石蜡包埋材料中DNA的提取用于遗传学和表观遗传学分析

本视频将演示如何从石蜡包埋的组织样本中提取DNA。本演示中使用的样本为一个直径3毫米、长度6毫米的组织芯。虽然本演示仅使用一个组织芯，但单次反应可处理更大的样本，例如直径超过5毫米、长度超过10毫米的样本，或2至3个与本演示所用尺寸相同的组织芯。

然而，需要注意的是，可能需要对实验方案进行调整，以确保完全去除石蜡并实现组织的充分消化。在对组织进行任何处理之前，必须先溶解用于保存组织的蜡状石蜡。这一步骤通常使用二甲苯来完成，因为二甲苯和酚均具有毒性。任何涉及这些化学试剂的操作都应在通风橱中进行。向含有样本的离心管中加入800 µL的二甲苯。

然后将样品置于摇床上，轻轻振荡10分钟。以14,000 RPM离心3分钟，使样品沉淀，随后弃去二甲苯并溶解管中的石蜡。重复此步骤两到三次，直至石蜡完全溶解。

组织应呈现湿润且柔软的状态。彻底去除所有石蜡对提高最终DNA得率至关重要。因此，较大的组织样本需要进行更多次洗涤。

现在，石蜡已从样品中去除，必须对组织进行再水化，以便进行组织消化。这一步骤通过乙醇梯度再水化系列完成。首先，向样品中加入 800 微升 100% 乙醇，涡旋混匀，然后以 14,000 转/分钟离心 3 分钟。

弃去上清液。使用800 µL的70%乙醇重复上述步骤，然后使用50%乙醇重复。最后一次离心应持续5分钟，因为组织此时较为松散，需要更大的离心力才能形成沉淀。

现在需要消化组织以从细胞中释放DNA。这一步使用裂解缓冲液完成，裂解缓冲液是一种含有蛋白变性剂（如SDS）和蛋白酶K的溶液，其中蛋白酶K是负责降解组织的酶。

向样品中加入 200 至 500 微升裂解缓冲液。根据样品大小，400 微升是一个适宜的用量。通常，裂解缓冲液的组分以及 56 摄氏度的孵育温度有助于最大限度地提高蛋白质的活性。

ACE K.Because protein，ACE K 只能在一定时间内降解组织，因此必须定期添加更多的酶以持续反应。每次加入 20 微升蛋白质，ACE K 的浓度为 10 毫克/毫升，每天早晚各添加一次，直至组织完全溶解。

当看不到任何固体组织时，需要从细胞碎片缓冲液中提取DNA。使用饱和酚将样品分离为水相和有机相，DNA位于水相中。

必须使用缓冲液饱和酚，因为普通酚的酸性不仅会降解DNA，还会导致水相和有机相的分层发生颠倒。注意，缓冲液饱和酚以两相形式储存，其中酚相位于下层。

向样品中加入等体积的缓冲液饱和酚，然后反复倒置离心管数次。接着将样品放入离心机，以14,000 ×g离心5分钟，以诱导相分离。

DNA 和 RNA 将存在于上层水相中，而蛋白质、脂质和多糖则位于中间相和下层有机相中。小心移取水相层，避免扰动中间相，并将其转移至新离心管中。通常在第一次离心后，中间相较为松散且位置靠后。

需要使用少量水进行抽提。反向抽提的实验步骤详见本视频的配套文本。重复上述步骤，直至界面清晰，通常重复三到五次即可。随后向DNA样品中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇。

此步骤的目的与单独使用苯酚相同，但可使界面更清晰，从而最大化DNA的得率。重复此操作一至两次，直至界面清晰分明。现在您的样品中已不含蛋白质，任何污染的RNA都必须被去除。

这是通过RNA实现的。将降解用RNA A以100微克/毫升的终浓度加入样品中，并在37摄氏度下孵育一小时。现在RNA已降解，需要去除RNAA酶。

重复之前的DNA纯化步骤。先使用缓冲液饱和的苯酚，然后继续使用苯酚-氯仿-异戊醇进行纯化，由于此时唯一的污染物是RNA酶A和已降解的RNA，因此需要的纯化步骤更少。现在样品中仅含有DNA，必须从溶液中沉淀出DNA，加入十分之一体积的乙酸钠和等体积的异丙醇。

或者，可加入两倍半体积的乙醇，但此时需要使用更大的离心管。将样品在零下20摄氏度孵育30分钟至1小时，或者在过夜工作时进行孵育。由于现在处理的是DNA，请确保样品始终保持在冰上，以防止其降解。

在4°C条件下，以14,000 RPM离心10分钟，使沉淀的DNA形成沉淀颗粒。小心移除上清液，避免扰动沉淀物，以去除可能干扰后续实验（如测序）的过量盐分。例如，加入1 mL预冷的70%乙醇，并轻轻重悬样品。

再次在4°C条件下以14,000 RPM离心样品10分钟。小心移除上清液，并将残留的乙醇在空气中晾干最多5分钟。注意不要将样品过度干燥。

最后，DNA 经过纯化后即可用您选择的缓冲液重新悬浮。此处我们使用的是经高压灭菌的蒸馏水。是的。

将 DNA 样本在 -20 °C 下保存，以备后续使用。DNA 提取完成后，必须评估其质量和数量。可通过分光光度法进行检测：使用 NanoDrop 2000/2000C 仪器，将测量类型设为核酸，选择 DNA 50 作为计算方式，并用 1.5 µL 水初始化仪器。

用1.5微升稀释液清洁基座并进行空白测量。此处使用蒸馏水。清洁基座后，加入1.5微升样品，然后点击测量。是的。很好。

此时，A260/A280 比值为 1.8 最为理想。您的 DNA 已可用于后续实验应用，包括但不限于基因芯片、比较基因组杂交、甲基化 DNA 免疫沉淀以及测序。

如果这些方案无需立即使用，可参见此处的链接。请将样品储存在零下 20 摄氏度，以备后续使用。