Name: 鼠标完成血瘀模型的下腔静脉血栓 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: 学习小鼠下腔静脉血栓模型建立方法，通过结扎IVC诱导完全淤滞以研究血栓形成与消退过程。该模型可量化血栓负荷及静脉壁炎症反应，为静脉血栓疾病研究提供重要实验基础。

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1. 小鼠麻醉操作步骤
<ol>
	<li>将动物从笼中取出，放入麻醉前诱导室，以 5% 异氟烷和 100% 氧气进行气体诱导，流速为 0.5 升/分钟（通过蒸发器控制）。</li>
	<li>小鼠在麻醉诱导室中镇静后，从室内取出，使用电动剪毛器剃除腹侧腹部毛发；若使用脱毛剂，则可保留在诱导室内处理（1 分钟）。</li>
	<li>动物在持续镇静状态下称重，眼睛涂抹无菌眼用软膏，随后置于循环温水加热装置上，呈仰卧位，在通过鼻罩给予异氟烷和氧气的全身麻醉下继续操作。此时将氧气流速调低至 0.2 升/分钟。</li>
	<li>用氯己定溶液喷洒腹部（二乙酸氯己定具有快速杀菌作用且作用持久），再用无菌纱布擦拭三次，或持续擦拭直至手术区域清洁。</li>
</ol>
2. 小鼠显微外科及术后恢复操作
<ol>
	<li>使用虹膜剪在皮肤和腹壁上做一条2 cm的腹正中切口，暴露腹腔。用无菌生理盐水浸湿的2×2英寸纱布将肠管推向动物左侧。放置小鼠固定器，以便观察下腔静脉（IVC）。</li>
	<li>此时，手术剩余过程中采用2%异氟烷和100%氧气，流速为0.2升/分钟，维持麻醉深度。</li>
	<li>使用无菌棉签和超精细半弯虹膜组织镊进行钝性分离。操作小鼠组织时需格外小心，因其极为脆弱。进入腹腔后，用无菌生理盐水浸湿的4×4英寸纱布将肠管牵开并外置到无菌手术巾上，从而暴露下腔静脉（IVC）。</li>
	<li>从肾静脉至髂动脉分叉处的所有下腔静脉后侧分支均用电凝烧灼，侧支则用7-0非反应性聚丙烯缝线结扎。</li>
	<li>在肾静脉稍下方将下腔静脉与主动脉分离。使用7-0聚丙烯缝线结扎下腔静脉。</li>
	<li>腹壁切口采用两层缝合法关闭。本实验室使用5-0薇乔线（一种合成缝线）连续缝合关闭腹壁。皮肤用医用粘合胶闭合，无需留置外部缝线，术后无需拆线。</li>
	<li>术后将小鼠置于单独的笼具中恢复，在加热灯下观察45分钟至2小时（加热灯与笼具的最小距离为24英寸），然后送回原饲养单元。若不干扰实验目的，可使用镇痛药和抗炎药物。如需免除镇痛药物使用，须提供科学依据，并获得兽医及IACUC批准。本实验室发现，皮下注射布托啡诺（Buprenorphine）0.05–0.1 mg/kg，是小鼠术前和术后优良的镇痛方案。此外，当全身性镇痛可能干扰实验结果时，可在切口部位注射利多卡因（Lidocaine）4 mg/kg（即1%溶液0.4 ml/kg）。</li>
	<li>各实验组的假手术动物接受与上述相同的解剖操作，但不结扎或电凝下腔静脉及其任何引流支。</li>
	<li>安乐死操作遵循美国兽医协会（AVMA）《啮齿类动物安乐死指南》中的建议执行。</li>
</ol>

<ol><li>Naess, I. A., Christiansen, S. C., Romundstad, P., Cannegieter, S. C., Rosendaal, F. R., Hammerstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+mortality+of+venous+thrombosis%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Incidence and mortality of venous thrombosis: a population-based study.</a> J Thromb Haemost. 5, 692-699 (2007).</li>
<li>White, R. H., Keenan, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+race+and+ethnicity+on+the+incidence+of+venous+thromboembolism%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of race and ethnicity on the incidence of venous thromboembolism.</a> Thromb Res. 123, Suppl 4. S11-S17 (2009).</li>
<li>Heit, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+venous+thromboembolism+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of venous thromboembolism in the community.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, 370-372 (2008).</li>
<li>Henke, P. K., Varga, A., De, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+vein+thrombosis+resolution+is+modulated+by+monocyte+CXCR2-mediated+activity+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep vein thrombosis resolution is modulated by monocyte CXCR2-mediated activity in a mouse model.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 1130-1137 (2004).</li>
<li>McDonald, A. P., Meier, T. R., Hawley, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+impaired+thrombus+resolution+in+a+mouse+model+of+stasis+induced+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with impaired thrombus resolution in a mouse model of stasis induced thrombosis.</a> Thromb Res. 125, 72-78 (2010).</li>
<li>Myers, D., Farris, D., Hawley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+influence+thrombosis+in+a+mouse+model+of+experimental+deep+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis.</a> J Surg Res. 108, 212-221 (2002).</li>
<li>Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+and+leukocyte+microparticles+are+associated+with+venous+thrombogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis.</a> J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).</li>
<li>Myers, D. D. J. r, Rectenwald, J. E., Bedard, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+venous+thrombosis+with+an+oral+inhibitor+of+P+selectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Decreased venous thrombosis with an oral inhibitor of P selectin.</a> J Vasc Surg. 42, 329-336 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

小鼠下腔静脉完全阻断型血栓形成模型可用于多种品系及不同年龄的小鼠。该模型最适合体重至少为20克的小鼠。这一静脉血栓动物模型可使研究人员研究静脉壁与闭塞性静脉血栓之间的炎症相互作用。根据我们的经验，为在各组之间对血栓重量、静脉壁炎症细胞计数、静脉壁蛋白、静脉壁基因表达以及全血或血浆活性检测分析获得具有统计学意义的结果，每组需要10只或更多动物。

<table><tbody><tr><td>异氟烷气体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolene 7-0 缝线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 缝线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>皮肤粘合剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼用润滑膏</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nolvasan 溶液或抑菌溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MediCapture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2×2 纱布</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠器械灭菌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微外科器械</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腹部固定器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠下腔静脉血栓完全淤滞模型

Mouse Complete Stasis Model of Inferior Vena Cava Thrombosis

静脉血栓栓塞症（VTE）包括深静脉血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）。在美国，由于其高发病率和高死亡率，VTE已成为一个严重的公共卫生问题1-2。继心脏病和卒中之后，VTE是第三大常见血管疾病3。仅在美国，每年估计有90万人受到影响，其中约30万人死于该病3。因此，建立一种可靠的体内动物模型以研究该疾病的发病机制十分必要。
采用小鼠下腔静脉血栓完全淤滞模型具有多项优势。该小鼠模型可使用极小体积且来源有限的试验试剂，从而显著降低成本。尤为可期的是，利用基因敲除小鼠可明确特定炎症因子和凝血因子的功能。目前的分子检测技术可对血管壁、血栓、全血及血浆样本进行定量分析。然而，该模型的主要局限在于手术操作空间狭小以及血管脆性较高。此外，由于下腔静脉样本重量较小（平均0.005克），在进行组织、血栓及血液检测（如实时聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白质印迹法（western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶谱分析（zymography）、血管壁与血栓细胞分析，以及全血和血浆检测）时，需增加动物数量以确保统计分析的准确性4-8。
静止模型的主要缺点是缺乏血流，这会抑制施用的全身治疗药物对血栓和静脉壁的最大作用效果。

小鼠下腔静脉完全阻断型血栓形成模型可产生可量化的静脉壁组织和血栓。该模型已证实可用于评估静脉壁与阻塞性血栓之间的相互作用，以及急性向慢性炎症转变的过程。

静脉血栓栓塞症（VTE）包括深静脉血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）。在美国（U.S.），其高发病率和……

该操作的总体目标是结扎下腔静脉（IVC），造成完全性血流停滞，从而形成血栓，以研究血栓形成及溶解过程。首先通过腹侧正中切口暴露下腔静脉，随后定位所有背部和侧支引流血管，并对其进行电灼或结扎。然后在肾静脉下方将下腔静脉与主动脉分离并结扎。最后，在不同时间点取下腔静脉及血栓进行分子学评估。最终可获得结果显示，血栓负荷程度可持续至第6天。为了研究基因敲除小鼠，我们实验室建立了下腔静脉结扎的小鼠模型。由于该手术方案需要显微外科技术，学习操作步骤较为困难，因此对该手术模型进行直观演示至关重要。首先，将动物置于麻醉诱导室中进行术前麻醉，使用5%异氟烷和100%氧气，流速为0.5升/分钟。将动物从舱室中取出，使其仰卧，使用电动剪刀剃除腹部腹侧的毛发。接着，称量动物的体重。然后，用无菌眼膏润滑眼睛。在异氟烷和氧气全身麻醉下，将动物仰卧置于温水加热垫上。用氯己定溶液喷洒腹部，并用无菌纱布擦拭。对腹部进行消毒，直至手术区域清洁，以开始手术。使用虹膜剪，在皮肤和腹壁上做腹侧正中切口，用生理盐水浸湿的无菌纱布暴露腹腔。将动物的肠管推向左侧。使用小鼠固定器暴露下腔静脉（IVC）。从这一步开始直至手术结束，使用2%异氟烷和100%氧气维持麻醉，流速为0.2升/分钟。使用无菌棉签和超细虹膜组织镊，钝性分离腹膜筋膜以暴露下腔静脉（IVC）及其所有分支。首先电凝从肾静脉至髂总动脉分叉处的所有下腔静脉后侧分支。然后使用7-0无反应性聚丙烯缝线结扎侧支。在肾静脉稍下方将下腔静脉与主动脉分离。使用7-0号聚丙烯缝线结扎下腔静脉。使用5-0号薇乔合成缝线缝合腹壁。然后涂抹皮肤粘合剂以闭合皮肤。将动物置于加热灯下的恢复笼中进行监测，然后将其送回原始饲养单元。该分析比较了对照组小鼠与在安乐死时已完成下腔静脉结扎及血栓形成的动物。在第2天或第6天，取出下腔静脉血栓及其相关血管壁并称重。血栓重量的测量可使研究者记录血栓形成程度及其随时间的溶解情况。它是与内皮细胞活化相关的炎症事件的指标。该测量结果还可有效反映治疗药物在减轻炎症及静脉壁血栓量方面的效果。此处，下腔静脉连同主动脉一并被切除。将石蜡包埋的组织切片置于载玻片上，并用苏木精和伊红染色。该图展示了对照组与实验组小鼠组织中多形核细胞（PMNs）的数量。通过检测静脉壁炎症细胞的数量，可用于记录在存在静脉血栓的正常动物中，静脉壁从急性到慢性炎症反应的自然过程；在急性期（第2天），炎症反应应以中性粒细胞为主。如图所示，若无感染发生，在第二日后，静脉壁中性粒细胞数量应减少。在我们的小鼠静脉血栓模型中，此处比较了静脉壁单核细胞的数量。更缓慢进展的亚急性和慢性静脉壁炎症反应将表现出增强。静脉壁中的单核细胞群会分泌蛋白水解酶，这些酶已被证实可促进静脉血栓的自然溶解。随着时间推移，若无感染存在，通过本视频，您现在应已充分了解如何开展我们的下腔静脉结扎模型实验。该模型非常适合研究血栓形成以及血栓随时间的消退过程。

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鼠标完成血瘀模型的下腔静脉血栓

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