高通量筛选和生物传感与荧光 C。线虫菌株

本视频演示了一种培养和分配 CL gans 荧光菌株的方法，用于化学库的高通量筛选或环境污染物检测，以评估化学或环境试剂对特定蛋白质活性的影响。在 CL elgan 中，首先制备细菌培养物作为蠕虫和 GFP 转基因的食物。培养同步蠕虫。

然后收集 0.5 至 200 万条蠕虫，洗涤并分配到 3 84 中。将微量滴定板孔板，然后将化学库中的小分子或测试样品（如水、食物或土壤）添加到蠕虫中。最后，用酶标仪测量蠕虫的荧光。

荧光强度的数据分析揭示了调节可诱导转录途径或允许检测环境污染物的小分子。与现有方法（如基于体外和细胞培养的分析）相比，该技术的主要优点是不会将时间浪费在体内有毒或无活性的化合物上。这种高通量方法可以帮助鉴定调节不同诱导途径的小分子。

虽然我们开发了这种方法用于小分子文库的高通量筛选，但它也可以应用于食品和环境样品中污染物的生物传感。演示该程序的是 Andrew Dine，他是我实验室的技术人员，Q long 是我实验室的博士后。提前准备细菌蠕虫食物。

首先接种 500 毫升极好的肉汤，每毫升补充 50 微克链霉素和 5 毫升饱和大肠杆菌。OP 50.将培养物放在摇床上，在 37 摄氏度下生长过夜。

第二天，将培养物分成 10 个 50 毫升试管。然后将试管放入冷冻离心机中，以 2， 500 RCF 离心 20 分钟。离心 Resus 后，将每个细菌沉淀悬浮在 10 毫升液体线虫生长培养基或 NGM 中。

水平摇晃悬架。地板摇床 15 分钟以重悬细菌。接下来，将细菌培养物在 2， 500 RCF 和 4 摄氏度下离心 20 分钟。

倒出 NGM 并称量细菌沉淀。然后加入等体积的 NGM 缓冲液并通过涡旋重悬沉淀。最后，将 3 毫升重悬的细菌培养物分装到 15 毫升试管中，并储存在零下 20 摄氏度，直到需要为止。

在这个演示中，将作为示例测量应激诱导 Xeno Duke 贷款对转录因子 Sskn one 的影响。已知 Sskn one 在氧化和异种应激期间激活细胞保护基因。制备了携带两种荧光构建体的 Trenchgenic c gans 系 VP 5 96 的大规模培养物。

VP 5 96 蠕虫表达驱动 GFP 的 GST 四个启动子，GFP 用于监测转录因子的活性。Sskn 1 和 DOP 3 启动子驾驶。RFP 用作蠕虫编号规范化的标准。

DOP 3 是多巴胺受体的启动子，在全身的神经元中组成型表达。在实施例中，鉴于 xenobi lon 强烈激活 sskn 1 并增加从 GS T 4 启动子表达的 GFP 的量以制备培养物，首先混合 150 毫升 N NGM 缓冲液、1.5 毫升 LB 150、微升 1 摩尔胆固醇和 75 微升 100 毫克/毫升。链霉素。添加 LB 有助于防止蠕虫粘在玻璃器皿和塑料器皿上，但这个量不足以支持细菌生长。

过滤以对混合物进行消毒，然后将其转移到无菌的 1 升烧瓶中，并将烧瓶放在一边，以释放 GR 成虫的虫卵。通过离心蠕虫并更换 NGM 培养基直到旋毛澄清，从蠕虫中洗涤细菌。通过 Resus 第二次清洗蠕虫，在旋转后再次将它们悬浮在无菌水离心机中。

取出旋后液，用 3.75 毫升无菌水填充试管。加入 1 毫升家用漂白剂和 250 微升 10 正常氢氧化钠，立即倒置 5 至 6 次。将试管放入旋转器中，将蠕虫暴露在漂白剂中 4 分钟。

将试管置于立体显微镜下。大多数成年人应该是谎言。用力摇晃试管 15 到 20 次，以帮助在裂解后躺下任何残留的成虫，总共 5 分钟，加入无菌水直到试管装满。

置混合 5 到 6 次以收集鸡蛋。将试管在 500 RCF 下离心 1 分钟。用 Resus 清洗鸡蛋 3 次，在 10 毫升无菌水中弯曲，旋转并去除滑果。

接下来，通过添加 10 毫升 NGM 缓冲液将 100 微升鸡蛋样品稀释 100 倍。然后在显微镜下将三个 5 微升等分试样移液到培养皿盖上。计算三个单独的 5 微升等分试样中的鸡蛋数量。

估计鸡蛋的总数。向装有 NGM 缓冲液的培养瓶中加入 200， 000 至 200 万个鸡蛋，并在 20 摄氏度下以 100 RPM 摇动培养物。将虫卵加入培养瓶中至少 16 小时后，使用无菌血清移液管去除约 0.5 毫升悬浮的蠕虫培养物。

将 3 个 5 微升滴液移液到培养皿的无菌盖子上。将盖子放在零下 20 度的冰箱中 1 到 2 分钟，以便在蠕虫麻痹后麻痹蠕虫。用立体显微镜计算每 5 微升活孵化蠕虫的平均数量，以估计总数。

将之前制备的冷冻 OP 50 细菌培养物放在长凳上几分钟，解冻它。然后每 500， 000 个孵化的蠕虫添加 3 毫升 50% OP 50。在 20 摄氏度下以 100 RPM 的速度摇动培养瓶。

蠕虫将在大约 51 小时内发育成 L 四种幼虫和年轻成虫阶段。通过目视检查监测整个孵化过程中的细菌数量。如果介质变透明，请添加更多细菌。

使用无菌血清移液器将大约 0.5 毫升悬浮的蠕虫培养物转移到标准 NGM 琼脂平板上。用立体显微镜观察蠕虫，以确保大多数是 L 四幼虫和年轻成虫，在明场显微镜下，L 四幼虫在身体中间会有一个腹侧透明点。年轻人会稍大一些，并且不会有明显的斑点。

接下来，将蠕虫培养物拉入无菌 50 毫升试管中。将试管放在通风橱的试管架上，让它们沉淀未孵化的卵或未发育的蠕虫。比发达的蠕虫更慢。

10 分钟后，用大约 10 毫升的 NGM 缓冲液抽吸每个沉淀物，去除含有未孵化和未发育的蠕虫的螺旋体，然后轻轻旋转试管使蠕虫悬浮。将所有蠕虫收集到一个 50 毫升的试管中。在 500 RCF 的水平吊篮离心机中旋转 30 秒。

然后将蠕虫重悬于 50 毫升含 1%lb 的 NGM 中清洗。重复此作，洗涤三到四次以去除洗涤后的细菌。用 NGM 加 LB 缓冲液填充试管至 50 毫升。

将其倒入搅拌棒处的定制蠕虫分配瓶中，然后将其放在搅拌板上。至少需要大约 20 毫升或 60， 000 条蠕虫来填充分液瓶和分液器盒的死腔。如前所述，以 3 个 5 微升滴数计算蠕虫的数量。

在 NGM 加 LB 计数至浓度为每 5 微升滴 12 至 15 条蠕虫后，每个 3 84 孔板需要约 35， 000 条蠕虫或 11.5 毫升悬浮蠕虫。将 10 μL 分液盒装入分液器中，并用 70% 乙醇灌注对其进行消毒。用无菌水灌注冲洗乙醇。

将分液盒的末端插入烧瓶中，使其刚好位于搅拌棒上方，而不会中断其移动。确保蠕虫在整个培养瓶中保持悬浮状态。对分配器进行编程，使其以低速分配蠕虫，使用两个预脉冲灌注并运行至少 10 毫升的悬浮蠕虫。

填充微量滴定板，微量滴定板应已快速包含测试化合物，以防止蠕虫沉淀在管道中。此时，先前加载到微量滴定板上的测试化合物到期。发亮。用透气胶带密封板，以防止灰尘聚集在孔中。

将板放在培养箱中的振荡平台上，在适当的温度下进行检测。不要堆叠板，因为这会限制空气流动。将目标板放入酶标仪中，以在此处使用适当的发射和激发波长测量每个孔的荧光强度。

用于 GFP 的滤光片在 4 85 处激发，在 5 28 处发射。RFP 的滤波器是 5 40 的激发和 5 90 的发射。读取板后，计算 GFP 与 RFP 的比率，并使用不含激活化合物的对照孔的读数进行标准化，以确定来自单个处理的荧光强度的确切倍数差异。

此处显示的 SSKN one 检测使用染色体整合的双重报告，这是用立体显微镜手动计数蠕虫时的菌株。蠕虫的数量与分配的体积相关，R 平方值为 0.94，p 值小于 0.0001。这表明可以通过调整分配的体积来控制分配到每个孔中的蠕虫数量。

在这些图中，左图所示的每孔总 GFP 荧光和右图所示的每孔 RFP 荧光在 3 84 孔板中从孔到孔具有高度可重复性。XS 表示在每个孔中测得的相对荧光。实线表示平均值，虚线表示高于或低于所有孔的平均荧光的三个标准差的变异系数低于 9%如图所示，来自 GST 四个启动子的 GFP 荧光与来自 3 84 个孔中来自 DOP 三个启动子的 RFP 荧光呈线性相关，R 平方值为 0.62，p 值小于 0.0001。

因此，非诱导型 RFP 报告基因可用于归一化诱导型。GFP 报告员。当表达 GFP 与 RFP 的比率时，荧光在 3 84 孔板中从孔到孔变得高度可重现。

计算 GFP 与 RFP 的比率将变异系数降低到 6% 以下，证明了 DOP 三个启动子 RFP 报告基因降低变异性的能力，如下所示。相对于 RFP 的 SK N 一激活异种生物的 GFP 诱导在 3 84 孔板上是稳健且高度可重现的，所有对照和由于 GLO 孔的平均相对荧光比用实线标记。高于对照均值和低于 dlo 均值的三个标准差用虚线标记。

一旦掌握，就可以在第一天大约一小时开始蠕虫培养，然后收集和分配。如果作得当，蠕虫可以完成大约两个小时。虽然尝试此过程很重要，但请记住从至少 60， 000 条蠕虫开始，并在分配时保持悬浮状态，按照此程序筛选其他，例如，可以执行其他诱导途径的报告字符串，以便开发其他途径的调节剂 在其开发后。

该技术可以为高通量筛选和生物传感领域的研究人员快速识别小分子途径调节剂或检测环境污染物铺平道路。观看本视频后，您应该对如何培养、分配和测量荧光秀丽隐杆线菌菌株有很好的了解，以便在可诱导的转录途径或检测多个样品的环境污染物时进行高通量筛选。