孔部件浸入蒸馏水中来润湿IO一套装置。在麻醉小鼠后，通过将其前爪固定在软木板上以稳定小鼠，为手术做准备。

现在用95%酒精喷洒胸部。用直镊子夹住颈部皮肤，用直剪刀剪开一个一厘米的切口。暴露颈部内部后，在寻找食管和气管的同时，剪除浅层肌肉中的白色腺样组织。

从两侧及后方分离食管和气管周围的组织，并在气管周围打一个松散的缝线。为进行气管插管，用小剪刀小心地在气管一侧剪一个微小的V形切口。然后用钝头镊子将小鼠移至IL one系统。

抓住气管插管，将其插入气管中。用缝线固定插管。先用室内空气开始通气，用酒精喷洒胸部，然后用直镊子和直剪刀去除皮肤。

沿胸骨向上剪开皮肤。将两侧皮肤提起，沿下肋骨边缘剪开。用镊子夹住剑突，使用圆头剪刀在膈肌与胸骨底端连接处剪一个小孔。

抓住膈肌，并将其从肋骨上剪下。使用圆头剪刀再次夹住剑突，然后用圆头剪刀沿胸骨向上小心剪开肋骨，注意不要损伤肺、心脏或血管。为暴露心脏，抓住左侧肋骨并剪去其尖端。

现在缓慢向右心室注射 0.1 毫升肝素。注射后，剪除其余肋骨。在显微镜下剪断肋骨时，使用镊子的背面或圆头轻轻将肺组织从肋骨处推开。去除覆盖在心脏上方脂肪中的腺体组织。

使用镊子拉开组织并将其剪除。用弹簧剪在主动脉和肺动脉周围放置缝线，用钝头镊子轻轻托起心脏。操作时应无明显阻力。

现在用双扣打一个松散的缝合结。接着，切开下腹部。使用弯头剪刀沿肋骨和脊柱向下剪开。

这将导致大量血液流出。使用棉签止住血流。待血液停止流出后，用装有10毫升RPMI的注射器中的4毫升RPMI对IL系统进行预灌注。

最好仔细检查导管内是否含有气泡。现在通过在心尖附近切一个小切口并插入插管，对右心室进行插管，方向朝右下方以进入肺动脉。探针的尖端应能透过近乎透明的肺动脉壁清晰可见。

然后收紧缝线，将套管固定于主动脉和肺动脉，以插管左心室。在心尖处剪一个小切口，将套管向上插入左心房。寻找瓣膜时可能需要轻微施压，但一旦找到，套管便会顺利通过并牢固固定，无需缝线固定。

使用10毫升注射器以每分钟0.3毫升的速度手动灌注RPMI，直至观察到流出管路中有液体流动。若流出管路中无液体流动，需重新调整左心室插管的位置。然而，若肺部无液体流动，则应终止实验，因为肺动脉可能存在泄漏。

心脏完全插管后，将60毫升注射器连接至IL one系统。使用稳流泵以每分钟1毫升的速度灌注RPMI Perfuse八。在初始灌注期间检查有无渗漏。

继续逐渐灌注肺脏两分钟，期间肺脏将变为白色。用于脉动流研究时，首先将单泵活塞位移设定至所需水平。

然后设定稳定的流速。现在打开通往osli泵的阀门，并在运行osli流速程序前立即开始记录数据。完成后，打开数据输出文件，根据初始试验获得的实验流速绘制实验流量曲线。

在每个频率下调节振荡泵活塞的位移，使 Q max 达到所需值。在稳态流动试验的数据采集过程中，保持通气压力恒定，关闭通往单泵的阀门，并将稳态流速设定至所需水平。开始记录数据，并逐步执行稳态流动方案。

每次试验之间，在每个流速下至少采集10秒的数据。将流速重置为0.5毫升每分钟。在数据采集过程中，务必保持通气压力恒定。

若需进行左心房压力为零的试验，在试验过程中应移除流出管路。密切观察气道管路中是否出现RPMI。必须防止RPMI到达气道压力传感器，否则将导致传感器损坏。

以下是不同条件下稳态流动灌注的结果，第一行为灌注流量 Q，第二行为相应的肺动脉压和左心房压。在前两个图中，由于出口管路处于连接状态，左心房压随流量 Q 的增加而升高，随 Q 的减小而降低；第一个图显示气道末端吸气末压力，第二个图显示气道末端呼气末压力。随后移除了管路，使左心房压保持恒定且不受流量 Q 的影响。接着手动调节出口管路的高度，使左心房压升高。

但与Q无关，第一个图显示了吸气末的气道压和吸气压，第二个图显示了呼气末的气道压和呼气压。通过绘制压力与流量的关系图，可得到每种情况下的稳态肺动脉压力-流量关系。

上图显示了脉动流灌注的结果，其中上图显示了流量 Q，以及相应的肺动脉、左心房和气道压力。下图显示了脉动肺压力-流量关系，据此可计算肺血管阻抗，该参数反映了右心室的总后负荷。

掌握该技术后，整个操作可在 20 到 30 分钟内完成。在进行该操作时，重要的是要保持耐心并放松，以确保双手稳定。一旦肺部得到充分灌注，最困难的部分就已完成。

完成该操作后，可进一步对肺组织进行组织学或生化检测，以回答其他问题，例如：哪些分子机制导致了肺部脉动性压力-血流关系的改变。该技术为肺生理学领域的研究人员探索特定基因和蛋白质在肺血管疾病发生与发展中的作用提供了途径，可利用基因修饰小鼠开展相关研究。