Name: Vibrodissociation从啮齿动物脑切片的神经元，研究突触传递和图像突触前的码头 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习振动分离技术从啮齿动物脑切片中分离神经元，保留突触前末梢用于电生理记录和实时成像。该方法为突触传递和可塑性研究提供了出色的药理学控制和空间钳位条件。

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我们感谢朱品君博士和小山进博士在本技术最初建立过程中提供的帮助，感谢维罗尼卡·阿尔瓦雷斯博士在撰写稿件格式化方面提供的协助。本研究由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIAAA）内部临床与生物医学研究部门资助。

1. 准备火焰拉制的玻璃毛细管
 <ol>
 <li>使用微电极玻璃管，在Flaming-Brown型或同等性能的微电极拉制仪上拉制标准的膜片钳微电极（尖端直径约2 μm）。将微电极尖端置于本生灯火焰中约2秒，直至熔融形成直径为200–300 μm的球状封口。</li>
 <li>将火焰封口的膜片钳电极安装至微操纵器的电极夹持器上，该操纵器可通过压电双晶片、继电器或功能相当的装置实现快速横向振动（移动距离为100–200 μm）。</li>
 </ol>
2. 准备出生后1至21天大鼠或小鼠的脑切片
 <ol>
 <li>配制人工脑脊液（aCSF），其成分为（单位：mM）：124 NaCl、4.5 KCl、1.2 NaH2PO4、26 NaHCO3 和 10 D-葡萄糖。用 95% 氧气 / 5% CO2 气体混合物通气约 15 分钟，然后加入 2 mM CaCl2 和 1 mM MgCl2。</li>
 <li>脑切片制备：
 <ol>
 <li>使用氟烷或异氟烷麻醉动物，断头取脑，并将脑组织按所需方向（冠状面、旁矢状面、横断面等）进行修块，确保包含目标脑区。</li>
 <li>将修好的脑组织固定在浸没于 aCSF 中的振动切片机载物台上，切成 250–400 μm 厚的脑片，随后将切片转移至充满碳合气（carbogen）并持续通气的 aCSF 中，在网状支架上的“预孵育”室中孵育，确保切片各表面均可接触液体和气体。让切片在此环境中平衡至少一小时。</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
3. 振动解离
 <ol>
 <li>用以下成分（单位：mM）的 HEPES 缓冲盐溶液填充直径为 35 mm 的培养皿：150 NaCl、5 KCl、10 HEPES、1 MgCl2、2.5 CaCl2、10 D-葡萄糖，用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并用蔗糖将渗透压调节至约 300 mOsM。培养皿可选用悬浮培养皿、标准细胞培养皿、带玻璃盖玻片插件的培养皿，或涂有如聚-L-赖氨酸等物质的培养皿，具体选择取决于细胞对皿底黏附力的需求。</li>
 <li>将脑片置于培养皿中，使用体视显微镜在 250 倍下观察。用一根弯曲的铂丝（直径 0.5 mm）压在脑片上表面作为重物，使脑片固定于皿底。</li>
 <li>将火焰拉制的微电极尖端置于脑片表面的目标脑区。启动显微操作器，使尖端以 10–30 Hz 的频率进行横向振动，振幅距离约为 100 μm。通过显微操作器将尖端逐渐深入脑片组织，使其在约 30 秒内穿透整个脑片。根据需要重复此步骤，以最大限度地增加从特定脑区获得的分离神经元数量。</li>
 <li>将微电极尖端从脑片中移出——用镊子夹起脑片并在溶液中轻轻晃动——然后完全移除并弃去脑片。</li>
 <li>让解离的细胞沉降并贴附于培养皿底部，至少静置 10 分钟。</li>
 </ol>
4. 电生理记录
 <ol>
 <li>将含有神经元的培养皿置于倒置显微镜载物台上，使用10倍至63倍物镜进行观察。选择细胞膜光滑完整、无起泡现象、细胞核清晰可见但不过大的神经元。若使用相差光学系统，应选择呈相位明亮、略带黄褐色而非过蓝的神经元。用含有适当盐类、营养物质、受体拮抗剂等的细胞外液对细胞进行灌流（我们通常采用上述第3.1节所述的HEPES缓冲盐溶液），并常添加5 μM 2,3-二氧代-6-硝基-1,2,3,4-四氢苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺二钠（NBQX）和25–100 μM D-2-氨基-5-磷酸戊酸（AP5），以阻断离子型谷氨酸受体，从而分离出由GABAA受体介导的快速抑制性突触后电流（IPSCs）1,2。</li>
 <li>使用Flaming-Brown型或同类拉制仪制备标准的膜片钳玻璃微电极。当电极内充以基于Cl-的灌注液时，其尖端电阻应为2–4 MΩ（根据目标细胞大小而定）。</li>
 <li>采用标准的电生理技术，对已识别的神经元建立全细胞记录模式。</li>
 <li>采用无间隙数据采集程序记录自发性突触后电流（sPSCs）。加入0.2–1 μM河豚毒素和/或低Ca2+细胞外液，以记录微型突触后电流（mPSCs）。</li>
 <li>溶液和药理学试剂可直接施加于细胞。我们采用由熔融方口玻璃管构成的局部快速灌流系统，通过安装在步进电机驱动的微操纵器上的管道进行横向移动实现溶液切换。该方法可在数十至数百毫秒内完成溶液交换，实现细胞外分子环境的快速改变或受体激动剂的快速施加等操作。</li>
 <li>Akaike及其同事已开发出刺激单个突触前末梢的技术3,4。将微电极置于可视化的突触末梢附近，施加电刺激（负向电流5–10 μA，持续时间0.1–0.2 ms），记录单个单位的抑制性突触后电流（IPSCs），并可采用“失效率分析”等方法评估突触前和突触后功能的变化。</li>
 </ol>
5. 突触前终末成像
 <ol>
 <li>可通过膜片钳电极将多种染料注入突触后神经元。此外，也可使用在特定细胞群体中表达荧光蛋白（FP）（如绿色荧光蛋白GFP）的小鼠制备神经元。</li>
 <li>可在来源于在特定中间神经元群体中表达荧光蛋白（FP）的小鼠的振动解离神经元上观察到突触前终末。例如，由谷氨酸脱羧酶65（GAD65）启动子驱动表达GFP的小鼠，其海马区篮状细胞及其他中间神经元的胞体和突起均呈绿色。从海马CA1区振动解离得到的锥体神经元，其胞体和近端树突上可见GFP阳性轴突终末附着（图1A）。从在Thy1启动子调控下表达突触pHluorin（一种与突触小泡相关蛋白VAMP2融合的pH敏感型GFP突变体）的小鼠中振动解离得到的锥体神经元，也具有FP阳性的附着小结，并表现出pH敏感性荧光（图1B）。</li>
 <li>可使用AM酯化化合物将钙离子指示剂染料及其他荧光分子加载至突触前小结5。图2展示了使用钙指示剂染料Fluo4-AM进行加载的示例。首先，在37°C条件下将1–2 μM的AM酯化染料施加于神经元，持续10分钟。染料可穿透进入细胞内环境，在细胞内酯酶的作用下裂解该分子，释放出游离的、不能透过细胞膜且未被淬灭的染料。该方法可同时标记突触前和突触后细胞结构。加载完成后，用HEPES缓冲盐溶液洗涤细胞，并在37°C下继续孵育10分钟。在使用玻璃微电极形成吉欧姆（GΩ）封接之前，需用外部缓冲液冲洗细胞3次。</li>
 <li>随后使用不含染料的细胞内溶液建立全细胞记录模式。记录2–5分钟后，染料基本从突触后神经元中清除，从而可清晰观察到加载了Fluo-4的突触小结。该技术由Ye等5首次建立。</li>
 <li>可利用高倍率、高数值孔径物镜，结合基于相机或双光子显微镜系统对染料标记的小结进行成像。如图3所示的实验装置可实现同步的全细胞记录与钙成像。图2C所示的神经元及小结图像采用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机采集。激发光源的光强通过中性密度1.0滤光片衰减至1.2%，并通过虹膜滤光片调节至12%输出。可实时观察并记录绿色突触前小结中的钙瞬变信号，并在事后进行定量分析。</li>
 </ol>
6. 代表性结果：
振动解离神经元的自发性及电流注入诱发的放电活动
图4A展示了从典型的振动解离海马CA1区锥体神经元记录到的电活动。自发的超射动作电位可在从大鼠基底外侧杏仁核、海马和腹侧被盖区解离得到的锥体神经元中观察到1,5。在对CA1区锥体神经元进行电流钳记录期间，施加超极化电流可产生典型的电压反应，而施加足够强度的去极化电流则会引发超射动作电位：在中等电流水平下表现为典型的延迟放电模式，在较强电流刺激下则表现为不适应性动作电位（图4B）。
振动解离神经元中自发性和微小GABA能抑制性突触后电流
使用基于CsCl的细胞内溶液进行电压钳记录时，可观察到自发性突触电流（图5A）。这些事件在低钙溶液中消失2,6，且在大多数神经元类型中可被GABAA受体拮抗剂（如荷包牡丹碱或加巴青）完全阻断（图5B、C），表明这些是由GABA释放并激活该离子型受体亚型所介导的自发性抑制性突触电流（sIPSCs）。然而，在来自基底外侧杏仁核2和腹侧被盖区5,7等脑区的主要神经元中，阻断GABAA受体后会暴露出由谷氨酸激活AMPA型受体所介导的持续时间较短的兴奋性突触电流（EPSCs）。有趣的是，应用河豚毒素（TTX）至仅特异性阻断最敏感的电压门控钠通道的浓度时，可降低从多个脑区分离的振动解离神经元中所观察到的sIPSC的频率和幅度（图6A）2,4,7。因此，钠通道活性参与了断离的突触末梢中GABA的释放。目前尚不清楚这些末梢中是否会发生完整的钠动作电位。值得注意的是，一个封闭良好的直径为1 μm的轴突末梢的输入电阻可能高达GΩ范围。因此，即使少量钠通道开放也可能足以使末梢去极化，从而激活介导兴奋-分泌耦联的钙通道。关于这些钙通道，有证据表明，在海马CA1区及其他部位的振动解离制备中，N型和P/Q型钙通道参与了GABA能末梢的递质释放8。
已利用振动解离神经元研究了多种神经递质和受体对突触传递的调节作用及可塑性3,4,9。已被证实具有此类调节作用的神经递质包括腺苷、γ-氨基丁酸（GABA）、5-羟色胺、内源性大麻素等2,6,10,11,12。此外，在该制备方法获得的神经元中也观察到了短期突触可塑性现象，例如依赖内源性大麻素的去极化诱导抑制性突触传递抑制（DSI）2,11。这些发现表明，振动解离神经元制备物中保留了多种由内源性神经调质介导的受体依赖性和跨突触信号传导功能。
振动解离制备中轴突末梢的钙瞬变与囊泡释放
使用上述配备EMCCD的倒置显微镜，我们检测了振动解离获得的神经元-突触小体制备样本中突触前末梢的钙瞬变。图2显示了AM酯化Fluo-4在细胞中的负载以及海马CA1区锥体神经元中突触后染料的稀释现象。在图6B所示的兴趣区域（ROIs）中，部分染料填充的突触小体可观察到自发性钙瞬变。应用1 μM河豚毒素（TTX）后，这些自发性瞬变消失，表明这些钙瞬变由突触小体中自发激活的电压门控钠电流介导，进而引发钙浓度上升。通过快速溶液交换将细胞外KCl浓度从10 mM升高至40 mM，可导致对应于突触前末梢的兴趣区域（ROIs）荧光强度增加（图7A）。同时对突触后神经元进行记录，用于监测自发性抑制性突触电流（sIPSCs），并确定高K+去极化是否增加事件频率（图7B）。
为了观察突触前末梢中的囊泡融合，我们使用了在Thy1启动子控制下表达突触pHluorin（synaptopHluorin）构建体的小鼠（标记为spH21小鼠）。突触pHluorin是一种分子构建体，其中ecliptic pHluorin（一种对pH敏感性增强的GFP突变体）12与囊泡相关膜蛋白（VAMP2）13相连。这种结构将pHluorin基序定位于囊泡腔内，在相对酸性的环境中荧光被淬灭。当囊泡发生融合时，该基序暴露于更接近中性的细胞外环境，导致对应于囊泡/突触前终末的荧光斑点出现荧光增强。对spH21小鼠的海马神经元进行振动解离后，可观察到大小和位置符合GABA能终末预期的荧光斑点（图8A）。施加含高K+的外部溶液可增加这些终末的荧光强度，而当使用将细胞外钙浓度降低至0.2 mM的外部溶液时，该效应被阻断（图8B）。因此，在神经元-末梢制备中，去极化诱导的荧光增强似乎反映了GABA能突触处的兴奋-分泌耦联过程。
在神经元-突触小结制备的轴突末梢中，测量突触前钙瞬变和囊泡融合的能力，使我们能够研究神经调质、滥用药物以及突触可塑性对兴奋-分泌耦联和胞吐/胞吞过程中突触前机制的影响。这些技术还可与其他分子工具和基因工程小鼠相结合，以研究特定蛋白质在突触前功能及其调节/可塑性中的作用。
<img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig1.jpg" alt="细胞中荧光蛋白的显微观察；荧光成像；比较分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 来自海马CA1区的振动解离神经元（A）GAD65小鼠的微分干涉差（DIC）图像与绿色荧光图像的合并图。合并DIC图像以清晰显示绿色末梢的位置（B）突触小泡蛋白荧光素（spH21）小鼠的荧光图像。比例尺 = 10 μm
<img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig2.jpg" alt="显微镜下的神经元细胞；显微注射装置；突触的荧光标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 钙离子指示剂加载步骤：（A）整个细胞加载AM酯化染料；（B）全细胞记录过程中染料被稀释；（C）终末区被识别为感兴趣区域（箭头所示）。
<img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig3.jpg" alt="用于数据分析的光学、电生理记录示意图，包含EMCCD和快速切换施加装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 在振动解离神经元的突触前末梢上进行全细胞记录与钙成像同步实验的示意图。EMCCD=电子倍增电荷耦合器件。
<img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig4.jpg" alt="显示神经元活动的电生理学图；包含电压-时间轨迹、峰电位模式。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 典型波形显示：（A）来自振动解离CA1神经元的自发动作电位，以及（B）在CA1神经元的电流钳记录中，膜电位对超极化和去极化电流注入的响应。
<img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig5.jpg" alt="膜片钳记录波形、抑制效应分析、加巴青与荷包牡丹碱的作用、电流随时间变化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. （A）CA1区锥体神经元自发性抑制性突触后电流（IPSCs）的代表性波形。（B-C）IPSCs可被加巴青（10 μM；B）或荷包牡丹碱（20 μM；C）阻断。
<img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig6.jpg" alt="电生理和荧光图显示神经元对1μM TTX处理的反应。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. TTX抑制自发性GABA能突触传递，并消除振动解离海马组织制备中的突触前钙瞬变。(A) 振动解离神经元在TTX给药前和给药期间的记录。注意sIPSCs频率和幅度的降低。(B) 在TTX给药前和给药期间，观察到Fluo-4标记的振动解离神经元突触前末梢中的钙瞬变。注意瞬变信号的完全消失。
<img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig7.jpg" alt="显示10 mM KCl对细胞活性影响的荧光强度与电流轨迹图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7. 钙离子指示剂成像与sIPSC全细胞记录同步显示高K+刺激的作用。(A) 用Fluo-4AM染料负载的突触前终扣随时间变化的荧光强度测量结果。(B) 在施加高K+期间，sIPSC频率和幅度同步增加。
<img src="/files/ftp_upload/2752/2752fig8.jpg" alt="荧光强度图、Ca²⁺离子浓度、细胞信号传导示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8. 海马CA1区spH21锥体神经元突触前末梢中依赖Ca2+的高K+反应。(A) 振动解离神经元的荧光图像。(B) 在含有正常细胞外Ca2+（2 mM Ca2+）的溶液中，施加高K+（由黑色条表示）引起荧光信号持续升高；而在低细胞外Ca2+（0.2 mM Ca2+）条件下未观察到荧光增强。图中数据已归一化至高K+处理前的荧光水平，并显示了3个突触末梢的平均反应。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

成功的振动解离要求脑片中含有健康的神经元，并且细胞外间隙具有足够的弹性，使神经元能够无毒性损伤地从脑片中释放出来。因此，该技术在出生后早期（P1-21）效果最佳，因为此时制备的脑片中胶质/间质成分较少，比成年动物脑片更有利于操作。然而，根据我们的经验，为提高脑片内神经元存活率而优化的切片制备方法可能反而不利于振动解离技术的效果。通常情况下，我们为进行in situ记录而制备脑片时，会使用冷的改良aCSF溶液，其中大部分细胞外Na+和Ca2+被蔗糖替代；但用于振动解离的脑片则可以直接在常规记录用aCSF溶液中制备（例如切片）。当我们准备用于记录脑片中单个神经元电活动的样本时，通常在切片完成后立即把脑片置于35°C的正常aCSF中，并在此温度下孵育30-60分钟，然后再移回室温。然而，用于振动解离的脑片在切片后应立即转移至室温。这些处理步骤可在振动解离后获得更高数量的健康神经元，原因可能是间质组织较为疏松，使神经元更容易通过振动从脑片中脱离。我们并未系统地考察所有切片制备条件，因为我们日常操作已能获得足够数量的神经元，满足当天的记录和成像实验需求。或许通过进一步调整，例如改变切片厚度或预孵育程序，还可进一步提高健康神经元的得率。曾尝试使用极轻微的蛋白酶处理，以期提高细胞产量并使该技术适用于较年长的动物，但即使非常温和的蛋白酶处理也 invariably 会破坏突触功能。因此，尽管蛋白酶联合机械解离的方法未来仍有可能奏效，但截至目前，在前脑神经元中尚未证明其可靠性。
还应注意，经过振动解离后健康神经元的得率相对较低，这意味着该技术主要用于研究数量较多的神经元亚型，主要是投射神经元。使用能够表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠模型，可轻松识别出较小的神经元亚群，从而增加了研究这些稀有神经元的可能性。然而，除非神经元的得率能够显著提高，否则针对这些神经元的数据积累可能仍然较为缓慢。
有多个步骤已被证实对于成功将钙离子感应染料载入神经元至关重要。AM酯化染料的孵育需在37°C下进行，我们曾尝试在较低温度下进行染料负载，但均未成功。染料浓度应根据负载时间和温度进行优化，因为较高浓度的染料负载似乎会降低突触前终末中的钙离子浓度。我们观察到，使用较高浓度染料负载会降低sIPSCs的频率和幅度。在将钙离子感应染料载入振动解离神经元的突触前终末时，必须格外小心，因为小的突触前终末的缓冲能力可能与胞体不同，且终末的大小并不一致。染料负载后，含有神经元的培养皿需用HEPES缓冲的外部溶液清洗，清洗后的恢复时间至关重要。此外，为了形成良好的全细胞记录封接，必须彻底清洗细胞，以去除细胞膜外未被内化的染料分子。
 除了将振动解离神经元用于电生理学和活细胞成像外，免疫细胞化学技术也可应用于这些细胞11,12。这些细胞易于固定，并可用多种抗体及其他细胞标志物进行染色。使用此类细胞可获得清晰的样本，便于观察GABA能突触前终末中的蛋白质表达。利用在GABA能神经元特异性启动子调控下表达荧光蛋白的小鼠，研究者可在振动解离制备样本中识别单个突触终末（图1）。通过激光扫描显微镜以及STED（受激发射损耗显微镜）等新型技术，对这类荧光标记物的成像可实现对终末形态的定量测量。此外，该制备方法也适用于使用报告突触囊泡循环的染料进行可视化观察。Akaike及其同事曾使用苯乙烯染料FM1-43标记GABA能终末，以在活细胞中观察终末结构4。
 也可通过单细胞逆转录酶PCR来分析振动解离神经元中的RNA表达。该技术通常应用于酶解离的神经元以及细胞培养中生长的神经元。

<table><tbody><tr><td>振动组织切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿（35 mm）</td><td>BD 生物科学</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>Willco-dish</td><td>GWSB-5040 或 GWSB-3522</td><td>成像用玻璃厚度为0.16–0.19 mm</td></tr><tr><td>压电&amp;#8211;电控操作器</td><td>EXFO</td><td>LSS-3000</td><td>也可使用继电器等。</td></tr><tr><td>SD9 方波脉冲刺激器</td><td>草本科技</td><td>SD9K</td><td>用于触发压电元件&amp;#8211;电控操作器</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>TYP 374590</td><td>也可使用任意体视显微镜</td></tr><tr><td>弗拉明/布朗微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW-150F-4</td><td>用于火焰拉制的玻璃微电极和膜片钳微电极</td></tr><tr><td>六通道灌注阀控制系统</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 或 VC-6M</td><td></td></tr><tr><td>灌流快速步骤</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>配备20-63倍物镜的倒置显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>TS200 Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 相机</td><td>Andor</td><td>iXon&lt;sup&gt;电子显微镜&lt;/sup&gt;+ DU-888</td><td></td></tr><tr><td>激发荧光照明光源 </td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120PC</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM 钙离子荧光探针</td><td>分子探针，Life Technologies</td><td>F14201</td><td></td></tr></tbody></table>

从啮齿类动物脑片中振动解离神经元以研究突触传递和成像突触前终末

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

从中枢神经系统中进行机械解离神经元的优点在于，突触前末梢仍可附着在所分离的目标神经元上。这使得可以在对外部环境和突触后胞内环境进行良好控制的条件下研究突触传递。一种基于振动且不使用蛋白酶的技术，称为振动解离法（vibrodissociation），是目前最常用的机械分离技术。将尖端经火焰抛光成小球状的微电极插入由出生后1至21天（P1-P21）啮齿类动物制备的脑片中，微电极在平行于脑片表面的方向振动并逐渐穿过脑片厚度，从而释放出单个分离的神经元。这些分离的神经元在振动解离后数分钟内即可用于实验研究。与原代神经元培养、脑片以及酶解法分离神经元相比，该技术具有多项优势：能够快速获得存活且相对成熟的神经元，适用于电生理和成像研究；可精确控制细胞外环境，避免邻近细胞的干扰；适用于通过快速给药和全细胞灌流实现严格控制的药理学实验；在全细胞记录中，相较于脑片或细胞培养中的神经元，具有更优的空间钳制效果。该制备方法可用于研究突触的生理学、药理学、调制机制及可塑性。利用振动解离获得的神经元，还可对活细胞及其突触前和突触后结构进行实时成像。此外，也可结合免疫学方法和基于成像的技术，对突触前和突触后结构的分子组成进行鉴定。

本报告展示了一种机械分离单个有活性神经元的技术，该神经元保留了附着的突触前末梢。经振动解离获得的神经元具有制备快速、药理学控制优良以及在无邻近细胞干扰的情况下改善空间钳制的优点。该方法可用于突触结构的成像及膜片钳记录。

中枢神经系统神经元的机械分离具有以下优势：突触前末梢仍可附着在分离出的神经元上……

以下实验的总体目标是分离出保留附着的断离突触棒状结构的神经元，从而在消除邻近细胞影响的同时实现药物学控制并改善空间钳制效果。该目标通过两个步骤实现：首先制备出生后第1至21天（P1至P21）大鼠或小鼠含有目标脑区的急性脑切片，随后从中分离单个神经元。将急性切片置于培养皿中，使用火焰抛光的玻璃微移液管在目标区域进行振动，并使移液管尖端在切片中移动，从而游离出单个神经元。让神经元有足够时间贴附到培养皿底部。随后，将含有纤维状解离神经元的培养皿转移至显微镜下，以检测突触的生理学、药理学、调制作用、可塑性，以及对活细胞中突触前和突触后结构进行实时成像与表征。通过紧密封接、全细胞记录和荧光显微镜技术，可获得显示突触反应的生理和药理特性以及突触前末梢单元功能相关变化的结果。该技术相较于现有方法（如脑片记录、培养神经元和酶解离神经元）的主要优势在于，附着的致密突触结构便于对突触前成分进行操控和可视化，而相对紧凑的突触后结构则有利于实现更优的电压钳制和对外部环境的精确控制。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为获得健康神经元的产量会因多种条件而发生显著变化，例如动物的年龄、振动参数以及脑片中目标区域的位置。此外，与传统切片相比，采用该方法进行细胞记录的持续时间较短。该方法的可视化演示至关重要，因为振动解离步骤难以掌握，准确描述在脑片中移动的距离和解离动作尤为困难。在准备制作脑片之前，需使用碳合气（carbogen）对人工脑脊液（aCSF）进行鼓泡处理15分钟。接着，向其中加入 2 毫摩尔的氯化钙和 1 毫摩尔的氯化镁。对出生后 1 至 21 天龄的动物进行麻醉并断头后，取出脑组织，然后按照所需方向切割，以包含目标区域。将分离出的脑组织固定于载物台上，并浸入盛有人工脑脊液（A CSF）的容器中。然后将脑组织固定在脑切片机上，使用振动刀片将脑组织切成每片厚度为250至400微米的切片。将切片置于人工脑脊液（A CSF）中，并在预孵育室中用碳合气（carbogen）持续通气至少一小时。制备火焰抛光的玻璃微电极时，首先使用火焰布朗（Flaming Brown）或同等型号的微电极拉制仪，将标准膜片钳微电极拉制成尖端直径为两微米的电极。将微量移液器尖端放入本生灯火焰中约两秒钟，以形成直径为200至300微米的熔融小球。接下来，将火焰密封的膜片钳移液器安装到显微操作器的持针器上，该持针器可使用压电双金属继电器或同等有效的装置进行快速左右振动，移动距离为100至200微米。准备足量的缓冲盐溶液。用氢氧化钠将溶液调节至 pH 7.4，并用蔗糖调节渗透压至约 300 毫渗透摩尔。然后用大量缓冲盐溶液填充一个直径为 35 毫米的培养皿。将组织切片放入培养皿中，使用解剖立体显微镜在 250 倍放大下配合弯头金属丝进行观察。将切片贴至培养皿底部以解离细胞。将火焰拉制的微移液管尖端置于切片表面。启动显微操作仪，使尖端以10至30赫兹的频率进行横向振动，振幅距离约为100微米。使用显微操作器将微量移液管尖端插入脑片，使其在30秒内贯穿整个脑片厚度。根据需要重复此步骤，以最大程度地增加分离神经元的数量。随后，将移液管尖端从脑片中移出。用镊子夹起切片，并在溶液中轻轻晃动。然后将切片完全从溶液中取出。让细胞沉降到培养皿底部，至少静置10分钟。将含有神经元的培养皿置于倒置显微镜的载物台上，使用10倍至63倍物镜观察神经元。选择细胞膜光滑、无起泡，细胞核清晰可见但不过大的神经元。若使用相差显微镜，应选择呈亮相差且略带黄绿色、而非过蓝的神经元。使用火焰抛光仪或同等设备拉制标准膜片微电极，使其尖端电阻为2至4兆欧。用基于氯化铯的细胞内液填充膜片电极，用于记录突触反应；或用基于氯化钾的细胞内液填充，用于记录固有膜特性及动作电位。采用标准电生理技术对神经元进行全细胞膜片钳记录。首先使用无间隙数据采集程序记录自发性突触后电流。接着，应用含有200纳摩尔河豚毒素和/或低钙的细胞外溶液，以记录微小突触后电流，从而改变细胞外分子成分。将待研究的药物分别装入熔接式方形玻璃管的其中一个腔室中，并将该玻璃管置于目标神经元附近。通过由步进电机驱动的显微操作器横向移动，单个储液槽可在10至100毫秒内向神经元暴露溶液。使用高数值孔径物镜，在基于相机或双光子显微镜下高倍观察下载的bns。图中所示为采用电子倍增电荷耦合器件相机捕获的神经元和bns图像。在电压钳记录期间，使用中性密度为1.0的滤光片将激发光源的功率衰减至1.2%，并通过虹膜滤光片调节至12%的输出。采用基于氯化铯的细胞内溶液，可观察到自发性突触电流，以可视化囊泡融合过程。在突触前棒状终末中，我们使用了在TH启动子控制下表达突触florin构建体的小鼠。突触花青素是一种分子构建体，其中具有增强pH敏感性的GFP突变体——双极花青素（ecliptic Florin）与囊泡相关膜蛋白相连，当囊泡融合时该结构被暴露于更中性的细胞外环境，导致对应于囊泡及突触前终末的荧光点出现荧光增强。在尝试该操作过程中，通过分离这些小鼠的海马神经元，可观察到符合GABA能终末大小与定位特征的荧光斑点。需要牢记的是，为了获得健康的神经元，必须确保拥有健康的脑片。因此，急性脑切片的制备是本实验流程中的关键步骤。在此步骤之后，还可进行其他方法，如免疫组织化学或单细胞逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），以回答进一步的问题，例如突触前钮扣或突触后神经元中表达了哪些蛋白质和mRNA种类。观看本视频后，您应能充分了解如何获取健康的分离神经元，并将其用于电生理学以及实时成像研究。

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神经科学

Vibrodissociation从啮齿动物脑切片的神经元，研究突触传递和图像突触前的码头

我们展示了如何使用基因枪将荧光染料（如 DiI）导入不同年龄的啮齿类动物和非人灵长类动物脑切片中的神经元。在本实验中，我们使用成年小鼠（3-6 月龄）和成年食蟹猴（9-15 岁）。该技术最初由 Lichtman 博士实验室描述（Gan et al.,...

啮齿类与非人灵长类脑切片神经元的DiOLISTIC标记

该视频介绍了在小鼠脑切片中对视网膜-外侧膝状体突触和皮层-外侧膝状体突触进行电生理记录的方法。包含背侧外侧膝状体核（dLGN）的脑切片被置于记录室中。刺激电极可放置于视束上，以刺激视网膜神经节细胞（RGCs）并研究视网膜-外侧膝状体突触；或放置于丘脑网状核，以刺激皮层神经元并研究皮层-外侧膝状体突触。刺激后，RGCs...

小鼠脑切片中视网膜丘脑和皮层丘脑突触的电生理学研究

本视频展示了通过光遗传学刺激内侧前额叶皮层（mPFC）轴突并记录外侧内嗅皮层（LEC）锥体神经元的反应，来研究外侧内嗅皮层（LEC）突触效能的实验方法。该方法结合膜片钳记录与光刺激诱导的突触激活，用于研究突触可塑性。...

光遗传学刺激与大鼠脑片突触事件的电生理记录

来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp.

使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析

在突触前释放面膜上记录 Ca2+ 电流，对于精确理解 Ca2+...

急性分离七鳃鳗网状脊髓轴突以实现对单个功能性突触前终末释放面膜的记录

在急性脑切片中对突触连接的神经元进行膜片钳记录和同时的细胞内生物胞素填充，可实现其结构与功能特性的相关联分析。本方案的目的是描述从神经元微环路进行电生理记录及其后续形态学分析的关键技术步骤。...

利用成对膜片钳记录技术对急性脑切片中神经元微环路的电生理学与形态学特征进行表征

本文概述了一种利用免疫荧光技术在海马切片中准确识别和分析突触的实验方案。...

海马体啮齿类动物脑切片中突触密度的评估

我们介绍一种结合全细胞膜片钳记录与双光子成像的方法，用于在急性脑片中的神经元树突内记录 Ca2+...

脑片中神经元树突的双光子钙成像

本文介绍了制备包含外侧膝状体核的急性脑切片以及对视网膜-膝状体和皮层-膝状体突触功能进行电生理研究的实验方案。该方案可在同一急性脑切片中高效地研究高释放概率和低释放概率的突触特性。...

视网膜-外侧膝状体及皮层-外侧膝状体突触功能的电生理学研究

我们描述了处理新生大鼠脑组织以获得高分辨率电子显微照片的步骤，用于分析神经末梢突触小泡分布的形态计量学研究。采用这些方法获得的显微照片还可用于研究多种其他细胞组分的形态及其维度结构关系。...

新生大鼠脑组织制备用于神经末梢突触小泡分布的超微结构形态计量分析

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

学习振动分离技术从啮齿动物脑切片中分离神经元，保留突触前末梢用于电生理记录和实时成像。该方法为突触传递和可塑性研究提供了出色的药理学控制和空间钳位条件。

从啮齿类动物脑片中振动解离神经元以研究突触传递和成像突触前终末

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