Name: 在完整的感觉器官前体细胞的活细胞成像果蝇蛹 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 27 s
Description: 学习在完整果蝇蛹中对感觉器官前体细胞进行活细胞成像的技术。该方法利用共聚焦显微镜实时观察不对称分裂过程中的蛋白质动态分布，为研究神经发育和细胞生物学提供重要工具。

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我们感谢 J. Knoblich（维也纳分子病理研究所）和 M. Gonzalez-Gaitan（日内瓦大学）提供的 Drosophila 果蝇品系，以及 Shinya Inoué 和 Christian Sardet，他们的海洋胚胎封片技术为本技术的开发提供了灵感。本实验方案最初在 Y.N. Jan 实验室中建立。F.R. 和 D.Z. 的研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）RO1 NS059971 基金、宾夕法尼亚州烟草和解基金以及福克斯蔡斯癌症中心的资助。

所需材料：解剖体视显微镜、双面胶带、标准显微镜载玻片和盖玻片、解剖镊子（5号或5.5号）、软毛刷、硅基真空润滑脂、5毫升注射器、沃特曼滤纸、配备数字相机及图像采集软件的共聚焦显微镜或落射荧光显微镜。
1. 蛹体解剖
<ol>
	<li>建立杂交组合（使用适当的 Gal4 品系与在 UAS 控制下的 GFP 标记融合蛋白品系），或将需要成像的果蝇品系放入多个新鲜的培养瓶中，在 25°C 下培养。</li>
	<li>SOP 细胞通常在蛹化开始后约 18 小时开始在蛹的胸部增殖，因此我们从相应的果蝇品系或杂交组合中选择“白色”蛹。白色蛹已具备蛹的形态，但蛹壳尚未色素沉积，表明其在 1 小时内刚刚完成蛹化。</li>
	<li>等待约 18 小时。</li>
	<li>在载玻片上贴一段双面胶带。收集蛹，并将其蛹壳腹面朝下粘附在双面胶带上。用镊子夹住蛹壳前端背侧顶端的圆形开口结构（即前蛹盖）边缘。</li>
	<li>轻轻提起、移除并丢弃前蛹盖，暴露出未成熟果蝇的头部。</li>
	<li>用镊子从蛹壳一侧开始撕裂。从撕开的一侧将蛹壳中段提起，并翻折至果蝇对侧，可完全移除或将其贴附在胶带上，从而暴露果蝇的胸部及腹部前部。（注意：发育中的果蝇与蛹壳之间存在间隙。撕裂蛹壳时需小心，避免刺破果蝇体壁。）</li>
	<li>继续沿同一侧向蛹壳后端剪开。同样注意不要刺破果蝇。将蛹壳拉至果蝇对侧并压紧在双面胶带上，使腹部完全暴露。将软毛刷置于果蝇头部正下方。当果蝇粘附到毛刷上并脱离蛹壳后，用毛刷轻轻将其从载玻片上提起。</li>
</ol>
2. 蛹的固定
解剖后，将蛹置于载玻片和盖玻片之间固定：
<ol start="8">
	<li>将从茧中分离出的蛹取出，置于载玻片中央，背面向上。</li>
	<li>用Whatman滤纸制作一个18×18 mm的方形框架，中间留出10×10 mm的开口。将滤纸浸入水中至完全饱和，然后放置在蛹的周围。</li>
	<li>使用装有硅基真空润滑脂的5 cc注射器，在Whatman滤纸框架周围均匀涂抹一层润滑脂。润滑脂的涂抹范围应位于盖玻片之内（见图1），其厚度应略大于蛹的直径。</li>
	<li>在22×22 mm盖玻片的中央滴加一小滴水（1 μl），然后将盖玻片盖在上述样品上，使小水滴接触待成像表面（本例中为notum）。轻轻按压，使真空润滑脂完全密封，并确保盖玻片与蛹体表皮之间形成平整的接触面。</li>
	<li>制备好的样品可在倒置或正置显微镜下进行成像，成像方式可选用落射荧光、共聚焦（激光扫描或转盘式）或双光子共聚焦显微镜。若操作谨慎，可在数天后回收成虫。</li>
</ol>
3. 代表性结果：
利用特定于感觉器官前体细胞（SOP）的Gal4品系（neuralized-Gal4）与标记了GFP的蛋白质（如标记有丝分裂纺锤体的微管蛋白或Tau-GFP，或标记组蛋白的H2B-GFP）进行杂交，可通过延时成像观察SOP细胞分裂的分裂面、细胞周期长度或有丝分裂次数9。其他靶向细胞器的融合蛋白，例如Rab-GTP酶（用Rab5-GFP标记早期内体或Rab11-GFP标记循环内体）以标记不同的内吞区室，或参与Notch信号通路调控的关键蛋白（如Numb-GFP、Partner of Numb-GFP或Sanpodo-GFP），均可为不对称细胞分裂及膜蛋白运输机制的研究提供重要见解2,3,7,10,11。
<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="用于生物学研究的果蝇蛹制备示意图及显微镜图像序列。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：蛹的解剖与封片。A. 分步图像展示了去除蛹壳并制备完整蛹体以进行封片和活细胞成像的操作流程。将蛹从培养瓶中取出后，背面向上放置在固定于载玻片上的双面胶带上。第一列：去除头盖（operculum）并沿蛹壳侧面撕开。第二列：从胸部和腹部区域完全去除蛹壳。随后使用软毛刷将游离的蛹体从蛹壳中轻轻提起。B. 将蛹体置于载玻片与盖玻片之间进行封片。将蛹背面向上放置在载玻片上，周围用湿润的Whatman滤纸条包围。从5 mL注射器中挤出连续的硅酮真空脂细线，用于密封载玻片与盖玻片的组合，防止蛹体干燥，并抬高盖玻片使其轻柔地接触蛹的胸部。在盖玻片与蛹体胸部表皮交界处加入一小滴水（1 μl），在使用浸没式物镜（水镜或油镜）时可显著提高成像质量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg">点击此处查看高分辨率图像</a>。
<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="细胞分裂过程；显微成像；蛋白质定位；细胞结构分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：采用本研究的蛹体解剖与封片方法获得的活体SOP细胞及分化后的外部感觉器官的代表性图像。A. 从表达肌动蛋白-GFP融合蛋白（由neuralized-Gal4（neur-Gal4/UAS-actin-GFP）驱动）的有丝分裂SOP细胞时间序列中提取的图像，可见肌动蛋白在分裂沟处的皮层富集（每2分钟采集1张图像）。B. 由neuralized-Gal4驱动共表达Numb蛋白伴侣-RFP（红色）和Rab5-GFP的SOP子代细胞，可见Pon-RFP在其中一个子代细胞（pIIb）中的不对称分布，以及早期内体在两个子代细胞中的分布。C. 晚期蛹阶段分化后外部感觉器官的z轴层扫图像的三维重建。通过角质层自发荧光（红色）显示机械感受性刚毛和表皮毛等角质结构。此外，我们利用MARCM系统在部分感觉器官前体细胞中表达Lgl-GFP（由neuralized-Gal4驱动，绿色）。（这些图像均使用尼康C1激光扫描共聚焦显微镜配合60X 1.45 N.A.物镜采集）

<ol><li>Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage%3A+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126, 3573-3584 (1999).</li>
<li>Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+asymmetric+divisions+in+the+Drosophila+sensory+organ+precursor+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two types of asymmetric divisions in the Drosophila sensory organ precursor cell lineage.</a> Nat Cell Biol. 3, 58-67 (2001).</li>
<li>Bellaiche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+regulates+localization+of+cell-fate+determinants+and+mitotic+spindle+rotation+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division.</a> Nat Cell Biol. 3, 50-57 (2001).</li>
<li>Emery, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+dynamics+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosome dynamics during development.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 407-415 (2006).</li>
<li>Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bazooka+is+required+for+localization+of+determinants+and+controlling+proliferation+in+the+sensory+organ+precursor+cell+lineage+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bazooka is required for localization of determinants and controlling proliferation in the sensory organ precursor cell lineage in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 14469-14474 (2001).</li>
<li>Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+unanticipated+alleles+of+lethal+giant+larvae+in+Drosophila+second+chromosome+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequent unanticipated alleles of lethal giant larvae in Drosophila second chromosome stocks.</a> Genetics. 182, 407-410 (2009).</li>
<li>Tong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+independently+antagonizes+Sanpodo+membrane+targeting+and+Notch+signaling+in+Drosophila+sensory+organ+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Numb independently antagonizes Sanpodo membrane targeting and Notch signaling in Drosophila sensory organ precursor cells.</a> Mol Biol Cell. 21, 802-810 (2010).</li>
<li>Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+Component+of+the+Exocyst%2C+Promotes+Notch+Signaling+during+the+Asymmetric+Division+of+Drosophila+Sensory+Organ+Precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a Component of the Exocyst, Promotes Notch Signaling during the Asymmetric Division of Drosophila Sensory Organ Precursors.</a> Dev Cell. 9, 351-363 (2005).</li>
<li>Karbowniczek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionarily+conserved+TSC%2FRheb+pathway+activates+Notch+in+tuberous+sclerosis+complex+and+Drosophila+external+sensory+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The evolutionarily conserved TSC/Rheb pathway activates Notch in tuberous sclerosis complex and Drosophila external sensory organ development.</a> J Clin Invest. 120, 93-102 (2010).</li>
<li>Coumailleau, F., Furthauer, M., Knoblich, J. A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458, 1051-1055 (2009).</li>
<li>Emery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+rab11+endosomes+regulate+delta+recycling+and+specify+cell+fate+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric rab11 endosomes regulate delta recycling and specify cell fate in the Drosophila nervous system.</a> Cell. 122, 763-773 (2005).</li>
<li>Justice, N., Roegiers, F., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+giant+larvae+acts+together+with+numb+in+notch+inhibition+and+cell+fate+specification+in+the+Drosophila+adult+sensory+organ+precursor+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Lethal giant larvae acts together with numb in notch inhibition and cell fate specification in the Drosophila adult sensory organ precursor lineage.</a> Curr Biol. 13, 778-783 (2003).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在本视频中，我们展示了一种用于分离和装片果蝇（Drosophila）蛹以实现对蛹背胸片上SOP细胞进行活细胞成像的技术。从蛹壳中取出蛹体需要稳定的手法、合适的工具以及一定的练习，但该技术易于掌握。准确判断蛹的发育时期至关重要，以确保解剖操作相对简便，并能捕捉到SOP细胞增殖阶段。一旦完成装片，蛹在载玻片和盖玻片之间会继续发育，在大多数情况下可发育至未羽化成虫阶段，并最终羽化。根据我们的经验，可对细胞进行持续数小时的成像观察。该装片技术不仅限于观察蛹胸部体壁上的外周神经系统前体细胞，还可用于观察任何靠近表皮表面且显微镜物镜可及的细胞（请注意，观察需在蛹壳可被移除而不致死蛹体的发育阶段进行，通常为蛹壳形成后约10至14小时）。我们已成功在蛹期上皮细胞中可视化了连接蛋白、细胞骨架蛋白以及囊泡运输调控因子（未发表数据）。
蛹体固定技术还使我们能够开发一种方法，利用扫描共聚焦显微镜对晚期蛹的表皮结构进行成像，从而通过表皮固有的自发荧光来观察机械感受性刚毛和表皮毛的形态。这些图像类似于果蝇表皮的扫描电镜照片，但可从活体动物中获取，并允许我们同时观察表皮形态以及GFP荧光的表达6,7,12。

<table><tbody><tr><td>Scotch 双面胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃载片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm × 18 mm 盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅酮真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦或落射荧光显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞成像完整组织中的感觉器官前体细胞 果蝇 蛹

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

自从发现绿色荧光蛋白（GFP）以来，活细胞成像作为研究基本生物学机制的工具经历了革命性的变革。这一进展在果蝇（Drosophila）研究中尤为显著，其丰富的突变体和转基因品系为研究进化上保守的发育与细胞生物学机制提供了便利的模型系统。我们致力于理解果蝇（Drosophila）成体外周神经系统（PNS）中细胞命运决定的调控机制。覆盖成年果蝇头部、胸部、腹部、腿部和翅膀的刚毛是独立的机械感受器官，被广泛用作研究Notch信号通路依赖性细胞命运决定机制的模型系统。小刚毛（microchaetes）的感觉器官前体细胞（SOP）分布于蛹期胸部的上皮组织中，并在化蛹开始后的前12小时内被确定。细胞命运确定后，SOP细胞开始分裂，并在有丝分裂过程中将细胞命运决定因子Numb不对称地分配至其中一个子细胞。Numb作为Notch信号通路的细胞自主性抑制因子发挥作用。
本文展示了一种结合组织特异性 Gal4 驱动系统与 GFP 标签融合蛋白的方法，用于在完整蛹胸体内的感觉器官前体细胞（SOP 细胞）及其子代细胞中追踪蛋白质动态过程1,2。该技术相较于固定组织或离体培养组织具有优势，因为它使我们能够连续观察器官发育的全过程，从神经前体细胞的特化，到器官的生长及终末分化。因此，我们可以直接将细胞行为的变化与终末分化的变化相关联。此外，我们可将活体成像技术与带有可抑制细胞标记的镶嵌分析（MARCM）系统相结合，以评估在突变型或野生型条件下有丝分裂中 SOP 细胞内标记蛋白的动态变化。利用该技术，我们及其他研究者已揭示了关于 SOP 细胞中不对称细胞分裂的调控机制以及 Notch 信号通路激活控制的新见解（相关实例参见文献1-6,7,8）。

在本视频中，我们介绍了一种对完整黑腹果蝇（Drosophila）蛹中的不对称分裂感觉器官前体细胞和表皮细胞进行活细胞成像的方法

自绿色荧光蛋白（GFP）被发现以来，活细胞成像作为理解……的工具已发生了革命性变化

本实验的总体目标是在变态过程中对分裂的胸部感觉器官前体细胞（SOP细胞）进行活细胞成像，为此需制备适合的Driss Pupi样本。首先通过设置适当的遗传杂交，获得可用于活细胞成像的子代puy。实验的第二步是在适当发育阶段收集oph puy，以观察不对称分裂的神经前体细胞。该实验步骤的第三步是去除蛹壳，以便将蛹固定用于成像。最后一步是将蛹置于载玻片和盖玻片之间，进行活细胞成像。最终，可通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察到野生型或突变型感觉器官细胞在不对称细胞分裂及分化过程中荧光标记蛋白的动态变化。与现有的免疫组织化学等方法相比，该技术的主要优势在于能够在完整活体样本中实时并持续数小时地追踪目标高尔第四代细胞系中GFP标记的融合蛋白的蛋白质动态变化。在UAS调控下，可识别出在过去一小时内已完成表达的细胞。这些细胞将具有典型的瞳孔形态特征，但缺乏色素沉着。可将选定的蛹转移到新的文件中，或在交叉文件上进行标记，以记录哪些是白色的蛹。18小时后，当蛹发育至适当阶段时，在载玻片上贴一小段双面胶，然后在解剖显微镜下将蛹壳腹面朝下粘附到载玻片上。用一对镊子识别并夹住围胸膜（URM）边缘，轻轻揭去，暴露出未成熟果蝇的头部。注意不要刺破果蝇的身体。轻轻撕开蛹壳的一侧，将其完全移除，以暴露胸部和腹部前段。继续小心地沿同一侧向后撕开，将蛹壳拉至另一侧并粘贴到胶带上。现在腹部已完全暴露，轻轻地将软毛刷插入蛹的头部下方，将其从其余的蛹壳中抬起。将蛹背面向上放置在显微镜载玻片上。将蛹置于45度角位置，以便盖玻片能够接触到胸部的SOP细胞区域。首先，通过在滤纸中心切割一个10毫米×10毫米的窗口，制作一个18毫米×18毫米的方形框架。将框架浸入水中至饱和，然后将其放置在蛹周围。使用5毫升注射器在框架周围均匀涂抹一层硅脂，使该层厚度略大于瞳孔直径。用移液器吸取约1微升水滴在22毫米×22毫米盖玻片的中心，并将盖玻片放置到位，使水滴接触瞳孔nodom。轻轻按压，使样本与蛹体表面完全贴合并形成密封的平整界面。现在活体蛹已制备完成，结合解剖与固定技术，即可通过共聚焦显微镜进行成像。利用活体成像技术，可观察有丝分裂过程中SOP细胞分裂沟处肌动蛋白GFP融合蛋白的聚集现象。在此过程中，可以比较 NUM RFP 的伴侣蛋白与 RAB 5G FP 在两个感觉母细胞（SOP）子细胞中的分布情况。需要注意的是，在瞳孔发育晚期阶段，NUM RFP 的伴侣蛋白呈不对称分布，而 RAB 5G FP 在两个细胞中的分布则相对均等。已分化的外部感觉器官可通过感觉窝和感觉毛的自发荧光进行观察，这些结构的自发荧光信号与在部分感觉母细胞中表达的 L-G-L-G-F-P 信号共定位显示。掌握马克姆系统后，若操作得当，该技术可在不到10分钟内完成。在完成此操作后，可进一步采用其他方法，如免疫组织化学，以回答更多问题，例如利用特异性抗体标记物鉴定感觉器官细胞中的硫酸盐，或开展GFP融合蛋白与内源性蛋白的共定位研究。

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