Name: 漂白实验（FRAP和FLIP）来衡量生活胚胎干细胞的染色质的蛋白质动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习使用FRAP和FLIP光漂白技术实时监测胚胎干细胞中染色质蛋白的动态变化，通过GFP融合蛋白标记观察染色质可塑性，揭示多能细胞中染色质与蛋白质相互作用的异质性特征。

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我们感谢 Meshorer 实验室的成员，特别是 Shai Melcer、Adi Alajem、Edupuganti Raghu Ram、Badi Sri Sailaja、Anna Mattout 和 Alva Biran，他们每天对光漂白实验提供了宝贵的建议和问题排查支持。EM 是约瑟夫·H·和贝尔·R·布劳恩生命科学高级讲师，得到以色列科学基金会（ISF 943/09）、以色列卫生部（6007）、欧盟（IRG-206872 和 238176）、以色列癌症研究基金会、希伯来大学内部应用医学基金以及以色列心理生物学研究所的支持。

1. 铺板 ES 细胞
T = 0 小时 
MEF 铺板
<ol>
 <li>使用明胶对活细胞成像用8孔μ-载玻片（ibidi；Munich, Germany）进行包被，或在腔室盖玻片（Lab-Tek；Rochester, NY）或玻璃底培养皿（MatTek；Ashland, MA）中进行包被。孵育5–30分钟，吸除未结合的明胶。</li>
 <li>在250 μl含10%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培养基中，每孔接种22,000个MEF细胞。将细胞置于组织培养孵箱（37°C，5% CO2）中培养。</li>
</ol>
T = 6 小时 
 ES 细胞接种
 <ol start="3">
 <li>吸去 DMEM 培养基。</li>
 <li>在每个经 MEF 包被的孔中，加入 15,000 个 R1 细胞/孔，总体积为 250 μl 的胚胎干细胞培养基 [添加 10% 胚胎干细胞级胎牛血清（FBS）、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸、0.1 mM β-巯基乙醇和 1000 U/ml 白血病抑制因子（LIF）]，以使次日细胞融合度达到 30% 至 50%。</li>
</ol>
2. 转染ES细胞
T = 24 小时 
瞬时转染
<ol>
 <li>将每个孔中的 ES 细胞培养基更换为 250 μl 新鲜的 ES 细胞培养基。</li>
 <li>在一支 1.5 ml 无菌离心管中加入 100 μl 无血清培养基 [Opti-MEM (Gibco)]，然后直接加入 10 μl TransIT-LT1 转染试剂 (Mirus) 至无血清培养基中。轻轻吹打混匀，并在室温下孵育 5–20 分钟。</li>
 <li>向稀释后的 TransIT-LT1 试剂中加入 1.5 μg GFP 融合质粒 DNA（H1e、H1o 或 HP1）。轻轻吹打混匀，并在室温下孵育 15–30 分钟。</li>
 <li>向每孔加入 13.5 μl 转染混合物。轻轻摇动 8 孔 μ-Slide 以确保均匀分布。24 小时后，将旧的 ES 细胞培养基更换为 250 μl 新鲜的 ES 细胞培养基。</li>
</ol>
3. 执行 FRAP 和 FLIP
时间 = 48-72 小时
<ol>
 <li>该实验可在任意共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）上进行，但由于常规的FRAP/FLIP实验需要连续采集多幅图像，建议使用转盘式共聚焦显微镜，因其具备更快的成像速度，并可确保在初始的有意漂白事件之后不会发生非预期的样本漂白。本文推荐使用Revolution转盘共聚焦系统（www.Andor.com），配备Yokogawa CSU-X转盘头。该系统具备双重功能：可通过专用的FRAPPA模块结合点扫描系统实现光漂白，并能迅速切换光源，利用转盘进行快速图像采集。光漂白实验中最常用的三种荧光蛋白为GFP、YFP和Cherry。若使用GFP或YFP，需配备波长约为488 nm的激光器；若使用Cherry，则使用波长约为560 nm的激光器。在所有情况下，均建议使用固态激光器。自动载物台虽有帮助但非必需。由于实验涉及活细胞成像，必须使用环境控制培养室（我们使用瑞士LIS公司的产品），以调控氧气、湿度和CO₂水平。2 以及温度。FRAP 实验采用最大激光强度进行，而成像则使用所需的最低激光功率（通常在10%左右，当荧光水平足够时）。 
 使用适当波长的荧光光源观察细胞，并利用60倍油镜选择表达GFP的细胞。确保蛋白具有正确的亚细胞定位分布。有时当表达水平过高时，蛋白定位可能“溢出”至其他区域，如核仁。此类细胞不应被选中。</li>
 <li>现在设置成像方案：在光漂白前采集3-5帧图像，随后在常染色质或异染色质区域（表现为凝聚的GFP焦点）进行光漂白，并在光漂白后以250-1000毫秒的时间间隔采集90-120帧图像：H1e-GFP采用1000毫秒间隔，H1o和HP1-GFP采用250毫秒间隔（间隔时间根据蛋白质动力学特性调整，动力学较快的蛋白质需使用较短的时间间隔）。通常使用80-100%的激光强度进行光漂白，激光脉冲持续时间为20-40 μseconds（1-2次重复），但具体次数可根据目标蛋白及其表达水平进行调整。当光漂白操作适当时，应在GFP荧光图像中观察到一个“黑斑”；随着荧光恢复，该黑斑会逐渐被重新填充。尽管转盘共聚焦系统每秒可采集约60帧图像（在荧光强度良好且仅对单个细胞进行放大时），但由于图像质量下降以及可能增加的光毒性，不建议以如此高的速度进行成像。</li>
 <li>对于FLIP实验，设置不同的成像方案：在漂白前采集3-5帧图像，然后在相同位置开始重复漂白的同时持续采集图像。对于H1e-GFP，每5秒漂白一次；对于H1o-GFP，每2秒漂白一次；对于HP1-GFP，每1秒漂白一次。在整个实验过程中反复进行漂白和图像采集。</li>
 <li>对于任一技术，需在20–30个细胞上重复该过程。为满足统计学要求，应重复实验3次或以上，最好在不同日期进行。在均质细胞群体和正确设置条件下，标准差通常较低（&lt; 5%). 
 对于FRAP和FLIP实验，漂白区域的大小和形状会影响恢复动力学，因此在单次实验中必须保持恒定。此外，当比较两个细胞时，必须使用相同的实验方案，并在同一天内依次对细胞进行分析，因为激光功率及其他条件可能波动，进而影响实验结果。</li>
</ol>
4. FRAP 与 FLIP 数据分析
<ol>
 <li>在所有采集的FRAP图像中，测量ROI内的荧光强度（ROIb = 漂白区域），背景区域（ROI背景），以及未漂白的核区域（ROInb) 随光漂白前后时间的变化。当漂白区域可忽略时，可选择整个细胞核用于归一化。</li>
 <li>对于每个时间点，根据以下公式对数据进行归一化处理：(ROIb - 感兴趣区域背景)/(感兴趣区域nb - 感兴趣区域背景) / (pbROIb - pbROIbg)/(pbROInb - pbROIbg），pb 表示预漂白。对于预漂白图像，其数值应约为 1。漂白后的第一张图像表示漂白深度，用 1 减去该数值即得到实际的漂白深度值。对每个细胞重复此操作，并从每次实验中取 20–30 个细胞进行平均。</li>
 <li>在所有采集的FLIP图像帧中，测量未漂白的核区域以及背景区域（ROI）的荧光强度nb = 非漂白区域，
 感兴趣区域背景 = 背景）。FLIP 数据的计算方法类似于 FRAP 曲线，只是所分析的 ROI（ROInb) 应与实际的漂白区域不同，因为实际漂白区域不用于计算：（ROInb - 感兴趣区域背景)/(pbROInb - pbROIbg）。也可以使用邻近的细胞（ROIn = 邻近细胞）用于归一化：（ROInb - 感兴趣区域bg)/(感兴趣区域n - 感兴趣区域bg) / (pbROInb - pbROI背景)/(pbROIn - pbROI背景). 
 数据采集完成后，可将实验数据拟合至计算机模拟。这能够以较高的准确度计算出可移动组分、不可移动组分以及半最大值。本文不讨论FRAP分析中的数学与统计学方面内容，建议读者参考其他优秀的相关出版物。4-9漂白深度指漂白前（100%）信号与漂白后第一张图像之间在y轴上的距离；移动组分指当动力学达到平台期时，漂白深度与恢复后信号之间在y轴上的距离；不可移动组分指恢复后信号与漂白前（100%）信号之间在y轴上的距离（见图1B和图2B）。除上述分析外，还可采用合适的数学模型对数据进行拟合。对于单指数拟合，其方程为  
	<img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="动力学分析图中使用的指数衰减公式，I(t) = A(1 - e^(-k_off*t))。" width="80" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程"> 
	其中 t 是时间，A 是可移动部分，1-A 是不可移动部分，且 k关闭 是解离常数，可用于拟合数据，并可直接估算结合的解离速率（k关闭可获得参数A，该参数可用于计算结合速率。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="显示HP1、H10、H1e实验中归一化数据和漂白的荧光恢复曲线图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. A和B显示了R1 ES细胞中HP1（左）、H1o（中）和H1e（右）的代表性FRAP曲线。为简化和清晰起见，图1A展示了单个细胞在未进行任何归一化和计算前的原始数据。黄色曲线对应漂白区域，紫色曲线对应未漂白的核区域（当漂白区域可忽略时，可选择整个细胞核用于归一化），红色线条对应背景荧光，本例中背景荧光极低。垂直箭头表示漂白时间。归一化并取平均的数据见图1B。注意H1（蓝色）的恢复速度比HP1（红色）更慢。此外，H1e亚型（深蓝色）比H1o亚型（浅蓝色）恢复更慢。HP1的移动组分、非移动组分及漂白深度已在图中标明。
<img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="HP1 动态图；常染色质和异染色质中的荧光恢复；FRAP 分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. A 和 B 展示了 R1 ES 细胞中 HP1 在常染色质（左）与异染色质（右）的代表性 FRAP 曲线对比。与图 1 类似，图 2A 显示单个细胞的原始数据，其中黄色曲线代表被漂白区域，紫色曲线代表未漂白的核区域，红色线条代表背景荧光。垂直箭头表示漂白时间。归一化并取平均后的数据见图 2B。注意异染色质（深红色）的恢复速度比常染色质（浅红色）更慢。图中还标出了常染色质的可移动组分、不可移动组分以及漂白深度。
<img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="荧光衰减曲线；荧光强度与时间关系；光谱分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 显示了H1o R1 ES细胞典型的FLIP实验结果，其中图3A为原始未经归一化处理的数据，图3B为归一化并取平均后的数据。在该实验中，紫色曲线代表未被漂白的核区域，绿色线条代表相邻细胞的细胞核，红色线条代表背景荧光。

<ol><li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo%3A+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li>
<li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeshorer%2C+E+%22Imaging+chromatin+in+embyonic+stem+cells+in+StemBook%22">Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook</a>. Girard, L. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge. (2008).</li>
<li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancaud%2C+A+%22Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photo+conversion%2C+and+FLIP%22">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2009).</li>
<li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li>
<li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells%3A+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li>
<li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li>
<li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics%3A+what+do+we+really+know%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li>
<li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li>
<li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+TransgeneOmics%3A+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li>
<li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li>
<li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

与大多数现有技术（涉及从细胞群体或固定细胞中纯化染色质）不同，FRAP 实验可在活细胞中追踪染色质蛋白动态变化。我们发现染色质蛋白的动态性是染色质可塑性的一个良好指标。然而，由于该方法需要将目标基因与 GFP 融合，荧光标签的添加可能干扰蛋白功能。因此，在进行 FRAP 实验之前，必须严格验证融合蛋白是否与其天然对应物具有相同的性质和功能。理想的金标准是在基因敲除细胞系中利用 GFP 融合蛋白回补内源蛋白的功能。但基因敲除细胞系并非总是可获得，且在许多情况下，蛋白缺失并不表现出明确的表型。尽管如此，仍可通过比较融合蛋白与内源蛋白的亚细胞分布、表达水平以及结合伴侣等方式，验证其是否能够实现适当的局部替代。
验证后，必须将GFP融合蛋白转染至ES细胞中。我们发现TransIT在ES细胞中效果良好，转染效率可超过50%。瞬时转染操作简便，可直接进行后续实验；但稳定转染通常更为优越，因其可确保细胞在表达目标融合蛋白的情况下长期存活，并实现较低且均一的表达水平。其他将GFP标签用于蛋白标记的方法包括利用combineering技术在BAC中进行GFP基因标记10，或直接...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.04078</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 提供</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>8孔 &amp;mu;-载片</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr></tbody></table>

活体胚胎干细胞中染色质蛋白动态的光漂白实验（frap与flip）测定

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

光漂白后荧光恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）和光漂白过程中荧光丢失（Fluorescence Loss In Photobleaching, FLIP）技术能够以良好的空间和时间分辨率研究活细胞中蛋白质的动力学行为。本文介绍了如何在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中对染色质相关蛋白（包括H1和HP1）进行FRAP和FLIP实验。在FRAP实验中，将目的蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）或其衍生物（如YFP、CFP、Cherry等）融合，并通过瞬时或稳定转染的方式导入细胞。在表达荧光蛋白的细胞中，使用高强度的聚焦激光对一个相对较小的感兴趣区域（ROI）进行漂白。激光波长的选择需与所用的荧光蛋白相匹配。激光照射会不可逆地淬灭该区域内荧光分子的信号，随后通过时间序列成像监测漂白区域荧光信号的恢复过程——该恢复由未漂白分子替换已漂白分子所介导。由此生成的荧光恢复曲线可提供有关蛋白质移动性的信息。若荧光分子完全静止不动，则不会观察到荧光恢复现象。作为互补方法，FLIP实验则对同一位置反复进行激光漂白，并在细胞其他荧光区域测量信号强度的变化。因此，FLIP实验检测的是荧光信号的衰减而非恢复，可用于评估蛋白质的移动性以及蛋白质在不同细胞区室之间的穿梭行为。瞬时结合是染色质相关蛋白的普遍特性。尽管在稳态下任一时刻大部分染色质蛋白均结合于染色质上，但这种结合是短暂的，大多数染色质蛋白在染色质上具有较高的周转率，停留时间通常为数秒量级。这些特性对于实现基因组表达的高度可塑性至关重要1。因此，利用染色质结构蛋白的GFP融合体进行光漂白实验特别适用于评估染色质可塑性，尤其是在胚胎干细胞（ES细胞）中，染色质蛋白（包括异染色质蛋白1（HP1）、连接组蛋白H1及核心组蛋白）的动态交换速率高于分化细胞2,3。

我们介绍了光漂白方法，包括光漂白后荧光恢复（FRAP）和光漂白过程中的荧光丢失（FLIP），用于监测胚胎干细胞（ES细胞）中染色质蛋白的动力学。染色质蛋白动力学被认为是研究染色质可塑性的手段之一，在多能性细胞中其活性增强。

活体胚胎干细胞中染色质蛋白动态的光漂白实验（FRAP与FLIP）测定

光漂白后荧光恢复（FRAP）与光漂白过程中荧光丢失（FLIP）技术可实现对活细胞中蛋白质动态行为的研究……

以下实验的总体目标是监测胚胎干细胞中染色质蛋白的动态变化。通过将编码GFP融合蛋白的质粒DNA转染至胚胎干细胞（eESL），使转染细胞表达荧光标记的染色质蛋白，随后进行FRAP或FLIP实验以检测荧光恢复或丢失情况。光漂白后，监测蛋白的动态行为，并确定其可移动组分与不可移动组分的比例。通过 FRAP 和 FLIP 实验获得的结果显示了染色质蛋白动态特性的差异。该技术相较于现有方法（如使用 Salsa 去垢剂提取染色质蛋白）的主要优势在于，其可应用于单个活细胞。因此，能够实时观察染色质与染色质蛋白之间的相互作用，并确定特定细胞群体内的异质性。采用无菌技术，首先将小鼠胚胎成纤维细胞或甲基细胞接种培养。在超净工作台内，用明胶对八孔活细胞成像载玻片进行包被处理，室温孵育5至30分钟使明胶固定，随后吸除多余明胶。现在，将22,000个甲基细胞接种至每孔涂有基质的孔中，培养基为添加了胎牛血清的DMEM。将细胞置于组织培养孵箱中培养六小时后，吸除DMEM培养基，再向每孔甲基化处理的孔中加入15,000个R1胚胎干细胞，培养基为添加了补剂的ES培养基。将细胞置于组织培养孵育箱中过夜培养，使其融合度达到50%。次日，细胞融合度应达到30%至50%。首先，用250微升新鲜ES培养基替换原有ES培养基。接着，在1.5毫升无菌离心管中配制转染混合液：加入100微升无血清培养基，随后加入10微升Transit转染试剂。加入1单位截断试剂。轻轻吹打混匀，室温孵育5至20分钟。5至20分钟后，加入1.5微克GFP融合质粒DNA，再用移液枪轻轻吹打混匀。然后在室温下再孵育15至30分钟。将转染混合物制备好后，向每孔中加入13.5 µL，并轻轻摇晃载玻片微孔板以确保均匀分散。将细胞在培养箱中继续孵育24至48小时，然后再进行FRAP或FLIP分析。24小时后，由于需要连续获取多张图像，应将旧的ES培养基更换为250微升新鲜的ES培养基。建议使用具备光漂白功能的转盘共聚焦显微镜。对于包裹与翻转实验，若使用任何标准共聚焦显微镜，需根据待观察的荧光蛋白选择合适的固态激光器。将物镜调整至油镜。在镜头上滴加镜油，放置细胞后关闭腔室盖。由于需要对活细胞进行成像，因此必须使用环境控制腔室，以调节氧气、湿度、二氧化碳浓度和温度，使其接近组织培养孵育箱的条件。观察发出蓝色荧光的细胞，并选择表达 GFP 的细胞。使用 60 倍油镜，确保细胞显示出正确的亚细胞分布。有时当表达水平过高时，蛋白质的定位可能会溢出至其他区室，例如细胞核。不应选择此类细胞。在常染色质或异染色质区室中选择一个感兴趣区域。梯子用作浓缩的 GFP 焦点。现在设置成像程序。在光漂白前采集三到五帧图像，然后进行光漂白，并在光漂白后以250至1000毫秒的时间间隔采集90至120帧图像。对于重复采集的帧，激光强度应设置为最低，通常为5%至10%，前

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激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

染色质松散程度似乎与卵裂球的发育潜能相关。然而，目前尚不清楚染色质松散程度是否可作为评估胚胎发育潜能的可靠指标。本文描述了一种实验体系，在该体系中，经染色质松散程度评估的受精卵能够发育至足月。...

光漂白后合子荧光恢复分析用于评估允许足月发育的染色质松散程度

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

我们报道了一种信使RNA（mRNA）电穿孔方法，该方法可在鹌鹑胚胎模型系统中快速高效地表达多种蛋白质。该方法可用于对细胞进行荧光标记，并在电穿孔后短时间内通过延时显微镜记录其在体内的运动过程。...

利用mRNA电穿孔技术在禽类胚胎中快速高效表达多种蛋白质

该过程结合使用共聚焦显微镜与荧光标记的细胞核及染色质标记品系 拟南芥 同时记录细胞核与染色质动态 拟南芥...

发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

学习使用FRAP和FLIP光漂白技术实时监测胚胎干细胞中染色质蛋白的动态变化，通过GFP融合蛋白标记观察染色质可塑性，揭示多能细胞中染色质与蛋白质相互作用的异质性特征。

活体胚胎干细胞中染色质蛋白动态的光漂白实验（FRAP与FLIP）测定

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