体内 激光轴突切断术在 C. elegans 中的应用

本实验的总体目标是在活体中利用激光精确切割线虫的CL神经元。通过组装显微切割系统，并精确聚焦、校准及调节激光功率来实现该操作。当线虫被固定在显微镜载玻片上后，可对其神经元进行具有精确空间和时间控制的切割。

通过计数生长锥或追踪神经突长度，来测量被切断的神经元再生的程度。该技术相较于现有方法（如飞秒激光）的主要优势在于，微焦点脉冲激光系统成本较低，易于安装和维护，并且可轻松适应多种不同应用。尽管我们通常采用该方法研究 GABA 运动神经元的再生，但该系统也可用于消融其他细胞类型，例如皮肤、肌肉或特定的神经元突触。

该方法需要一个微焦点激光系统。激光器安装在复合显微镜的落射荧光端口上，包含一个与待切割细胞中荧光染料相匹配的单色分光镜、一个脉冲发生器以及一个用于操作激光器的脚踏板。显微镜至少应配备一个100倍、1.4数值孔径的油镜物镜和一个4倍物镜。

配备带有操纵杆操作的电动载物台，并将其安装在气浮台上以实现稳定照明。光源系统配有导光管和快门装置，并连接至微焦点激光器。该快门装置可用于独立调节照明强度，而不影响激光输出。

连接到计算机的相机需要至少 16 赫兹的帧率，并且必须在低光照条件下具有良好的工作性能。计算机需要配备成像软件（例如 Nikon Elements），以用于观察神经元、控制相机以及操作电动载物台。当设备完全组装后，用户可以单手聚焦显微镜，另一只手移动载物台，用脚踏板激活激光器，同时能够清晰地查看屏幕上的图像。

在大小如沙粒的生物体中切割神经元可能具有挑战性。为此，必须在三个维度上紧密聚焦激光。首先聚焦 Z 平面。

插入中性密度滤光片 ND 16 以在聚焦时衰减激光，实现更精细的聚焦，同时推入 ND 16 和 ND 4 荧光滤光片。接着，将微点激光设置为单脉冲模式，通过旋转开关进行选择，然后将滤光轮移至适当的长通阻挡滤光片位置。现在将一个带反射面的载玻片放置在载物台上，使用 4 倍物镜和透射光对其中的针孔进行聚焦。

聚焦后，在玻片上滴加一滴浸油，使用100倍物镜重新对针孔进行聚焦。然后使用光路切换手柄打开相机快门，并打开激光快门。若精确聚焦困难，可降低透射光强度，使针孔边缘清晰锐利。

为测试焦点，使用脚踏板发射激光。如果 Z 平面聚焦正确，镜面上应出现一个小孔。现在将显微镜略微聚焦到镜面载玻片平面的上方，再次发射激光。

这应会形成比第一次射击更小的孔，或完全不留痕迹。在聚焦于镜面载玻片下方时，也应观察到相同的结果。然而，如果产生的孔较大，则需使用消融头上的聚焦环重新调整激光焦点。

最后，确认小孔仍与目镜中的十字线正确对齐。在持续使用过程中，Z平面焦距通常无需频繁调整。要在XY平面聚焦激光，请在镜面上再打一个孔，然后进入Nikon Elements软件进行操作。

在采集菜单中启动实时捕获模式。在测量工具栏中，选择 ROI 编辑器，选择双十字工具，并拖动十字线使其与新孔的中心对齐。点击保存 ROI，然后退出编辑器以恢复实时捕获。

要使用鼠标操控载物台，请激活鼠标 XY 设置。此时激光已聚焦。将中性密度滤光片重置回原始位置，并将激光脉冲数设置为1到10，以备后续使用。

首先，配制含有3%熔融琼脂糖的M9溶液，并将约五毫升分装至一个50毫升离心管中。将该离心管置于55至65摄氏度的水浴中，其余溶液保存以备后续使用。现在使用两张带有标签的载玻片。

用胶带固定一对干净的载玻片，并滴加一滴琼脂糖以制备垫片，用于放置线虫。30秒后，琼脂糖将凝固，在10分钟内用移液器吸取3至5微升0.05至0.1微米的聚苯乙烯微球至垫片上，然后用铂金挑针迅速将5至10条转基因线虫排列在微球上，以便于观察其标记的神经元。为避免损伤线虫，需小心地将标准盖玻片轻轻盖在线虫上。

移动观察。线虫玻片现已准备好进行分类学观察。先用目镜在4倍物镜下找到线虫，再用100倍油镜重新对焦，关闭透射光，打开荧光，切换光路至相机。

使用鼠标将神经元置于十字线中心。现在用脚踏板触发激光。适当的激光功率将在一到两次脉冲内切断神经元。

过高的激光功率会导致线虫周围组织损伤或将其烧出孔洞。为调节激光功率，可移动衰减板。若激光强度减弱，可通过调整衰减板位置以维持切割能力。但此现象通常表明激光器中为 Kumar in four 40 型号所配备的 D 型电池需要更换，此时应正确执行更换操作。

激光切削在神经元中产生微小断裂。在某些情况下，损伤部位周围可能会形成微小瘢痕。每个动物实际切割的神经元数量通常为一到三个，但理论上并无限制。

操作完成后，通过垂直向上移动盖玻片来回收线虫，注意保持线虫留在琼脂糖垫上。切勿滑动移除盖玻片。使用尖头镊子将线虫周围的琼脂糖垫剪下。

将垫片置于含有 OP50 的新接种的 NGM 平板上，用 10 微升无菌 M9 液体释放线虫。在切除手术后 8 至 48 小时内可评估再生情况；为此，将健康的线虫重新装载到 3 至 5 微升聚苯乙烯微珠中，并观察其被切断的神经元中的神经元结构。远离切割位点的神经元远端残端将保持存在。远端和近端残端在切割后最初都会回缩，但再生应从近端残端发生。

可以通过观察生长锥的形成来评估再生情况。或者，可追踪并比较神经突的长度，通常在切割后24小时内，约60%至70%的GABA能神经元会形成生长锥。如果激光无法正常切割，可能是由于激光失焦，或者染料池中的染料需要更换。

此外，如果你发现线虫在移动，可能是因为琼脂垫过于湿润。我们发现，将琼脂垫放置约30秒后再将线虫置于其上，可避免此问题。另外，可以尝试使用较小尺寸的微珠来固定线虫。

最后，如果你发现轴突呈现串珠状外观，很可能是因为琼脂垫过于干燥。观看本视频后，你应该能够充分掌握如何搭建微点激光系统，如何固定线虫以进行切片，如何切割单个神经元，以及如何评估其后续的再生情况。