在 C 在体内激光干切断线虫

该程序的总体目标是在体内用激光精确切割 CL 的神经元。这是通过组装分类系统并精确聚焦、对齐和调整激光功率来实现的。当蠕虫固定在显微镜载玻片上时，可以通过精确的空间和时间控制来切割它们的神经元。

然后通过对生长锥进行评分和/或通过追踪神经突长度来衡量被切断的神经元再生的程度。与飞秒激光器等现有方法相比，该技术的主要优点是微点脉冲激光器是一种经济高效的系统，易于设置和维护，并且易于适应各种应用，尽管我们通常应用这种方法来研究 GABA 运动神经元的再生。该系统还可用于消融其他细胞类型，例如皮肤、肌肉或特定神经元突触。

这种方法需要一个微点激光系统。激光器安装在复合显微镜的落射荧光端口上，包括一个与待切割细胞中的荧光团相匹配的单向色性、一个脉冲发生器和一个用于作激光器的脚踏板。显微镜至少应配备 100 倍 1.4 NA 油物镜和 4 倍物镜。

有一个带纵杆作的电动载物台，并安装在空气台上进行照明。带有光导和快门机构的光源连接到微点激光器。快门机制可用于降低独立于激光的照明强度。

连接到计算机的相机需要至少 16 赫兹的帧速率，并且必须在光线不足的情况下正常运行。计算机需要成像软件（如 Nikon elements）来查看神经元、驱动相机和纵电动载物台。完全组装后，用户可以用一只手聚焦显微镜，用另一只手移动载物台，用脚踏板激活激光器，并清楚地看到屏幕上的图像。

在一粒沙子大小的生物体中切割神经元可能具有挑战性。为了实现这一点，激光器必须在所有三个维度上紧密聚焦。首先聚焦 Z 平面。

推入中性密度滤光片 ND 16 以减弱激光，同时聚焦以实现更精细的聚焦，同时推动 ND 16 和 ND 四个荧光滤光片。接下来，将微点激光器设置为一个脉冲，并转动开关进行选择，然后将滤光片轮移动到适当的长通屏障滤光片上。现在将镜像载玻片放在舞台上，并使用四倍物镜和透射光聚焦其中的针孔。

聚焦后，在载玻片上加入一滴浸油，然后用 100 倍物镜重新聚焦在针孔上。然后使用光路切换杆打开相机快门并打开激光快门。如果对焦准确，则很难对焦，降低透射光强度，使针孔的边缘清晰。

要测试焦点，请使用脚踏板发射激光。如果 Z 平面正确聚焦，镜子中应该会出现一个小孔。现在将显微镜聚焦在镜像载玻片平面的略上方并发射激光。再。

这应该会打出比第一次打球更小的孔，或者根本不留下任何痕迹。在镜像幻灯片下方聚焦时，应该会看到相同的结果。但是，如果产生更大的孔，则使用聚焦环在消融头上重新聚焦激光。

最后，验证孔是否仍与目镜中的十字准线正确对齐。在持续使用的情况下，Z 平面焦距很少需要调整。要将激光聚焦在 XY 平面中，请在镜子上再打一个孔，然后在 Nikon Elements 中访问该软件。

在获取菜单中启动实时捕捉模式。在度量工具栏中，选择 ROI 编辑器，选择双十字工具并拖动十字线以使其与新孔的中心对齐。单击 save ROI 然后退出编辑器以恢复实时捕获。

要使用鼠标作舞台，请激活鼠标 XY 设置。现在激光聚焦。将中性密度滤光片重置到其原始位置，并将激光脉冲设置为 1 到 10 以备将来使用。

首先，在 M 9 溶液中制备 3% 熔融 aros 的溶液，并将大约 5 毫升季铵盐放入 50 毫升的试管中。将试管置于 55 至 65 摄氏度的水浴中，并储存剩余部分以备将来使用。现在使用两张覆盖在标签上的幻灯片。

用胶带粘住一对干净的载玻片和一滴琼脂糖，制成一个可以放置蠕虫的垫子。30 秒后，aros 将在 10 分钟内将 3 至 5 微升 0.05 至 0.1 微米聚苯乙烯珠凝固的移液管移液到垫上，并用铂镐将 5 至 10 个转基因蠕虫快速排列到珠子上，以便轻松查看其标记的神经元。为避免损坏蠕虫，请小心地将标准盖玻片套在蠕虫上。

滑来滑去。现在，蠕虫载玻片已准备好执行分类法。使用目镜，用 100 倍物镜在四倍倍能量重新聚焦下定位蠕虫，关闭透射光，打开荧光并将光路切换到相机。

使用鼠标使神经元在十字准线上居中。现在用脚踏板发射激光。适量的激光功率将在一两个脉冲中切断神经元。

过大的激光功率会导致外围损伤或在蜗杆上炸出一个洞，以调整激光的功率，移动衰减板。如果激光变弱，可以调整衰减板位置以保持切割。然而，这可能表明，如果作正确，需要更换激光 D 单元中四个 40 的 Kumar

激光分类法在神经元中产生一个小的断裂。在某些情况下，受伤部位周围可能会形成小疤痕。实际上，每只动物被切割 1 到 3 个神经元，但没有理论限制。

完成后，通过直接向上移动去除盖玻片来恢复蠕虫，注意蠕虫留在农业玫瑰垫上。请勿滑下盖板。使用尖鼻镊子切出蠕虫周围的垫子。

将垫子放在含有 OP 50 的新鲜接种的 NGM 板上，并用 10 微升无菌 M nine 释放蠕虫。在耳外再生后 8 到 48 小时之间，可以评估为此，将健康的蠕虫重新安装在 3 到 5 微升的聚苯乙烯珠子上，并在切断的神经元中观察它们的神经元。切割部位远端的神经元残端将保持 远端和近端残端在被切割后最初会缩回，但预计近端残端会再生。

再生可以为生长锥的形成进行评分。或者，可以追踪和比较神经突长度，通常 60% 至 70% 的 GABA 神经元在切割后 24 小时内形成生长梳。如果激光器没有正确切割，可能是因为激光器失焦或需要更换染料池中的染料。

另外，如果你发现蠕虫在四处移动，可能是因为 agros 垫太湿了。我们发现，在将蠕虫放在垫子上之前，需要将垫子放置大约 30 秒才能避免此问题。此外，您可以尝试使用较小尺寸的微珠来固定蠕虫。

最后，如果您发现轴突呈串珠状，则可能是因为 agros 垫太干燥。看完这个视频，你应该对如何设置微点激光系统有了很好的了解。安装蠕虫进行分类切开术，切割单个神经元并评估随后的再生。