使用荧光标记的 C. elegans 菌株进行高通量筛选与生物传感

本视频展示了一种培养和分配荧光标记的秀丽隐杆线虫（CL gans）品系的方法，用于化学文库的高通量筛选或环境污染物的检测，以评估化学物质或环境因子对特定蛋白质活性的影响。在CL elgan实验中，首先制备用作线虫食物的细菌培养物，并转入表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因线虫。随后培养同步化的线虫。

收集0.5至200万条线虫，洗涤后分装到3个84孔微孔板中，然后向线虫中加入化学文库中的小分子或水、食物或土壤等测试样品。最后，使用微孔板读数仪测量线虫的荧光强度。

对荧光强度的数据分析可揭示能够调节可诱导转录通路的小分子，或用于检测环境污染物。与现有的体外和基于细胞培养的检测方法相比，该技术的主要优势在于可避免在体内具有毒性或无活性的化合物上浪费时间。这种高通量方法有助于鉴定能够调节多种可诱导通路的小分子。

尽管我们开发此方法主要用于小分子文库的高通量筛选，但它也可应用于食品和环境样品中污染物的生物传感检测。本实验操作将由本实验室的技术员 Andrew Dine 和博士后 Q long 演示。请提前制备细菌蠕虫食物。

首先，在500毫升的 terrific broth 中加入5毫升饱和的 e coli. OP 50 菌液，并补充50微克/毫升的链霉素。将培养物置于摇床中，在37摄氏度下振荡培养过夜。

第二天，将培养物分装到10个50毫升离心管中。然后将离心管放入冷藏离心机，以2,500 RCF离心20分钟。离心结束后，将每份细菌沉淀重悬于10毫升液体线虫生长培养基（NGM）中。

将悬浮液水平振荡。使用台式振荡器振荡15分钟，以重新悬浮细菌。随后，在4°C条件下，以2,500 RCF离心20分钟。

将NGM上清液倒出，称量细菌沉淀。然后加入与沉淀等体积的NGM缓冲液，通过涡旋振荡重悬菌体沉淀。最后，将重悬后的细菌培养物每份3毫升分装至15毫升离心管中，于-20摄氏度保存，直至后续实验使用。

在本实验中，将以诱导应激的Xeno Duke贷款对转录因子Sskn-1的影响为例进行测定。已知Sskn-1在氧化应激和异生物质应激条件下可激活细胞保护性基因。准备大规模培养携带两种荧光构建体的Trenchgenic c gans品系VP596。

VP 5 96 线虫表达 GST 四启动子驱动的 GFP，用于监测转录因子 Sskn 1 的活性，以及 DOP 三启动子驱动的 RFP，后者用作线虫数量归一化的标准。

DOP-3 是多巴胺受体的启动子，在全身的神经元中组成型表达。在本示例中，由于异源化合物强烈激活 sskn-1 并增加从 GST-4 启动子表达的 GFP 量，因此在准备培养物时，首先将 150 毫升 NNGM 缓冲液、1.5 毫升 LB、150 微升 1 摩尔胆固醇以及 75 微升 100 毫克/毫升链霉素混合。添加 LB 有助于防止线虫粘附在玻璃器皿和塑料器皿上，但该用量不足以支持细菌生长。

过滤混合物以达到灭菌目的，然后将其转移至无菌的一升烧瓶中，并将烧瓶放置一旁，以释放GR成虫中的卵。通过离心去除虫体上的细菌，并更换NGM培养基，直至上清液变澄清。再次用无菌水重悬虫体，进行第二次洗涤，随后离心。

去除上清液，向离心管中加入 3.75 毫升无菌水。加入 1 毫升家用漂白剂和 250 微升 10 N 氢氧化钠，立即上下颠倒混匀 5 至 6 次。在蠕虫接触漂白剂处理 4 分钟后，将离心管置于旋转仪上。

将试管置于体视显微镜下。大多数成虫应已死亡。剧烈振荡试管15至20次，以帮助清除裂解发生后残留的任何成虫，总时长为五分钟，然后加入无菌水直至试管充满。

轻轻翻转混匀5到6次，以收集虫卵。在500 RCF条件下离心管体1分钟。用Resus液洗涤虫卵三次，每次加入10毫升无菌水，涡旋振荡，离心后弃去上清液。

接下来，通过加入10毫升NGM缓冲液，将100微升的卵样品稀释100倍。然后在显微镜下，用移液器将三份各5微升的等分试样点样到培养皿盖上。分别计数三个5微升等分试样中的卵数。

为了估算卵子总数，将200,000至200万个卵加入含有NGM缓冲液的锥形瓶中，并在20摄氏度下以100 RPM的速度振荡培养。卵加入锥形瓶后至少16小时，使用无菌刻度移液管取出约0.5毫升悬浮的线虫培养液。

用移液器吸取三滴5 µL液体，滴加到无菌培养皿盖上。将皿盖放入-20 °C冰箱中冷冻1至2分钟，以使线虫麻痹。待线虫麻痹后，使用体视显微镜计数每5 µL中孵化的活体线虫平均数量，以估算总数。

将之前制备的冷冻OP 50菌种置于实验台放置几分钟，使其解冻。然后每50万条孵化的线虫加入3毫升50%的OP 50。在20°C下以100 RPM的转速振荡培养瓶。

线虫将在约51小时内发育至L4幼虫及年轻成虫阶段。通过肉眼观察，在培养期间监测细菌量。若培养基变澄清，则需添加更多细菌。

使用无菌的血清学移液管将约 0.5 毫升悬浮的线虫培养物转移至标准 NGM 琼脂平板。在体视显微镜下观察线虫，确保在明场显微镜下大多数为 L4 幼虫和年轻成虫；L4 幼虫体中部腹侧具有一透明区域。年轻成虫体型稍大，无透明区域。

接下来，将线虫培养物转移至无菌的50毫升离心管中。将离心管置于生物安全柜内的试管架上，静置以沉淀未孵化的虫卵或未发育的线虫。这些未发育的线虫沉降速度较已发育的线虫更慢。

10分钟后，吸除上清液，其中含有未孵化和未发育的线虫，每管沉淀物中加入约10毫升NGM缓冲液，轻轻旋转试管以重悬线虫。将所有线虫收集至一个50毫升离心管中。在摆动桶离心机中以500 RCF离心30秒。

然后将线虫重悬于50毫升含1% LB的NGM中以洗涤线虫。重复此步骤，洗涤三至四次，以彻底去除细菌。用NGM加LB缓冲液将离心管补至50毫升。

将此溶液倒入含有搅拌子的定制线虫分配烧瓶中，并将其置于搅拌台上。至少需要约 20 毫升或 60,000 条线虫，以填充分配烧瓶和分配盒中的死体积。按照之前所示方法，计数三个 5 微升液滴中的线虫数量。

计数后，在NGM平板上加入LB培养基，每5微升液滴中含有12至15条线虫，每个384孔板大约需要35,000条线虫或11.5毫升悬浮的线虫。将一个10微升分配盒装入分配器中，并用70%乙醇预润洗进行灭菌。随后用无菌水预润洗以冲洗掉乙醇。

将分配盒的末端插入烧瓶中，使其刚好位于搅拌子上方且不干扰其转动。确保线虫在整个烧瓶中保持悬浮状态。将分配器程序设置为低速分配，预脉冲两次，引注并运行，至少分配10毫升悬浮的线虫。

迅速向微孔板中加样，微孔板中应已含有待测化合物，以防止线虫在管路中沉降。此处微孔板上预先加入的待测化合物为 Glow。使用透气封板膜密封微孔板，以防止灰尘落入孔中。

将平板置于恒温培养箱内的摇床上，在适合该实验的温度下进行培养。切勿叠放平板，以免阻碍空气流通。将目标平板放入微孔板读板仪中，使用适当的发射波长和激发波长测定每孔的荧光强度。

用于GFP的滤光片激发波长为485，发射波长为528。RFP的滤光片激发波长为540，发射波长为590。读板后，计算GFP与RFP的比值，并以不含激活化合物的对照孔读数进行归一化，以确定不同处理组荧光强度的准确倍数差异。

此处展示的SSKN单次检测使用了染色体整合的双报告系统，在该品系中，通过体视显微镜手动计数线虫。线虫数量与分配体积呈良好相关性，R²值为0.94，p值小于0.0001。这表明，可通过调节分配体积来控制每个孔中分配的线虫数量。

在这些图中，3个96孔板中每个孔的总GFP荧光（左侧所示）和每个孔的RFP荧光（右侧所示）在各孔之间具有高度可重复性。XS表示在每个孔中测得的相对荧光强度。实线表示均值，虚线表示均值上下三个标准差的范围，所有孔的变异系数均低于9%。如本图所示，在3个96孔板共288个孔中，GST四启动子驱动的GFP荧光与DOP三启动子驱动的RFP荧光呈线性相关，R平方值为0.62，p值小于0.0001。

因此，非诱导型RFP报告基因可用于标准化诱导型GFP报告基因。当表达GFP与RFP荧光的比值时，在3个96孔板的不同孔之间具有高度可重复性。

计算GFP与RFP的比值使变异系数降低至6%以下，表明DOP三启动子RFP报告系统具有降低变异性的能力，如本图所示。在SK N1激活型异生物质作用下，GFP相对于RFP的诱导效应在3个96孔板中均表现出强效且高度可重复的结果，所有对照组和dlo孔的平均相对荧光比值以实线标出。对照组均值上方三个标准差及dlo组均值下方三个标准差以虚线标出。

一旦掌握，建立线虫培养物在第一天大约需要一小时进行起始操作，以及后续的收集与分装。若操作得当，处理线虫大约需要两小时。在进行该操作时，重要的是要记住起始时至少使用 60,000 条线虫，并在分装过程中始终保持其悬浮状态。在完成该流程后，可参照此方法开展其他筛选实验，例如针对其他可诱导通路的报告基因检测，从而开发针对其他通路的调节剂。

该技术可为高通量筛选和生物传感领域的研究人员提供新途径，以快速鉴定小分子信号通路调节剂或检测环境污染物。观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养、分装和检测荧光秀丽隐杆线虫品系，用于可诱导转录通路的高通量筛选，或对多个样本进行环境污染物检测。