Name: 表征隔离，通风，和仪表小鼠肺灌注与脉动流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 了解小鼠肺隔离、通气与脉动灌注技术，用于研究肺血管压力-血流关系及右心室后负荷。该方法可精确测量稳态与脉态肺血流动力学，为肺动脉高压等心血管疾病研究提供可靠实验模型。

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本研究由美国国立卫生研究院资助项目 R01HL086939（NCC）支持。

在本实验方案中，我们展示了一种离体、通气且灌注的小鼠肺制备方法，该方法先前已被用于量化肺栓塞和慢性缺氧对肺血管脉动性压力-流量关系的影响（Tuchscherer, Webster, &amp; Chesler, 2006; Tuchscherer et al., 2007）。简而言之，通过手术将小鼠肺从周围组织中分离后，置于一个加热的腔室（IL-1；Harvard Apparatus，Holliston，MA）中，并使用通气控制模块（VCM-R）配合计时计数模块（TCM；Harvard Apparatus）进行通气。肺血管系统通过注射泵（Cole-Parmer，Vernon Hills，IL）灌注预热的含3.5% Ficoll的RPMI 1640细胞培养基，以产生稳定的流动波形；同时可并联使用高频振荡泵（Bose -Electro Force，Eden Prairie，MN）与注射泵共同作用，以建立脉动性的肺血管流动波形。压力传感器（P75，Harvard Apparatus）用于测量瞬时肺动脉压（PAP）和左心房压（LAP）。瞬时血流速率（Q）通过串联式流量计（Transonic Systems, Inc.，Ithaca，NY）测定。基于上述测量数据可推导出脉动性压力-流量关系，从而为肺血管生理学与病理学以及右心室后负荷提供深入见解。
1. 仪器：
<ol>
	<li>包括小鼠呼吸机的离体肺装置</li>
	<li>数据采集系统及配备 LabView 程序的计算机</li>
	<li>两个压力传感器和用于灌注液流速测量的流量计</li>
	<li>用于气道流速测量的压力传感器和流量计（气流流量计）</li>
	<li>高频振荡泵及配备 Win Test 程序的计算机</li>
	<li>显微镜吊臂/变焦显微镜、光源灯</li>
	<li>用于 IL-1 系统的高功率循环泵恒温浴槽</li>
</ol>
2. 准备IL-1系统
<ol>
	<li>通过水浴加热至37°C的蒸馏水被循环注入IL-1系统的内部。</li>
	<li>所有泵、传感器和IL-1套管均通过洁净的管路连接，所有管路均用加热至37°C的蒸馏水冲洗。必须排除可能进入肺部并引起水肿的气泡。从振荡流泵到流量传感器以及从流量传感器到肺动脉套管的管路用1% PBS冲洗。</li>
	<li>通过关闭套管阀门、打开通向大气的阀门，然后按下PLUGSYS放大器上的自动归零按钮，对P75压力传感器进行归零。随后，关闭通向大气的阀门，打开通向套管的阀门。</li>
	<li>IL-1系统通气路径中的陶瓷多孔部件需润湿以提供湿度。</li>
</ol>
3. 溶液
<ol>
	<li>配制体积分数为3.5%的Ficoll-RPMI溶液，并对培养基进行无菌过滤。过滤可确保培养基中无可能意外栓塞肺部的大颗粒物质。使用无菌培养基还可降低肺部突发性水肿的发生概率。准备一支10 ml注射器装入RPMI用于手术，另准备一支60 ml注射器装入RPMI用于每次实验。将灌注液置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>按每100克小鼠体重500 IU的剂量准备1 ml肝素溶液（约为此剂量）。肝素钠盐的效价为158 IU/mg。对于一只约25 g重的小鼠，将1.25 mg肝素钠盐与1 ml PBS溶液在微型离心管中混合。</li>
</ol>
4. 小鼠通气
<ol>
	<li>向小鼠腹腔注射 150 mg/kg 的戊巴比妥钠溶液后，通过用力捏压足掌确认是否达到深度麻醉状态。若无反应，则将小鼠前肢固定于软木板上以保持术中稳定。注意：整个实验过程中需密切观察动物状态以监测麻醉深度。足部的固定针及频繁的切口操作可作为有害刺激，若动物无反应，则表明其持续处于外科麻醉水平。</li>
	<li>用 95% 酒精喷洒胸部以浸湿毛发，使用直镊夹住颈部皮肤，用直剪剪开约 1 cm 的皮肤切口。</li>
	<li>暴露颈部内部后，清除所有白色腺体组织及浅层肌肉，寻找食管和气管。将食管和气管从两侧及后方的周围组织中分离出来。</li>
	<li>将小型弯镊插入气管下方，并在对侧夹住一段缝线，将缝线从气管下方穿过并打一个松散的外科结。此时不要拉紧缝线或打结。</li>
	<li>用小剪刀在气管上剪一个微小的“V”形斜口，注意不要完全切断气管。将软木板和小鼠移至加热的 IL-1 系统中。使用两把钝头镊子，分别夹住气管插管和“V”形切口下方的气管组织，然后将气管插管经“V”形切口滑入气管内。收紧环绕气管和气管插管的缝线，以固定插管位置，随后打结结扎。</li>
	<li>开始通气（吸气相 50%，呼吸频率 90 次/分钟，含深吸气），使用室内空气进行通气。</li>
</ol>
5. 灌流通气小鼠
5.1. 进入右心室以注射肝素
<ol>
	<li>再次用酒精喷洒小鼠胸部，以重新润湿毛发。使用直头镊子和直剪刀去除肋骨上方胸部的所有皮肤。沿胸骨向上剪开。提起两侧皮肤，然后沿下肋骨边缘剪开皮肤。</li>
	<li>用镊子夹住胸骨末端的剑突，用直剪刀在膈肌上剪开一个小孔。用镊子夹住膈肌，将其从肋骨上剪下并移除。</li>
	<li>再次用左手镊子夹住剑突，使用球头弯剪沿胸骨向上剪开，并剪开肋骨，注意避免损伤肺、心脏或血管（可利用剪刀的球头端作为引导）。操作过程中可能会有出血，但只要剪刀刃紧贴胸骨，就不会剪到心脏和肺组织。</li>
	<li>夹住左侧肋骨，根据需要剪除部分肋骨以充分暴露心脏。缓慢向右心室注射 0.1 ml 肝素溶液。此步骤对防止肺部血栓形成至关重要，血栓会损伤内皮细胞并影响灌注效果。肝素必须在心脏仍在跳动时注射。</li>
</ol>
5.2. 插管主肺动脉
<ol>
	<li>使用镊子的背部（圆端）轻轻将肺从肋骨壁推开，然后剪除其余的肋骨（左右两侧）。直接抓取肺组织会损伤 delicate 的肺组织；剪刀尖端与肺组织的意外接触也会造成损伤。</li>
	<li>将显微镜移至肺部上方就位。剪除心脏表面的腺体和脂肪组织。用镊子将其从动脉和静脉上拉开，同时在组织处于张力状态下用弹簧剪刀进行剪切。</li>
	<li>使用另一把钝头镊子，从心脏顶部、左心房/心室下方由右向左铲起，使镊子尖端滑入主动脉和肺动脉（PA）下方。操作时需格外小心——镊子不应受到阻力。使用钝头镊子可降低意外穿破肺动脉或主动脉的风险。</li>
	<li>当镊子尖端已位于主动脉和肺动脉下方后，取一段缝合线并穿过。打一个松散的外科结。此时不要拉紧缝线，也不要完成打结。</li>
	<li>可选步骤：使用角度剪刀切除下半身。沿肋骨和脊柱向下剪开；切断主动脉和静脉腔时会引起大量血液流出——可用棉签压迫止血。将切除的组织放入废弃物袋中待处理。</li>
	<li>用10 ml注射器中的4 ml RPMI溶液预冲肺动脉插管。仔细检查所有管路是否无气泡。肺灌注过程中若使用蒸馏水或混入气泡，将导致肺水肿。</li>
	<li>在右心室游离壁上剪一个小切口，将肺动脉插管插入，方向朝下并向右。插管尖端应能透过透明的肺动脉壁可见。注入少量RPMI溶液以确认位置正确。收紧环绕插管、主动脉和肺动脉的缝线并打结。注意此时主动脉也已被结扎，因此实际灌注应在左心房插管完成后才开始。</li>
</ol>
5.3. 左心房插管
<ol>
	<li>在左心室下部切开一个缺口，并将左心房（LA）插管向上插入。沿此方向可能需要轻微压力以打开二尖瓣。当插管尖端正确到位时，会顺利通过并保持稳固，无需缝合固定。</li>
</ol>
5.4. 开始灌注
<ol>
	<li>使用10 ml注射器手动以每分钟0.3 ml的速度灌注RPMI，直至流出管路中可见RPMI（与无色的PBS相比呈微粉红色）。若流出管路中无液体流动，请重新调整左心房插管的位置。若经重新调整后仍无法获得流出液，则检查肺动脉是否存在泄漏。肺动脉的泄漏或撕裂无法修复，此时应终止实验。</li>
	<li>通过IL-1系统将60 ml注射器连接至肺动脉插管，开始以1 ml/min的速度灌注灌注液，检查是否有泄漏，并确保肺组织变白，这表明RPMI正在置换肺内的血液。以低流速灌注两分钟。</li>
</ol>
6. 测量脉动性和稳态肺压力-流量关系
<ol>
	<li>进行脉动流研究时，首先根据先前实验结果，在 WinTest 程序中将振荡泵活塞位移设定为各频率所需的水平。由于肺部结构和力学特性的个体差异，每只小鼠均需单独调整位移参数。将稳态流设定至所需水平。打开通往振荡泵的阀门，并在运行振荡流程序（Wintest 程序）前立即开始记录数据。打开数据文件，在 Excel 中绘制实验测得的流量（Q）。通过调整 Wintest 程序中各频率下的振荡泵活塞位移，使 Q max 和 Q min 达到预期值。</li>
	<li>进行稳态流试验时，关闭通往振荡泵的阀门。若该阀门保持开启，振荡泵会起到电容作用，削弱不同流速之间的转换变化。在每个流速下至少采集 10 秒数据，或直至肺动脉压变化不超过 5% 为止。</li>
	<li>无论进行脉动流还是稳态流测量，均需在数据采集前以恒定压力进行通气。数据采集结束后应立即恢复通气。</li>
	<li>注意观察气道管路中是否出现 RPMI 液体，此为肺水肿的表现，一旦发现应立即终止实验。同时，严禁让 RPMI 液体进入气道压力或流量传感器，以免损坏传感器换能器。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
代表性稳态结果：
在离体肺装置中，实验者不仅能够独立控制肺血流量 Q，还能独立控制气道压 Pair 和左心房压 LAP。这种优势在于 Q、Pair 和 LAP 会影响肺血管系统及由此产生的肺动脉压 PAP。另一个优点是所获得的结果不受交感神经系统张力1、容量状态和麻醉2的影响。
在气道压（Pair ）固定且左心房压（LAP）恒定或变化的条件下，由心输出量（Q）阶梯式变化引起的肺动脉压（PAP）改变如图1所示。需要注意的是，在离体肺准备中，LAP套管通常连接至导管，将灌注液导入废液容器。在此导管连接的情况下，由于泊肃叶流动（Poiseuille flow），LAP与Q呈线性关系。然而，可通过手动调节出口和废液容器的高度，以提供一个恒定的非零LAP；或者移除导管，使LAP为零且与Q无关。
典型的脉动结果：
尽管该系统可生成任意的脉动流波形，但我们通常在频率 f = 1、2、5、10、15 和 20 Hz 下生成形如 Q = 3 + 2 sin (2fπt) ml/min 的流量，以评估肺血管的线性化阻抗（图2：上图）。根据测得的肺动脉压（PAP）、左心房压（LAP）和流量（Q），通过傅里叶变换将每个设定正弦流量频率下的 ΔP = PAP-LAP 和 Q 的一个完整正弦周期分解为一系列正弦谐波，进而计算肺血管阻抗的幅值（Z）和相位（θ）。压力变换与流量变换的比值得到肺血管阻抗 PVZ = FFT (ΔP)/FFT(Q)，其包含幅值 Z 和相位 θ。输入阻抗 Z0、特征阻抗 ZC 和波反射指数 RW 均由阻抗幅值计算得出。具体而言，Z0 由所有频率下 0 阶谐波（f = 0 Hz）的 Z 值取平均得到；ZC 计算为 5 Hz（首个最小值点）至 20 Hz 范围内 Z 的平均值；RW 则按公式 (Z0-ZC)/(Z0+ZC) 3 计算。
<img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig1.jpg" alt="显示压力与流量关系的心血管分析图表，以及基于时间的压力波形图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 稳态流动波形（第一行）及其对应的压力随时间变化的结果（第二行：PAP、Pair、LAP），在不同LAP与Pair组合条件下的表现。最下行为PAP与Q的关系曲线。在（A）和（B）中，由于连接了流出管道，LAP随Q增大而升高，随Q减小而降低。在（C）中移除了该管道，因此LAP保持恒定且与Q无关。在（D）和（E）中，通过手动调节出口管道的高度，使LAP处于较高水平但依然与Q无关。Pair分别设定为吸气末（A、C、D）或呼气末（B、E）压力。
<img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig2.jpg" alt="流体动力学图；压力-流量随时间变化关系；包含肺动脉压、左房压和气道压数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 随时间变化的脉动血流波形 Q（上图）及相应压力（下图：肺动脉压 PAP、左房压 LAP 和气道压 Pair）。根据这些脉动性肺血管压力-流量关系，可计算出肺血管阻抗（PVZ），其反映了右心室的总后负荷。

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<li>Bogaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+artery+pressure+elevation+is+insufficient+to+explain+right+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary artery pressure elevation is insufficient to explain right heart failure.</a> Circulation. 120, 1951-1960 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

手术中的关键步骤
在将肋骨从肺部剥离时，必须格外小心。肺部在充气过程中必须完全暴露，并且不受周围组织的阻碍，但同时在分离过程中不能受损。可使用镊子的钝端等扁平物体将肺部与胸壁分开，以便剪刀能够清晰地进行切割。另一个关键步骤是在肺动脉和主动脉周围放置缝合线。使用钝头直镊可降低刺破肺动脉的风险。手术过程中的最后一个关键步骤是插管的放置。如果插管位置过高，位于大血管离开心脏平面的上方，则可能导致插管牵拉肺动脉或肺静脉。如果左心房内的插管位置过低，则可能阻塞流入左肺的血流，导致更多血流进入右肺，从而升高肺动脉压（PAP），并加速右肺水肿的发展。
数据采集过程中的关键步骤
应尽快完成稳态流动的数据采集，尤其是高流速条件下，以尽量减少肺血管系统暴露于高流体剪切应力的情况。根据我们的经验，高剪切应力会导致肺水肿。此外，剪切应力的快速升高也可能引起肺水肿。在稳态流动条件下，每分钟流速增加6 ml/min不会引发水肿。在特定条件下，可实现超过5 ml/min的稳态流速而不会产生水肿。我们已成功对...

<table><tbody><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10F</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>60 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>含 GLN 6/PK 的 RPMI 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-57</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 70</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2878-100g</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>带角度球状虹膜剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14109-09</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪刀 - 4 mm 刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>精细虹膜剪刀 - 直型</td><td>Fine Science Tools</td><td>14106-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 医用生物学镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Lauda E100 ECO-line 003</td><td>VWR international</td><td>相当于 Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 离体灌注小鼠肺系统</td><td>Harvard Apparatus</td><td>739904</td><td></td></tr><tr><td>用于 PLUGSYS 模块的 P75 血压换能器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730020</td><td></td></tr><tr><td>TS410 流量模块</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>ME 4 PXN 精密 PXN 在线流量传感器</td><td>Transonic</td><td>ME 4 PXN</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer 多通道注射泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74900-20</td><td></td></tr><tr><td>Nembutal 50MG/ML 20ML 小瓶</td><td>Amatheon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

采用脉动流灌注的离体、通气并插管小鼠肺脏的表征

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

分离、通气并插管的小鼠肺制备模型可实现对肺血管稳态和脉动压力-流量关系的测量，同时独立调控肺动脉血流速率、血流波形、气道压力和左心房压力。肺血管阻力通过多点稳态压力-流量曲线计算得出；肺血管阻抗则通过在不同频率下获得的脉动压力-流量曲线计算。目前临床上已认识到，阻抗相较于阻力更能准确反映右心室后负荷，因为它包含了血管顺应性的影响，而这种影响在肺循环中尤其不可忽略。阻抗的三个重要参数——零赫兹阻抗 Z0、特征阻抗 ZC 和波反射指数 RW——分别反映了可供血流通过的远端动脉横截面积、近端动脉僵硬度以及上下游阻抗不匹配程度。在分离、通气并灌注的肺中所获得的所有结果均不受交感神经系统张力、容量状态及麻醉影响。我们已应用该技术量化肺栓塞和慢性缺氧对阻力和阻抗的影响，并利用 ZC 的压力依赖性来区分血管活性药物和疾病的作用部位（即近端与远端）。此外，当该技术与基因工程小鼠品系的肺组织联合使用时，可明确分子水平缺陷对肺血管结构与功能的影响。

以下方案概述了分离、通气并连接小鼠肺脏以测量稳态或脉动性肺血管压力-流量关系的过程，旨在量化血流、气流、气道变化及血管变化对右心室后负荷的影响。

离体、通气且插管的小鼠肺制备模型可用于测量稳定和脉动状态下的肺血管压力-流量关系……

为了研究脉动性肺动脉压力与血流之间的关系。本方案介绍了如何分离、通气和灌注小鼠肺脏。通过手术暴露气管以进行通气。然后分离心脏和肺，以便插管肺动脉和左心房。接着对肺系统进行灌注。通过改变肺动脉的血流、大小、波形和/或频率来进行实验。记录所获得的肺动脉和左心房压力波形，以展示脉动性肺部压力-血流关系。该技术相较于现有方法（如在体 preparations）的主要优势在于，能够在容量状态、交感神经系统张力、活动性以及麻醉影响均保持不变的情况下，获得压力-血流关系的变化。脉动性压力-血流关系可在上述因素不变的条件下被测定。此外，大多数离体肺组织制备方法仅能测量稳态下的压力-流量关系，而我们的技术则能够测定脉动状态下的压力-流量关系。该方法有助于回答肺生理学领域的一些关键问题，例如肺血管疾病如何影响脉动性肺血流动力学，或大肺动脉硬化如何影响右心室后负荷？该方法的可视化演示至关重要，因为暴露心脏和肺组织并将导管固定在肺动脉中的操作较难掌握。仪器产生的过压可能导致肺部水肿，导管放置不当可能刺破肺动脉。在开始实验之前，必须准备好用于通气和灌注离体肺的IL one系统。应将管路连接至压力传感器。使用加热至 37 摄氏度的蒸馏水彻底冲洗系统，排出管路中的所有气泡。然后用 1% PBS 预先润洗 Endur tech 泵管路。现在归零。通过首先关闭每个P 75传感器通向IL系统的阀门，并打开其通向大气的阀门，来对传感器进行压力归零。然后使用SIS放大器插头自动将压力调零，随后通过将陶瓷多孔部件浸入蒸馏水中润湿IO一套装置。在麻醉小鼠后，通过将其前爪固定在软木板上以稳定小鼠，为手术做好准备。现在用95%酒精喷洒胸部。使用直镊夹住颈部皮肤，并用直剪刀剪开一个1厘米的切口。暴露颈部内部后，在寻找食管和气管的同时，剪除浅层肌肉中的白色腺状组织。从两侧及后方分离食管和气管周围的组织，并在气管周围打一个松散的缝线。为进行气管插管，用小剪刀小心地在气管一侧剪一个微小的V形切口。然后用钝头镊子将小鼠移至IL one系统。抓住气管插管，将其滑入气管中。用缝线固定插管。先用室内空气开始通气，用酒精喷洒胸部，然后使用直镊子和直剪刀去除皮肤。沿胸骨向上切开皮肤。将两侧的皮肤提起，并沿下肋骨的走向剪开。现在用镊子夹住剑突，使用圆头剪刀在膈肌与胸骨底端连接处剪一个小孔。抓住膈肌，并将其从肋骨上剪下。使用圆头剪刀再次夹住剑突，然后用圆头剪刀小心地沿胸骨向上剪开肋骨，注意不要损伤肺、心脏或血管。为暴露心脏，抓住左侧肋骨并剪去其尖端。随后缓慢向右心室注射 0.1 毫升肝素。注射后，剪除剩余的肋骨。在显微镜下剪断肋骨时，使用镊子的背面或圆头轻轻将肺从肋骨处推开。清除覆盖在心脏表面脂肪中的腺体组织。使用镊子将组织拉开并剪除。用弹簧剪在主动脉和肺动脉周围放置缝线，再用钝头镊子轻轻托起心脏，应无明显阻力。现在用双扣打一个

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