Name: 活细胞钙成像相结合的siRNA介导的基因沉默标识CA 2 +泄漏通道内质网膜和监管机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: 学习siRNA介导的基因沉默与活细胞钙成像相结合的方法，用于研究内质网膜上Sec61复合体作为钙泄漏通道的调控机制。该技术可在天然细胞环境中分析膜蛋白功能。

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S.L. 获得德国研究基金会（DFG）（研究生院研究项目 845）的资助。本工作获得德国研究基金会（DFG）（SFB 530/C1 和 FOR 967）以及 HOMFOR 项目的资助。

1. 储备液的配制
<ol>
<li>配制无钙缓冲液（140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、0.5 mM EGTA、10 mM 葡萄糖溶于 10 mM HEPES-KOH，pH 7.35）。</li>
<li>将 FURA-2 AM 溶于 DMSO 中，配制成 1 mM 储存液。使用涡旋振荡器混匀，直至溶液呈均匀的淡黄色。避光保存。将 FURA-2 AM 储存液稀释至 1 ml 含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中，终浓度为 4 μM，用于 HeLa 细胞负载。</li>
<li>用蒸馏水（pH 7.0）配制 12.5 mM 嘌呤霉素储存液。分装后于 -20°C 保存。使用前将 12.5 mM 嘌呤霉素储存液用无钙缓冲液稀释至终浓度为 500 μM。</li>
<li>将毒胡萝卜素溶于 DMSO 中，配制成 1 mM 储存液。</li>
<li>将 1 mg 斑蝥素 A 溶于 20 μl 氯仿中，随后加入 25 μl DMSO 混匀。微型离心管保持敞口直至氯仿完全挥发，最终斑蝥素 A 浓度为 100 mM。分装后于 -20 °C 保存。使用前将储存液用无钙缓冲液稀释至终浓度为 100 μM，活细胞成像时终浓度 DMSO 不超过 0.1%。</li>
<li>将三氟拉嗪溶于 DMSO 中，配制成 10 mM 溶液，分装后于 -20 °C 保存。使用前将储存液用无钙缓冲液稀释至终浓度为 10 μM，活细胞成像时终浓度 DMSO 与斑蝥素 A 相同，不超过 0.1%。</li>
<li>将 siRNA（SEC61A1 siRNA、SEC61A1-UTR siRNA 和对照 siRNA）溶于无 RNase 水中，配制成 20 μM 储存液。使用涡旋振荡器混匀，并肉眼观察溶解情况。分装 50 μl 于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. HeLa 细胞中的基因沉默
为了研究某种特定蛋白质对内质网Ca2+外流的贡献，必须使用两种不同的siRNA有效沉默相应基因（图1）。此外，还需通过表达相应的野生型基因来逆转沉默效应。通常，我们采用分别靶向目的基因编码区和非编码区（UTR）的siRNA。使用靶向UTR的siRNA可为功能互补实验提供便利。
<ol>
	<li> 在6 cm培养皿中接种5.2 × 105个HeLa细胞（ATCC编号CCL-2），培养皿内放置25 mm盖玻片（预先用200 μl聚-L-赖氨酸（1 mg/ml）处理1 h），加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37°C、5% CO2的湿润环境中培养（终体积为3.9 ml）。</li>
	<li> 使用HiPerFect转染试剂，按照制造商说明书将SEC61A1 siRNA、SEC61A1-UTR siRNA或阴性对照siRNA转染入细胞（siRNA终浓度为20 nM）。简要而言，在正式转染前，于独立的微量离心管中新鲜配制siRNA混合物：将20 μl HiPerFect转染试剂加入含4 μl各siRNA（20 μM）的80 μl OptiMEM溶液中。轻轻涡旋混匀，室温孵育10分钟。随后将siRNA混合液（104 μl）逐滴加入已接种的5.2 × 105个HeLa细胞（3.9 ml）中。</li>
	<li> 24小时后更换培养基（3.9 ml），并使用相同的siRNA混合液（104 μl）进行第二次转染。</li>
	<li> 通过Western blot分析评估基因沉默效果，沉默效率应高于80%。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养皿中的细胞，并在DMEM中收集细胞。使用Countess全自动细胞计数器进行细胞计数。用细胞裂解缓冲液（10 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 8.0，3 mM MgCl2，0.5% NP40）裂解细胞，同时加入蛋白酶抑制剂混合物（3 μg/ml Pepstatin A，3 μg/ml Leupeptin，3 μg/ml Antipain，3 μg/ml Chymastatin），再与SDS上样缓冲液（60 mM Tris-HCl，pH 6.8，2% SDS，10%甘油，5% β-巯基乙醇，0.01%溴酚蓝）混合，使终浓度达到10,000个细胞/μl。将样品在56 °C加热15分钟，随后加入玻璃珠，涡旋20分钟以剪切DNA。取每种样品20 μl进行Laemmli型SDS-PAGE电泳（通常分离胶为15%聚丙烯酰胺）。通过湿法电转印，在恒定400 mA电流下于转移缓冲液（100 mM甘氨酸，12.5 mM Tris-HCl）中将分离的蛋白质转移至PVDF膜，持续3小时或过夜。转膜后，用含5%（w/v）脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭30分钟，然后分别孵育针对Sec61α C末端的兔源一抗和抗β-actin小鼠源一抗。用PBS-TritonX-100（0.05%）洗涤一次，再用PBS洗涤两次，每次5分钟。使用ECL Plex山羊抗兔IgG-Cy5或ECL Plex山羊抗小鼠IgG-Cy3偶联物，并结合Typhoon-Trio成像系统与Image Quant TL软件7.0进行信号检测。对于SEC61A1基因，最大沉默效应通常出现在首次转染后96小时。代表性实验结果见图2。</li>
</ol>
3. HeLa 细胞的互补实验
为了挽救SEC61A1沉默的表型，将SEC61A1 cDNA插入含有巨细胞病毒（CMV）启动子、多克隆位点（MCS）、内部核糖体进入位点（IRES）以及绿色荧光蛋白（GFP）编码序列的pCDNA3-内部核糖体进入位点（IRES）-GFP载体的多克隆位点（MCS）中。
<ol>
<li>首次siRNA转染后48小时，再次更换培养基（3.9 ml），并根据制造商说明书，使用Fugene HD将细胞转染空载体或SEC61A1表达质粒（载体与Fugene HD的最终比例为4 μg载体对应16 μl Fugene HD）。简言之，在转染操作前，于独立的微量离心管中新鲜配制质粒：将16 μl Fugene HD转染试剂加入溶解于80 μl OptiMEM中的4 μg各质粒中。轻轻涡旋混匀，室温孵育10分钟。将质粒混合液（0.1 ml）逐滴加入已接种的5.2 × 105 HeLa细胞（3.9 ml）中。</li>
<li>质粒表达48小时后，在进行钙成像和细胞收集之前，对培养皿进行荧光显微镜观察。如有必要，可用PBS替换DMEM以获得更佳的荧光信号。使用配备冷却CCD相机的荧光显微镜记录荧光图像。转染效率可通过计算显示GFP荧光的细胞数占明场模式下计数的总细胞数的比例来确定，效率应高于80%。典型结果如图3所示。</li>
</ol>
4. 活细胞钙离子成像
<ol>
<li>测量前，将转染的 HeLa 细胞接种在盖玻片上，并转移至另一个 3.5 cm 培养皿中。加入 1 ml 含 4 μM FURA-2 AM 的 DMEM，于 25°C 避光孵育 45 分钟11,12。</li>
<li>将 25 mm 盖玻片固定于 iMIC 金属腔室中，用无钙缓冲液洗涤细胞两次（每次 300 μl），并进行孵育。</li>
<li>在 iMIC 显微镜上使用多色光源 V，交替以 340 nm 和 380 nm 激发，检测 510 nm 处的发射荧光（滤光片设置：分光镜 565 nm；发射滤光片 605/70 nm），开始采集数据。每 3 秒采集一次图像，每帧包含 20–50 个细胞。以 F340/F380 比值记录 FURA-2 信号，其中 F340 和 F380 分别代表扣除背景后 340 nm 和 380 nm 处的荧光强度。</li>
<li>1 分钟后，向细胞中加入嘌呤霉素（500 μM）或等量无钙缓冲液。或者，加入小分子抑制剂（如 10 μM 三氟拉嗪或 100 μM ophibolin A）或仅加入无钙缓冲液。</li>
<li>在进行 2 或 10 分钟的比值测量后，加入毒胡萝卜素（1 μM），并继续测量。</li>
<li>最终，通过已建立的校准方法从比值测量结果估算细胞质 [Ca2+] 浓度2。使用 Excel 2007 和 Origin 6.1 进行数据分析。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
到目前为止，我们探讨了沉默SEC61A1基因是否影响内质网（ER）中的钙离子（Ca2+）泄漏（图1）。在HeLa细胞中，使用两种不同的siRNA沉默SEC61A1基因达96小时。尽管沉默对细胞生长和活力几乎没有影响，但在半通透化细胞中，蛋白质向内质网的转运几乎完全被抑制。此外，SEC61A1基因沉默的细胞在内质网Ca2+泄漏方面受到严重影响。基因沉默的效应可通过重新表达SEC61A1基因而逆转。因此，存在于所有有核细胞内质网膜上的Sec61复合物可形成Ca2+泄漏通道，在Ca2+稳态中发挥关键作用。然而，Sec61复合物在内质网膜上形成的这种大而充满水的、具有非选择性离子通透性的孔道，会严重干扰Ca2+从内质网腔向胞质溶胶的受控释放——这是细胞内信号传导的重要机制。我们在哺乳动物Sec61α的胞质N端鉴定出一个钙调蛋白（CaM）结合基序，该基序以纳摩尔亲和力和序列特异性结合CaM，但不结合无Ca2+的脱钙钙调蛋白（apocalmodulin）。在细胞水平上，两种不同的CaM拮抗剂仅在存在Sec61通道的情况下促进内质网中Ca2+的释放，而在缺乏Sec61通道时则无此现象（图4和图5）。当Sec61通道中Sec61α的IQ基序发生突变时，该效应未被观察到。因此，Ca2+-CaM参与限制内质网中Ca2+的泄漏（图6）。
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="HeLa细胞siRNA质粒转染，Fura-2钙离子成像；实验流程示意图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 图1．流程图。详见正文。
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Western blot 示意图，SEC61 siRNA 对 Sec61α 的影响，β-actin 对照；蛋白质表达分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 沉默效率的数据分析。通过使用靶向 Sec61α 和 β-actin（上样对照）的抗体进行 Western blot 分析，以评估沉默效果。使用 ECL Plex 二抗及荧光成像技术对一抗进行检测。
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="未处理组、空载体对照组及转染SEC61A1载体组的明场与GFP荧光通道比较" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 转染效率数据分析。图像使用配备冷却CCD相机的荧光显微镜采集。转染效率可通过统计显示GFP荧光的细胞数量，并除以明场模式下计数的总细胞数来确定。
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="HeLa细胞siRNA实验，细胞松弛素A；tg分钟；荧光显微镜图像；SEC61分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 对照组或处理组存在下，活细胞钙成像的 HeLa 细胞截图 SEC61A1-siRNA 以及钙调蛋白拮抗剂 ophiobolin A 的有无。HeLa 细胞用针对 SEC61A1 (B) 或阴性对照 siRNA (A) 处理 96 小时，如图所示。这些细胞负载钙离子指示剂 FURA-2 AM，并在含钙缓冲液中孵育2+ 含 0.5 mM EGTA 的无钙缓冲液孵育后，加入缓冲液或含蛇孢菌素 A（Ophio A）的缓冲液继续孵育。10 分钟后，Ca2+ 通过在无外源 Ca 的条件下加入毒胡萝卜素（TG）启动释放2+ 继续孵育。在指定时间点拍摄连续钙成像的截图。
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="钙信号动态图；siRNA影响；柱状图；测试了毒胡萝卜素和蛇形菌素A。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 图5. 活细胞钙成像实验的数据分析。（A）如图4A所示的一系列实验的动力学与定量分析。细胞质[Ca2+]通过已建立的校准方法2从比值测量中估算。毒胡萝卜素的作用以柱状图形式展示。（B-D）细胞用对照siRNA或指定的SEC61A1-siRNA处理48小时，随后转染对照载体（C），或SEC61A1表达质粒（C），或突变型SEC61A1表达质粒（D），如图所示。48小时后，按照图4和图5A的方法进行钙成像实验。展示了如A图所示实验中加入毒胡萝卜素后细胞质Ca2+浓度变化的统计分析结果。通过非配对t检验定义P值&lt;0.001为显著，用三个星号（***）表示；n.s.，无显著性差异。分析的细胞数量已标明。数据以平均值表示，误差线代表均值的标准误（s.e.m.）。需说明的是，这些示例改编自参考文献13。
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="蛋白质转位示意图，核糖体，Sec61复合物，钙离子转运，内质网膜过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 这些数据表明，新生肽链从Sec61复合物释放确实会导致内质网中的钙离子释放，并在Sec61复合物胞质口周围形成钙纳米结构域。该钙离子被钙调蛋白结合，钙-钙调蛋白复合物可关闭Sec61复合物。

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+physiological+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li>
<li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li>
<li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li>
<li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum%3A+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li>
<li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li>
<li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocon+closure+to+Ca2%2B+leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li>
<li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+form+ER+Ca2%2B+leak+channels%2C+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer%27s+disease-linked+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li>
<li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li>
<li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li>
<li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+signalling+by+Na%2B%2FCa2%2B+exchangers+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li>
<li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC5+is+a+Ca2%2B-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2%2B-selective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li>
<li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在哺乳动物细胞中，内质网（ER）在蛋白质生物合成以及钙信号传导中发挥关键作用。本文描述了一种实验系统，可直接探究一种潜在的Ca2+泄漏通道的作用，并表征其假定的调控机制13。该实验系统为我们提供了独特的机会：i）评估不同内质网膜蛋白在多种细胞类型中对内质网被动Ca2+外流的贡献；ii）鉴定并表征限制这种被动Ca2+外流的蛋白及机制；iii）研究与疾病相关的突变对相关组分功能的影响。
我们注意到，仅应分析活细胞，且总体存活率应高于80%。因此，通常根据制造商的说明书，使用Nuclear-ID蓝/绿细胞活力试剂对细胞活力进行常规评估。此外，必须对胞质Ca2+浓度的变化进行统计学分析。因此，每项实验需针对四种不同批次的细胞进行，并且每种条件下至少分析两个盖玻片，每个盖玻片至少包含20个细胞。我们注意到，所有不同实验必须在细胞接种到盖玻片后的同一时间点进行。

<table><tbody><tr><td>DMEM+GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM+GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrom AG</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>PAA Laboratories</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect</td><td>Qiagen</td><td>301707</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Roche Group</td><td>04709713</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear-ID 蓝色/绿色细胞活力试剂</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-53004</td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1221</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Invitrogen</td><td>T-7459</td><td></td></tr><tr><td>蛇形毒素 A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-109</td><td></td></tr><tr><td>三氟拉嗪</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 6062</td><td></td></tr><tr><td>Countess&amp;#174; 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon-Trio 成像系统</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE2000-S 显微镜配 DS-5Mc 相机</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMIC 显微镜配多色 V 光源</td><td>Till Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞钙成像结合sirna介导的基因沉默技术鉴定内质网膜上的ca2+渗漏通道及其调控机制

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

在哺乳动物细胞中，内质网（ER）在蛋白质生物合成以及钙信号传导中发挥关键作用1内质网膜中的异源三聚体 Sec61 复合物为新合成的多肽链进入内质网腔提供了水相通道。近年来多个实验室的研究表明，该异源三聚体复合物还可能形成瞬时的 Ca2+ 漏通道2-8. 这一观点的关键观察依据是，新生多肽链通过嘌呤霉素从核糖体和Sec61复合物释放后，会导致Ca²⁺的瞬时释放2+ 从内质网。此外，已有观察发现 体外 内质网腔蛋白 BiP 参与防止 Sec61 复合物水平上的离子通透性9,10我们建立了一个实验系统，可直接研究Sec61复合物作为潜在Ca2+ 漏通道并表征其假定的调控机制11-13. 该系统结合了siRNA介导的基因沉默与活细胞Ca2+ 成像13. 细胞分别用靶向编码区和非翻译区（UTR）的siRNA进行处理 SEC61A1 基因或阴性对照 siRNA。在互补分析中，细胞共转染一个 IRES-GFP 载体，该载体可实现野生型基因的 siRNA 抗性表达 SEC61A1 基因。然后用比率型 Ca2+-指示剂 FURA-2 以同时监测胞质 Ca²⁺ 的变化2+ 通过荧光显微镜测量多种细胞中的浓度。细胞质 Ca 的连续测量2+ 还可用于评估多种试剂（如嘌呤霉素、小分子抑制剂和毒胡萝卜素）对Ca的影响2+ 泄漏。该实验系统使我们能够独特地评估不同内质网膜蛋白对被动钙2+ 从多种细胞类型的内质网中流出，ii) 鉴定限制这种被动 Ca2+ 外排，以及 iii) 研究疾病相关突变对相应组分的影响。

内质网在蛋白质生物合成和钙稳态中起关键作用。我们已建立一个实验系统，可用于研究Ca2+泄漏通道的作用，并表征其可能的调控机制。该系统包括siRNA介导的基因沉默和活细胞Ca2+成像。

活细胞钙成像结合siRNA介导的基因沉默技术鉴定内质网膜上的Ca2+渗漏通道及其调控机制

在哺乳动物细胞中，内质网（ER）在蛋白质生物合成以及钙信号传导中发挥关键作用1。异源三聚体 Sec61 ...

在哺乳动物细胞中，内质网（ER）在蛋白质生物合成和钙信号传导中发挥着重要作用。内质网膜上的异源三聚体Sec61复合物为新合成的多肽链进入ER腔提供了亲水性通道。最近的研究数据表明，Sec61还可能形成瞬时的钙漏通道，本研究旨在直接探讨Sec61复合物作为潜在钙漏通道的作用。为了表征其假定的调控机制，首先用靶向 sex 61 A one 基因的 siRNA 处理细胞。在互补分析中，细胞共转染一个 iris GFP 载体，该载体可实现对 siRNA 具有抗性的野生型 sex 61 A one 基因的表达。随后，将细胞负载比率型钙离子指示剂 RO two，并通过荧光显微镜监测胞质钙离子浓度的变化。在测定钙离子水平的同时，通过更换溶液来评估各种试剂（如钙调蛋白拮抗剂和fab片段氩）对钙泄漏的影响。对所得图像进行定量分析，揭示了sex 61 A one基因沉默所诱导的钙离子流变化。在本视频中，将在演示实验步骤并展示结果之后，提出sex 61 A one在钙离子流中的作用模型。与现有的方法（如平面脂质双分子层实验或单通道测量）相比，该技术的主要优势在于，候选的膜蛋白可以在天然环境中进行分析，而无需繁琐的纯化步骤以及通常效率较低的功能性重组。该方法有助于回答钙信号转导领域中的关键问题，例如，特定的内质网膜蛋白在不同类型细胞中对内质网钙释放的贡献是什么？以及这些过程是如何被调控的？本实验操作将由来自我们实验室的两位优秀研究生Sway Long和NICO进行演示。首先，开始准备本实验所需的溶液和试剂。第一步，请根据随附的书面实验方案中的说明配制无钙缓冲液。接下来，稀释钙离子指示剂的储备液。将四微摩尔终浓度的Fura-2 AM工作液用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基稀释至一毫升。同时，将一毫摩尔的Apogarins储备液用无钙缓冲液稀释至三微摩尔的终浓度。此外，准备200微摩尔的油酸（oleic acid）和20微摩尔的试剂，以降低研究特定siRNA脱靶效应的风险。为评估转染过程可能产生的副作用，使用两种不同的siRNA沉默每个基因。阴性对照siRNA由随机核苷酸序列组成，需与实验用siRNA平行转染。重要的是，RNA干扰介导的沉默效应可通过表达野生型cDNA得到挽救。因此，实验所用的siRNA需经过特异性筛选，以确保挽救质粒不受siRNA影响。在本实验中，siRNA靶向目的基因的编码区和非编码区，或称非翻译区（UTR）。当siRNA靶向UTR拯救时，可使用不含内源性UTR的质粒在HeLa细胞中进行转染。转染前，为每次转染准备一个六厘米细胞培养皿，在其中放入一个25毫米的多聚赖氨酸包被的盖玻片；一小时后，向每个培养皿中加入5.2×10⁵个HeLa细胞，并补充DMEM培养基。为转染细胞，请标记一个微量离心管。每管转染反应中，加入4微升溶于80微升Opti-MEM中的20微摩尔siRNA，每管分别加入SEC61A1、SEC61A1 UTR及阴性对照siRNA。随后加入20微升Hyperfect转染试剂，轻轻涡旋混匀，室温孵育10分钟。转染细胞时，将总共104微升的siRNA混合物逐滴加入已贴壁的Huh7细胞中，并轻轻摇晃培养皿，以确保转染复合物均匀分布。在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。24小时后，更换为3.9毫升新鲜培养基。随后为提高转染效率，使用相同的irna混合物进行第二次转染，以评估基因沉默效果，并进行蛋白质印迹分析。如本例中对 sex 61 A 一所示，基因沉默效率应高于 80%。通常在首次转染后 96 小时观察到最大沉默效应，在首次转染后 48 小时开始进行挽救由 sex. 61 沉默所导致表型的实验。首先标记一个新的微量离心管。对于每个反应，细胞将转染空载体或野生型 sex. 61 A one 表达质粒。此处使用的野生型表达质粒是通过将 sex 61 A one cDNA 插入 pcd 的多克隆位点而构建的。一种含有巨细胞病毒启动子、iris序列以及绿色荧光蛋白编码序列的三重内部核糖体进入位点GFP载体。通过将每种质粒各4微克溶于80微升Opti-MEM培养基中，加入各试管来制备转染试剂。然后向其中加入16微升FuGENE HD转染试剂，轻轻涡旋混匀，并在室温下孵育10分钟。更换培养基后，将质粒混合物逐滴加入已贴壁的5.2 × 10⁵个Heli细胞中，并轻轻晃动培养皿以确保转染复合物均匀分布。将细胞置于37°C、5% CO₂条件下继续培养48小时。为评估转染效率，通过荧光显微镜观察GFP表达情况。48 小时后，至少应有 80% 的细胞被转染。成像前，用镊子将带有转染 HeLa 细胞的盖玻片转移至新的 3.5 厘米细胞培养皿中，并加入 1 毫升含 4 微摩尔的 DMEM。如果你在凌晨2:00，将样品在25摄氏度避光孵育45分钟。进行成像时，将载有较少两个加载细胞的盖玻片转移至金属记录室，并通过拧紧室的两部分将其固定。使用移液器向细胞中加入并移除300 µL无钙缓冲液，以洗涤细胞。重复上述步骤后，将记录室安装在配备多色五光源的 I MIC 显微镜上。使用适用于 URA2 的滤光片组，找到一个包含至少 20 个细胞的视野，以估算 FUA2 的钙非依赖性荧光。此步骤中使用的激发波长为 360 纳米。选择合适的视野后，设置成像软件在340纳米和380纳米波长下激发，并每三秒测量一次510纳米处的发射荧光；根据此处所示的实验装置，设定曝光时间，使荧光强度约为1000个任意单位。本实验设定的曝光时间为5毫秒。此外，标记无细胞的背景区域以及最多20个细胞轮廓作为感兴趣区域（ROIs）。在实验进行过程中启动活细胞成像，系统将呈现两个信号的比率计量图像，以及每个标记 ROI 的实时 F340/F380 比值折线图，其中 F340 和 F380 分别对应于 ROI 内 340 和 380 纳米处的荧光强度。一分钟后，向成像室中加入测试溶液，以检测不同的实验参数。在这些实验中，钙调蛋白拮抗剂三氟拉嗪和博莱霉素 A 在完成额外 10 分钟的比率计量测量后进行测试。对于CAL模块化拮抗剂，加入DSA gargan并继续进行测量。每次实验记录400对图像。图像采集完成后，查看图像并为每个视野中的至少20个细胞标记感兴趣区域（ROI）。随后使用软件中的动力学分析功能，生成一系列扣除背景的比率图像，并绘制显示扣除背景的钙离子比率动力学曲线。针对每个 ROI，最终通过已建立的校准方法将数据导出至 Excel 和 Origin。可根据比率测量值计算细胞质钙离子浓度，以检测 sex 61 A 一基因是否影响内质网的钙泄漏。通过两种不同的RNA干扰技术，对61A1基因在helo细胞中进行了96小时的沉默处理。通过蛋白质印迹法对三组数量相当的细胞进行分析以评估沉默效果：如图所示，第1至第3泳道中61α信号较强，而对应于61A1基因沉默细胞的第4至第6泳道以及第7至第9泳道中信号显著减弱。为定量分析结果，将61α信号值归一化至β-actin信号，结果显示基因沉默效率超过80%。该结果用于检验钙调蛋白在内质网钙离子流中的作用。在存在或不存在钙调蛋白拮抗剂Bollin A的条件下，对URA双成像检测61例A型经处理的helo细胞进行了观察。该视频显示了用Bollin A处理的对照细胞，在Bollin A处理10分钟后，通过施加FSO Gargan（一种环状抑制剂）启动钙离子释放，该抑制剂在无外源性钙离子的条件下可诱导内质网中钙离子的释放，如本视频所示。加入FSA氩气后，荧光出现短暂但显著的增强，表明内质网中钙离子的释放。相比之下，如图所示，在PHE骨细胞及经A处理的61A一过性沉默细胞中，加入FSO加林后钙离子释放的幅度要小得多。这一差异在本图中可清晰观察到，该图显示了一系列影像中细胞质钙离子浓度随时间变化的估算值。此处展示的定量结果进一步证实，在菲波林A存在的情况下，对照组细胞对噻氩刺激产生更强的钙离子流反应，如本柱状图所示。第二种cam拮抗三嗪也观察到了相同的现象。然而，当通过两种sex.61特异性siRNA之一将sex 61复合物从细胞中耗竭后，cam拮抗剂的作用则不再出现。在sex 61 A one沉默细胞中转染sex时，可观察到该表型的部分挽救。61 是一个表达质粒，如图所示。在转染了对irna不敏感的野生型质粒后，细胞对钙调蛋白激动剂诱导的钙离子内流反应部分恢复。这些结果表明，Cal Modlin 在细胞中通过与 sex 61 复合物相互作用，参与调控内质网钙离子的流动。如果是这样，转染在钙调蛋白结合位点具有双突变的 sex 61 A1 基因则不应挽救由 irna 诱导的表型。事实上，当使用在 IQ 基序中带有双突变的 sex 61 A1 表达质粒转染细胞时，并未观察到表型的恢复。综上所述，这些数据表明，新生肽链从 sex 61 复合物的释放确实会导致内质网中钙离子的释放，并在 sex 61 复合物的胞质侧开口周围形成钙纳米结构域。这种钙离子被Cal Moulin结合，钙结合的Cal Moulin会关闭sex 61复合物。观看本视频后，您应能够充分理解如何将人细胞中由siRNA介导的基因沉默与生活方式相关的钙成像技术相结合。在此实验流程基础上，还可开展其他方法，例如表达携带疾病相关突变的cDNA，以回答更多科学问题，如疾病相关突变对无关组分可能产生的影响。并且请勿忘记，操作诸如三氯乙酸等药物时可能具有极高的危险性，因此在进行此操作时，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套。

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