Name: 隔离啮齿类动物或人类的鼻嗅干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 了解从啮齿类动物或人类鼻腔中分离嗅黏膜干细胞的方法。该技术通过手术采集活检样本，分离外胚层间充质干细胞并诱导其分化为神经元样细胞，为神经系统疾病诊断和脑损伤修复研究提供可靠的细胞来源。

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本工作得到了法国国家研究署（ANR）、法国肌病协会（AFM）、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区的欧洲区域发展基金（FEDER）以及脊髓与脑研究所（IRME）的经费支持。我们衷心感谢玛丽·皮埃尔·布兰查尔（Jean Roche研究所）在延时成像记录过程中提供的高效协助。

1. 大鼠嗅黏膜的采集
<ol>
 <li>在洁净的超净工作台中，准备三个盛有 DMEM/HAM F12 培养基的 35 mm 培养皿。</li>
 <li>任何安乐死方法必须事先获得机构动物护理与使用委员会的批准，并由合格人员操作。在大鼠通过戊巴比妥钠或其他注射类麻醉剂（如氯胺酮/赛拉嗪）进入深度麻醉后，进行断头并去除皮肤。应避免使用吸入性麻醉剂。在断头前，需通过夹趾反应评估麻醉是否充分。使用剪刀去除下颌骨，并借助咬骨钳清除双侧面部肌肉。</li>
 <li>从切牙后方开始，使用咬骨钳逐侧去除覆盖鼻腔的骨组织。嗅甲将作为位于鼻腔后部的橙褐色器官显露出来。</li>
 <li>用镊子小心弃去嗅甲。使用 26 号针头沿三个方向切割组织，分离位于鼻中隔上的嗅黏膜：垂直板的弧形边缘、筛板以及鼻腔顶部。</li>
 <li>采集双侧活检组织，并将其转移至盛有 DMEM/HAM F12 培养基的培养皿中。从开始实施安乐死至完成此步骤，整个过程不应超过 10 分钟。</li>
 <li>为去除黏液，现将活检组织先后转移至两个盛有培养基的培养皿中，各清洗一次。</li>
</ol>
2. 人类嗅黏膜的采集
<ol>
 <li>该操作应由耳鼻喉科（ENT）外科医生按照相关当地伦理委员会的要求进行，并且每位门诊患者均需签署知情同意书。</li>
 <li>使用直径为4 mm的0°或30°硬性内窥镜检查双侧鼻腔，评估是否存在息肉或任何炎性病变。根据鼻中隔偏曲情况，选择较适宜的一侧鼻腔。</li>
 <li>使用棉签涂抹含肾上腺素的局部麻醉剂（如利多卡因），作用10分钟。</li>
 <li>使用穿切筛窦钳，在中鼻甲内侧面根部或鼻中隔背内侧区域取2平方毫米大小的组织活检样本。</li>
 <li>随后用无菌针头将嗅黏膜活检组织转移至含有1 ml DMEM/HAM F12培养基的无菌2 ml离心管中。轻柔倒置管体，确保活检组织完全浸入培养液中。</li>
 <li>将离心管放入冷藏容器中，并运送至研究实验室。在此阶段，该活检组织可直接用于针对特定脑部疾病的比较分子研究，或进一步处理以获取干细胞。</li>
</ol>
3. 从人和大鼠黏膜中分离嗅觉干细胞
<ol>
 <li>用DMEM/HAM F12洗涤活检组织。将活检组织置于含有1 ml dispase II溶液（2.4 IU/ml）的培养皿中，37°C孵育1小时。</li>
 <li>随后，在解剖显微镜下使用倒置的漫射光源，用微型刮匙将嗅上皮从其下方的固有层中分离。</li>
 <li>与呈橙色/棕色条纹状的固有层相比，嗅上皮较薄，在黑色背景下呈半透明状。在白色背景下，上皮呈灰色，而固有层呈棕色。</li>
 <li>分离完成后，将固有层转移至盛有DMEM/HAM F12的培养皿中。</li>
 <li>若组织来源于啮齿类动物，则用两根25号针头将固有层切成小块，随后将组织块转移至含有1 ml胶原酶IA的15 ml离心管中。</li>
 <li>在离心管中，使用无菌塑料移液管对组织进行机械解离，然后于37°C孵育10分钟。</li>
 <li>为终止解离过程，轻轻摇动离心管，加入9 ml无钙无镁的PBS，以200 g离心5分钟。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于添加了10%胎牛血清和抗生素的DMEM/HAM F12培养基中，接种至塑料培养皿中进行培养。</li>
 <li>若组织来源于人类，则将固有层切成3至4片，每片厚度为200至500 μm。</li>
 <li>将每一片组织放入直径为2 cm的独立培养皿中，并用无菌的直径1.3 cm玻璃盖玻片覆盖组织。</li>
 <li>然后，向每个培养皿中加入500 μl培养基（DMEM/HAM F12，添加10%胎牛血清和抗生素）。</li>
 <li>无论何种组织类型，均应每2至3天更换一次培养基。</li>
 <li>5至7天后，干细胞将开始迁出并贴壁生长；约两周后应达到汇合状态。当细胞汇合时，进行传代并将细胞转移至培养瓶中。</li>
</ol>
4. 嗅觉干细胞的成球及神经元分化
<ol>
 <li>为生成干细胞球，将培养瓶在37°C下用聚-L-赖氨酸（TEXT: 5 g/cm2）孵育两小时。</li>
 <li>以每平方厘米16,000个细胞的密度将细胞接种至处理过的培养瓶中。</li>
 <li>每两天以每平方厘米0.2 ml的补充培养基对细胞进行换液（DMEM/HAM F12培养基添加胰岛素、转铁蛋白、硒（ITS-X，1%）、EGF（50 ng/ml）和FGF2（50 ng/ml））。</li>
 <li>两到五天后，收集悬浮的细胞球，并在移植至细胞治疗动物模型前重新接种或将其解离。</li>
 <li>为将嗅觉干细胞诱导分化为类神经元细胞，将其在含B-27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺和谷氨酸的Neurobasal培养基中培养21天。</li>
 <li>随后每3天更换一次培养基。类神经元细胞应在两到三周后出现。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
鼻腔人源外植体来源的干细胞（图2A）增殖迅速，通常在一至两周内即可达到汇合状态。其中一个干细胞特性的关键标志物——巢蛋白（nestin）的表达情况也进行了评估（图2B）。当在添加了EGF（50 ng/ml）和FGF2（50 ng/ml）的无血清培养基中，并接种于多聚-L-赖氨酸包被的培养皿时，嗅觉干细胞可形成球状体（图2C）。当将新接种的球状体置于含血清的培养基中培养时，可分化为表达GFAP的细胞（约50%）、表达微管蛋白（tubulin）的细胞（约10–15%）以及表达O4的细胞（约2–5%）9（图2D–F）。然而，球状体来源细胞的分化命运可以被调控。例如，在添加B27和谷氨酸的Neurobasal培养基中培养时，大多数鼻源性嗅觉干细胞可分化为表达β-III微管蛋白的类神经元细胞（图2G）和表达MAP2的细胞（图2H）。
<img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="从大鼠和人类组织中分离嗅觉干细胞以鉴定脑疾病生物标志物的示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 实验总体方案。从大鼠或人类鼻腔中切除嗅黏膜活检组织。这些外植体可直接用于比较分子研究，以鉴定脑疾病的生物标志物。为了分离嗅觉干细胞，使用dispase II酶破坏固有层与神经上皮之间的相互作用，45分钟后用显微铲去除上皮。对于啮齿类动物的嗅觉干细胞，进一步使用胶原酶IA消化固有层进行筛选。对于人类组织，则将嗅觉固有层小块置于玻璃盖玻片下培养，直至干细胞长出并扩散至整个培养孔。在适当的培养基中增殖后，嗅觉干细胞可形成球状体或分化为类神经元细胞。嗅觉干细胞可用于：i）修复脑部疾病或损伤，或 ii）鉴定中枢神经系统疾病的分子标志物。插图由Servier Medical Art协助制作。
<img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="神经分化、免疫染色、细胞培养；标记物：NESTIN、GFAP、BETA-TUBULIN III。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 鼻腔人类嗅觉干细胞的培养与分化。人类干细胞从嗅黏膜固有层组织块（A）中生长出来，在含血清培养基中培养时增殖迅速。这些干细胞表达干细胞标志物 nestin（B）。当接种于聚-L-赖氨酸包被的塑料培养皿中，并在添加了 EGF 和 FGF2 的无血清培养基中培养时，嗅觉干细胞形成球状体（C）。将球状体来源的细胞接种至含血清培养基中，可分化为表达 GFAP 的细胞（约 50%）、表达 tubulin 的细胞（约 10–15%）以及表达 O4 的细胞（约 2–5%）9（D–F）。当在添加 B27 和谷氨酸的 Neurobasal 培养基中培养时，它们可分化为表达 β-III tubulin（G）和 MAP2（H）的类神经元细胞。

<ol><li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li>
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<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia%3A+a+3-year+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的技术使啮齿类动物和人类的嗅黏膜成为研究神经发育性和神经退行性疾病病因的有用模型，同时也可作为修复病理性或创伤性脑损伤的工具。该方案相对简单，有经验的细胞生物学家可轻松完成。活检和培养技术的成功率较高。
关键步骤
<ul>
	<li>采集啮齿类动物嗅觉黏膜时，建议在安乐死后至最终切除嗅觉组织的时间不超过10分钟。</li>
	<li>啮齿类动物嗅觉固有层的解离通常在胶原酶IA中孵育10分钟后即可完成。若未完全解离，建议次日收集含有未解离固有层碎片的上清液，于200 g离心，再用巴斯德吸管通过机械方式解离漂浮的固有层组织，随后将细胞重新接种至新的培养孔中；原培养孔中已贴壁的细胞则补充新鲜培养基。</li>
	<li>对于结构较啮齿类组织更为致密的人类固有层，不建议采用酶解法进行解离。应将组织切成片状，每个组织块置于塑料培养皿底部与盖玻片之间。成功的培养通常包含厚度在200至500 μm之间的组织块。</li>
</ul>
可能的修饰
<ul>
	<li>为了在体外生成嗅觉神经元，可对当前方案进行轻微修改。具体而言，不需去除神经上皮组织，而是使用McIlwain切片机将整个嗅黏膜切成200 μm厚的薄片。每个组织块接种于培养皿中，先部分干燥一小时，随后用含胎牛血清（FCS）的培养基重新水化。接种后最初几天，上皮细胞和间充质细胞从组织块中迁移生长出来；随后，神经前体细胞将迁移至该细胞层的表面，并分化为神经元。</li>
	<li>可通过流式细胞术对嗅觉干细胞进行纯化。特异性表面标志物可从已发表的表征研究论文11所提供的列表中获取。</li>
	<li>在移植实验中，可使用一种嗅觉干细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）的大鼠品系。该大鼠品系（Sprague Dawley，由PGK启动子驱动eGFP表达）可从法国南特的ITERT机构获得。若需将GFP基因导入人源嗅觉干细胞，我们采用基于慢病毒转导的方法。</li>
	<li>本文主要关注嗅觉外胚层间充质干细胞（OE-MSCs）。然而，同一组织中还可分离出另一种具有研究价值的细胞类型——嗅鞘细胞。我们已描述了其分离与纯化方法1,17，并已将人鼻源性嗅鞘细胞应用于截瘫患者的I/IIa期临床试验18。</li>
	<li>作为间充质干细胞超家族的一员，在适当的培养条件下，OE-MSCs能够分化为脂肪细胞、成骨细胞和肌细胞11。</li>
</ul>
未来应用
<ul>
	<li>我们已利用人类嗅觉活检研究自闭症、双相情感障碍、家族性自主神经功能异常症、帕金森病、阿尔茨海默病和精神分裂症患者的细胞与分子异常2-7。理论上，所有脑部疾病均可通过鼻腔活检或外周嗅觉干细胞进行研究。</li>
	<li>啮齿类动物及人类鼻腔嗅觉干细胞已被移植至遗忘症、帕金森病、耳蜗损伤和脊髓损伤动物模型中12-16。未来有望将这些细胞移植至阿尔茨海默病、脑缺血和多发性硬化症的动物模型中。</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td>大鼠嗅黏膜的采集</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HAM F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26号针头</td><td>泰尔茂医疗公司（Terumo Medical Corp.）</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>人类嗅黏膜的采集</td><td></td></tr><tr><td>硬质内窥镜</td><td>Karl Storz 或 Richard Wolf Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>利多卡因</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>肾上腺素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>穿透筛骨镊</td><td>Karl Storz 或 Richard Wolf Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>嗅觉干细胞的分离</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>罗氏集团（Roche Group）</td><td>10 295 825 001</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型刮匙</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>无钙/无镁 PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270098</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Knittel Glaser</td><td>001/35</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>神经球形成与神经元分化</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）</td><td>Invitrogen</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 无血清添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从啮齿类动物或人类中分离鼻腔嗅觉干细胞

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

位于鼻腔内的嗅黏膜负责检测气味。它也是唯一暴露于外部环境且在每个活体个体中都易于获取的神经组织。因此，该组织对于旨在识别病理性脑部分子异常或分离成体干细胞用于细胞治疗的研究者而言具有独特价值。
脑部疾病的分子异常通常通过死后采集的神经组织样本进行研究。然而，此类材料存在诸多局限性。相比之下，嗅黏膜易于获取，且可安全地进行活检，不会导致嗅觉丧失1因此，嗅黏膜为成人提供了一扇“开放的窗口”，通过它可研究发育性疾病（如自闭症、精神分裂症）2-4 或神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病）4,5嗅觉黏膜可用于分子比较研究4,6 或 体外 神经发生实验3,7.
嗅觉上皮也是一种神经组织，每天都会产生新的神经元，以替换因污染或细菌、病毒感染而受损的神经元。这种持续的神经发生由前体细胞以及位于黏膜两个区室（即嗅觉上皮和其下方的固有层）中的干细胞共同维持8-10。我们近期开发了一种方法，用于纯化位于固有层中的成体干细胞；在证实这些细胞与骨髓间充质干细胞（BM-MSC）密切相关后，我们将它们命名为嗅觉外间充质干细胞（OE-MSC）11。
有趣的是，与骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）相比，嗅鞘间充质干细胞（OE-MSCs）表现出更高的增殖速率、更强的克隆形成能力以及向神经细胞分化的倾向。我们利用这些特性开展了研究，旨在揭示精神分裂症和帕金森病的新的候选基因4。我们及其他研究团队还证明，OE-MSCs在脊髓损伤12,13、耳蜗损伤14，以及帕金森病15或遗忘症16的动物模型中，均是极具前景的细胞治疗候选细胞。
本研究介绍了在大鼠和人类中进行嗅黏膜活检的方法。采集后，通过酶消化法将固有层与上皮层分离，并采用酶法或非酶法纯化干细胞。纯化后的嗅干细胞可大量扩增后冻存于液氮中，也可诱导形成球状体或分化为神经细胞。这些干细胞还可用于比较组学（基因组学、转录组学、表观基因组学、蛋白质组学）研究。

本文介绍了一种从大鼠和人类鼻腔中获取嗅黏膜活检样本的方法。这些活检样本可用于识别脑部疾病的分子异常，或分离具有多向分化潜能的成体干细胞，后者可在脑损伤/脑疾病动物模型中用于细胞移植研究。

位于鼻腔内的嗅黏膜负责检测气味。它也是唯一暴露于外部环境的神经组织……

本实验的总体目标是从大鼠或人类中分离鼻腔嗅觉干细胞，以识别分子异常或修复病变或受损的大脑。首先通过手术从鼻腔采集嗅黏膜活检组织。接着去除嗅上皮及其上皮干细胞，从而专注于位于下方固有层中的外胚层间充质干细胞，随后通过解离啮齿类动物组织，或从在玻璃盖片下培养的人类组织植块中收集迁移生长的细胞，来分离这些细胞。该操作的最后一步是培养干细胞球体，以诱导其分化为类神经元细胞。最终可获得整个嗅黏膜的分离干细胞。这些悬浮的球状结构或类神经元细胞可用于脑部疾病中分子标志物的鉴定，或用于修复神经系统损伤。我们介绍了从嗅黏膜中分离人类和啮齿类动物鼻腔干细胞的方法。该技术相较于现有方法的主要优势在于，这些干细胞来源于神经组织，可在每个活体个体中方便获取，并可用于病理性脑部的诊断或修复。作为一名耳鼻喉科外科医生，我已为有趣的临床研究进行了数百例鼻腔活检。该操作是安全的，可以进行，并可在局部局部麻醉下实施。我是一名初级科研人员，专长于人或啮齿类动物的鼻部或其他因子干细胞的培养。这种细胞具有较高的增殖速率，并倾向于分化为神经细胞类型。在遗忘症和感觉系统疾病的动物模型中，已证明其具有显著疗效。在采集黏膜之前，将活检组织置于含有DMEM/F12培养基的3至35毫米培养皿中，在洁净的超净工作台内完成配制。现在通过脚趾夹捏确认大鼠已进入戊巴比妥钠深度麻醉后，进行断头处死。分离头部并去除皮肤。用剪刀移除下颌，并借助自身解剖剪，从切牙后方开始，清除双侧面部肌肉。使用Ron Jur工具，逐一去除覆盖鼻腔的骨骼。嗅甲呈现为位于鼻腔后部的橙色或棕色器官，用镊子小心地将其移除。使用26号针头，沿垂直板的弧形、筛板（CRI form plate）以及鼻腔顶部三条线切割组织，分离位于鼻中隔上的嗅黏膜。采集双侧活检样本，并转移至盛有A-D-M-E-M Ham F12培养基的培养皿中。从实施安乐死后开始，该操作过程不应超过10分钟。为了去除黏液，根据相关当地伦理委员会的规定，将活检组织在盛有培养基的培养皿中转移两次。该操作应由耳鼻喉科医生进行，每位门诊患者均需使用0度或30度硬性内窥镜签署知情同意书。检查双侧鼻腔，评估是否存在息肉或任何炎性病变。根据鼻中隔的偏曲情况，选择最佳的鼻腔。使用棉签，将含有肾上腺素的利多卡因等局部麻醉剂涂抹于穿刺部位，麻醉10分钟。用筛骨钳在中鼻甲内侧面根部或鼻中隔背内侧区域取2平方毫米大小的活检组织。此处展示的是来自根部区域的活检样本。随后使用无菌针头将嗅觉活检组织转移至含有1毫升DMEM/F12培养基的无菌2毫升离心管中。将离心管轻轻倒置，以确保活检组织完全浸入培养基中。将试管放入冷藏容器中，并运送至研究实验室。在此阶段，活检样本可直接用于针对特定脑部疾病的比较分子研究，或进一步处理以生成干细胞。清洗人或大鼠的活检组织，将DMEM/F12加入培养皿中，其中含有1毫升的消化液，用于孵育活检组织。在37摄氏度下孵育两种溶液一小时。接着，在解剖显微镜下使用微 spatula 并采用倒置的散射光源，将人或大鼠的嗅上皮从其下方的固有层中分离。在黑色背景下，嗅上皮呈半透明状，而固有层在白色背景下呈橙褐色条纹状。上皮呈灰色，固有层呈棕色，纯化后将固有层转移至含有DMEM/F12的培养皿中。若组织来源于啮齿类动物，用两根25号针头将固有层剪成小块。然后用无菌塑料移液管将组织块转移至含有1毫升胶原酶IA的15毫升离心管中，以解离组织。然后在37摄氏度下孵育试管10分钟。为终止消化反应，轻轻摇动试管，加入数毫升无钙无镁的PBS缓冲液，于200 ×g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于培养基中，并接种至塑料培养皿中。如果组织来源于人类，则将柠檬适当切成三到四块。将每块组织条放入一个直径为2厘米的孔中，置于四孔板内，并用无菌的直径为1.3厘米的玻璃盖玻片覆盖组织。然后向每种组织类型的培养皿中加入 500 µL 培养基。每两到三天更换一次培养基。培养五到七天后，干细胞将开始侵入培养皿。两周后，细胞应达到汇合状态。当达到汇合度时，传代并将细胞转移至培养瓶中，以生成干细胞球。每两天以每平方厘米16,000个细胞的密度将细胞重铺至预处理的培养瓶中。以每平方厘米0.2毫升的补充培养基对细胞进行换液。2至5天后，收集悬浮的细胞球，移植前可选择直接重铺或将其解离。一种用于细胞治疗的动物模型，可将嗅觉干细胞分化为类神经元细胞。在含有B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺和谷氨酸的神经基础培养基中培养细胞21天，每三天更换一次培养基。类神经元细胞应在铺板后5至7天，即培养2至3周后出现。鼻腔来源的人类嗅觉干细胞从外植体中生长出来，并迅速增殖。通常在一至两周内即可达到汇合状态。当在添加了表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）的无血清培养基中、于多聚赖氨酸包被的培养皿上培养时，评估了这些干细胞的一个关键特性——巢蛋白（nestin）的表达。当将这些细胞形成的球体接种至含血清的培养基中时，嗅觉干细胞可进一步分化。在培养基中，它们形成了包含约50%表达GFAP的细胞、最多达15%表达微管蛋白的细胞以及最多达5%表达OH4的细胞的细胞群体。当将球体来源的细胞在添加补充物的神经基础培养基中培养时，大部分细胞群体转变为表达βIII微管蛋白的类神经元细胞。这些相同的类神经元细胞也表达MAP2。因此，可以在一个学期内改变干细胞的命运。该技术可在不到四周的时间内轻松生成并扩增数百万个干细胞，使临床医生能够进行未来的自体细胞移植。鼻腔难治性活检对于识别生物标志物和脑部疾病非常有用。最近，我们在发现自闭症新的候选基因方面已取得成功。我们已建立了自闭症患者及对照个体的嗅觉干细胞库，该细胞库还可扩展至其他人类脑部疾病的研究。

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了解从啮齿类动物或人类鼻腔中分离嗅黏膜干细胞的方法。该技术通过手术采集活检样本，分离外胚层间充质干细胞并诱导其分化为神经元样细胞，为神经系统疾病诊断和脑损伤修复研究提供可靠的细胞来源。

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