活细胞钙成像相结合的siRNA介导的基因沉默标识CA ^{2 +}泄漏通道内质网膜和监管机制

在哺乳动物细胞中，内质网或 ER 在蛋白质生物发生和钙信号传导中起重要作用。ER 膜中的异源三聚体性 61 复合物为新合成的多肽进入 ER 腔提供了一条水路。最近的数据表明，61 也可能形成瞬时钙泄漏通道，以直接解决 61 复合物作为潜在钙泄漏通道的作用。

为了表征其推定的调节机制，首先用针对性 61 A one 基因的 siRNA 处理细胞。在互补分析中，用鸢尾花 GFP 载体转染细胞，该载体允许野生型 61 A one 基因的 irna 抗性表达。然后用比率公制钙指示剂 RO 2 加载细胞，并通过荧光显微镜监测胞质钙浓度的变化。

在测量钙水平时，进行溶液更换以评估各种药物（如钙调蛋白拮抗剂和 fabs 氩气）对钙泄漏的影响。对所得图像的定量分析揭示了由性 61 A 的沉默引起的钙 F 通量的变化。在本视频中，在演示程序和结果介绍之后，将介绍性别 61 A one 在钙 F 通量中的作用模型。

这种技术与现有方法（如行星脂质生物实验或单通道测量）的主要优点是，候选膜蛋白可以在天然环境中进行分析，而无需繁琐的纯化和通常效率低下的功能重构。这种方法可以帮助回答钙信号传导领域的关键问题，例如，在不同细胞类型中，特定的 ER 膜蛋白对 ER 中钙 ffl 的贡献是什么，它们是如何控制的？演示该程序将很漫长，NICO 来自我们实验室的两名才华横溢的研究生 通过准备要使用的溶液和试剂开始此程序 首先，根据随附书面方案中的说明制备无钙缓冲液。

接下来打电话，稀释钙指示剂的储备液。将 fira 于 2：00 AM 放入一毫升含有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素的 DMEM 中，至终浓度为 4 微摩尔，在无钙缓冲液中稀释 1 毫摩尔 Apso Garin 储备溶液至终浓度为 3 微摩尔，手头还有 200 微摩尔油精 A 和 20 微摩尔，以降低研究特定 irna 的脱靶效应的风险。使用两种不同的 irna 来沉默每个基因，以评估转染程序可能的副作用。

由随机核苷酸序列组成的阴性对照 siRNA 与实验 siRNA 平行转染。重要的是，可以通过野生型 CD NA 的表达来挽救 irna 介导的沉默效应。因此，用于实验的 siRNA 是经过专门选择的，因此拯救质粒不受 siRNA 的影响。在本实验中，siRNA 直接针对包被区和非包被区或非翻译区，即目标基因的缩写 UTR。

当 siRNA 针对 UTR 挽救时，可以使用不含内源性 UTR 的质粒在 hela 细胞中进行转染。每次转染 1 小时后，将 25 毫米多元醇赖氨酸包被的盖玻片放入一个 6 厘米的细胞培养皿中，制备用于转染的细胞，向第五个 Hela 细胞中加入 5.2 乘以 10，并向每个培养皿中补充 DMEM。要转染细胞，请标记一个微量离心管。

对于每个试管的每次转染反应，向每个试管中加入 4 微升 20 微摩尔 S irna，溶解在 80 微升最佳 IRNA 中，向每个试管中制备 SEC 61 A one、61 A one UTR 和阴性对照 irna。加入 20 μL 超完美转染试剂，轻轻涡旋，然后在室温下孵育反应 10 分钟。要转染细胞，将总共 104 μL 的 irna 混合物滴加到固定的 heli 细胞中，然后轻轻旋转培养皿，以确保转染复合物的均匀分布。

37 摄氏度的潮湿环境中与 5% 二氧化碳一起孵育。24 小时后，用 3.9 毫升新鲜培养基替换培养基。然后，为了提高转染效率，再次进行转染，使用相同的 irna 混合物评估沉默，进行 western blot 分析。

沉默率应高于 80%，如此处为 61 A 1。最大的沉默效果通常在第一次转染后 96 小时出现，在第一次转染后 48 小时准备挽救由性行为产生的表型。61 沉默 首先标记新的微量离心管。

对于每个反应，现在将用空载体或野生型 转染细胞。61 一个单表达质粒。此处使用的野生型表达质粒是通过将 61 A one cDNA 插入 pcd 的多克隆位点来生成的。

一个包含巨细胞病毒启动子、虹膜和绿色荧光蛋白包被序列的三个内部核糖体入口 GFP 载体。向每个试管中加入 4 μg 溶于 80 μL 最佳质粒中的每种质粒，以制备转染试剂。然后加入 16 μL FU 基因 HD 转染试剂，轻轻涡旋该溶液，并在室温下孵育 10 分钟。

然后在更换培养基后，将质粒混合物滴加到就位的 5.2 乘以 10 到第五个螺旋细胞中，并轻轻旋转培养皿以确保转染复合物的均匀分布。将细胞置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下，再孵育 48 小时。为了确定转染效率，通过荧光显微镜评估 GFP 表达。

48 小时后，应转染至少 80% 的细胞。成像前。使用镊子将带有转染的 hela 细胞的盖玻片转移到新的 3.5 厘米细胞培养皿中，并加入 1 毫升含 4 微摩尔的 DMEM。

如果您是凌晨 2：00，请在黑暗中在 45 摄氏度下孵育 25 分钟。要进行成像，请将装有较少的两个加载单元的盖玻片转移到金属记录室中，并通过将腔室的两个部分拧在一起将其固定到位。使用移液管向细胞中添加和去除 300 微升无钙缓冲液以洗涤它们。

重复并将记录室安装在带有多色五火化炉的 I MIC 显微镜上。使用 URA 2 的滤光片集，找到一个包含至少 20 个细胞的字段，以估计 FU A 2 的钙独立荧光。此步骤中使用的激发波长为 360 纳米。

选择合适的场后，将成像软件设置为在 340 纳米和 380 纳米处激发，并每三秒测量 510 纳米发射的荧光，设置曝光时间以产生大约 1000 个任意单位的荧光强度，对于此处显示的设置。设置了 5 毫秒的曝光时间。此外，标记无细胞背景区域和最多 20 个细胞等值线的感兴趣区域或 ROI。

在实验进行时启动生命细胞成像，系统将呈现较少两个信号的比率度量图像以及每个标记的 ROI 的实时 F 3 40 F 3 80 比率作为折线图，其中 F 三 40 和 F 三 80 分别对应于 340 和 380 纳米处 ROI 内的荧光强度。一分钟后，将测试溶液添加到成像室中以测试不同的实验参数。在这些实验中，在进行比率测量 10 分钟后，对 Cal Modlin 拮抗剂、三氟和 bollin A 进行测试。

对于 CAL 模块化拮抗剂，添加 DSA gargan 并继续测量。每次实验记录 400 张配对图像。收集图像后，查看图像并为每个视野标记至少 20 个单元格的 ROI。

随后，使用软件中的动力学分析选项创建一系列背景减去的比率图像和一个显示背景减去钙比率动力学的绘图。对于每个 ROI，最后使用既定的校准方法将数据导出到 excel 和 origin。胞质溶胶钙浓度可以通过比率测量来计算，以检查性别 61 A one 基因是否影响钙从 er 泄漏。

性别 61 A one 基因被两种不同的 RNA 和 helo 细胞沉默 96 小时。通过对一式三份的相似细胞数进行蛋白质血液分析来评估沉默，如图所示，泳道 1 到 3 中有很强的 6 61 alpha 信号，而泳道 4 到 6 和 7 到 9 的信号明显较弱，对应于 6 61 A one 沉默细胞。为了量化结果，将性 61 α 信号标准化为大于 80% 的 β 肌动蛋白信号，以实现沉默，以测试钙调蛋白在 ER 钙 F 通量中的作用。

URA 性别 61 A one sir A 处理的 helo 细胞成像是在存在或不存在 Cal Modin 拮抗剂的情况下进行的。Bollin A.这部电影显示了在 bollin 后 10 分钟用 bollin 处理的对照细胞。通过应用 FSO Gargan 开始治疗钙释放，FSO Gargan 是一种 circa 抑制剂，可在没有外部钙的情况下揭露 ER 的钙释放，如图所示。

FSA 氩的添加导致荧光短暂但显着增加，表明来自 er 的钙 F 通量。相比之下，在 PHE 骨骼中添加 FSO 加林后的钙 F 通量，A 处理的性别 61 A 一个沉默细胞要明显得多，如图所示。这种差异可以在这张图中清楚地看到，该图显示了一系列电影中随时间推移的估计胞质溶胶钙，此处显示的定量结果证实了在存在 offi bolin A 的情况下响应硫氩，对照细胞中的钙 flx 增加，如此条形图所示。

在第二个 CAM 拮抗剂三嗪中也观察到了相同的现象。然而，当 61 复合物被两种性别中的任何一种从细胞中耗尽时，没有看到 cam 拮抗剂的效果。61 A 单特异性 siRNAs 在性爱时可以看到这种表型的部分拯救 61 A 单沉默细胞被性转染。

61 个 One 表达质粒，如图所示。响应 Cal Modin 激动剂的钙 ffl 通过转染 irna 不敏感野生型质粒部分恢复。这些结果表明，Cal Modlin 参与限制细胞中性 61 复合物水平的 ER 钙 flx。

如果是这样，性转染，61 在 Cal Modin 结合位点具有双重突变的 one 基因不应挽救 irna 诱导的表型。事实上，当使用具有 IQ 基序双重突变的性 61 A 单表达质粒转染细胞时，没有对表型一起进行拯救。这些数据表明，从性 61 复合物中释放的新生链确实导致钙从 ER 中释放，并在性 61 复合物的细胞选择口周围形成钙纳米结构域。

这种钙与 Cal Moulin 和 Cal Moulin 钙结合，关闭了性别 61 复合物。观看此视频后，您应该对如何将人类细胞中 IRNA 介导的基因沉默与生活方式钙成像相结合，遵循此程序。可以执行其他方法，例如表达具有疾病连接突变的 CDNA，以回答其他问题，例如疾病连接突变对不相关成分的潜在影响。

并且不要忘记，使用水龙头等药物可能非常危险，并且在执行此程序时应始终携带手套等预防措施。