Trichuris muris 感染：肠道2型免疫与炎症的一个模型

本实验的总体目标是建立并维持一种自然的肝片吸虫感染模型。首先，通过口服灌胃法使小鼠感染肝片吸虫卵。21天后，处死感染动物，采集血液、肠系膜淋巴结、粪便颗粒、结肠和肝脏组织。

利用这些样本，可分析针对TRICKS的免疫应答。可使用镜像分析血清样本，并通过溶血素检测TRAs特异性抗体。

体外重刺激淋巴结细胞可用于分析细胞免疫反应。可使用Western印迹法检测粪便颗粒中的蛋白质含量，并通过结肠的QPCR分析进行基因表达分析。最后，盲肠尖端可用于组织学检查，而其余部分可用于测定感染小鼠的寄生虫负荷。

最终可以获得结果，以判断小鼠对弓形虫（Trails MOUs）感染是否具有抗性或易感性，并可对针对该寄生虫的免疫应答进行表征。该方法有助于回答免疫学领域的关键问题，例如哪些因素调控辅助性T细胞的活化，以及哪些蛋白质是TH2细胞分化所必需的。弓形虫（Trauss MOUs）卵囊可在免疫缺陷小鼠或遗传易感品系（如KR品系）中增殖，感染后35天可通过安乐死小鼠收集卵囊。

暴露动物的腹侧表面，使用无菌镊子和剪刀以乙醇冲洗小鼠腹部。抓住腹部皮肤并做一个小切口。暴露腹腔内容物，识别盲肠和近端结肠，然后将其切除。

将器官转移至含有青霉素和链霉素的补充DMEM的10厘米培养皿中。然后用镊子剪开盲肠和近端结肠，暴露肠腔和虫体。将打开的器官放入含有PBS的烧杯中，轻轻振荡以洗去粪便。

清洗盲肠后，将其转移至新的培养皿中，使用光滑的弯头镊子轻轻取出寄生虫。将每只小鼠体内的所有寄生虫转移至六孔板的一个孔中，该孔内含有5毫升添加抗生素的DMEM培养基。将六孔板连同湿润的纸巾一起放入密封容器内，于37°C孵育4小时，使寄生虫产卵。

孵育结束后，用镊子将线虫从原始孔中取出，并分装到两个含有DMEM的新孔中。以这种方式分装线虫可最大限度地利用移液器回收虫卵。收集原始孔中剩余的含有分泌抗原和虫卵的培养基，并转移至15毫升Falcon管中。

将离心管在3000 RPM下离心五分钟。然后移除并保存上清液，其中含有四小时抗原，将含有沉淀的试管用无菌水重悬。再次将含有线虫的六孔板置于37°C，孵育过夜，次日早晨进行后续操作。

弃去线虫后，收集孔中的内容物（如前所示），离心上清液以分离虫卵。保留含有过夜抗原的上清液，并将虫卵重悬于水中。与之前相同，将这些虫卵与四小时孵育获得的虫卵合并。

用70微米的滤网过滤虫卵，以去除残留的线虫。然后将虫卵转移至75平方厘米的锥形瓶中。用铝箔包裹锥形瓶以避光，并在室温下储存六周。

这将使卵在六周后成熟并孵化。清洗卵，搅拌水，并计数可存活的卵。如图所示。

以具有活力的孵化卵和无活力的卵为例，Reese's 采用 50 每 50 微升的 Exeter 浓度。此时，卵可在感染小鼠前于 4°C 下保存。务必充分重悬含有卵的溶液。

将所需量的接种物转移至一个14毫升带卡扣盖的试管中，并颠倒试管以混匀。用适合动物体型的适当尺寸的饲喂针头连接1毫升注射器，吸取200微升虫卵。抓住小鼠颈部皮肤固定，通过口服灌胃方式给予虫卵。

将感染的小鼠放回笼中，继续感染过程21天。21天后，使用未加肝素的注射器通过心脏穿刺采集感染小鼠的血液。在二氧化碳安乐死后，血液样本可保存在4°C条件下。

用于通过ELISA分离血清并分析tra特异性IgG和IgE。按照前述方法暴露小鼠腹腔。然后使用镊子用剪刀或另一把镊子将盲肠拉出。

将小肠推向右侧，暴露肠系膜淋巴结。小心地摘取淋巴结，注意不要损伤肠道，并将其放入含有2毫升培养基的15毫升Falcon管中。随后可将淋巴结细胞在体外用虫体培养物的4小时抗原S上清液进行再刺激，以分析针对寄生虫的细胞免疫反应。

获取淋巴结后，使用镊子按照前述方法切除盲肠和结肠，从远端结肠中分离粪便颗粒，并将其放入2毫升的氧气管中，粪便颗粒可在-20 °C条件下保存，并使用剪刀通过Western blot检测蛋白质含量。剪取约1厘米长的近端结肠组织，放入含有RNA保存液的离心管中，随后在4 °C条件下保存。

用镊子夹住盲肠末端，从盲肠尖端剪下约五毫米的组织。使用3毫升注射器和22号针头，用PBS冲洗样本。然后将其转移至含有4%多聚甲醛的5毫升带螺帽管中。

经戊醛固定的盲肠样本可在 4 摄氏度下保存，并用于组织学分析。将剩余的盲肠组织放入培养皿中，并在负 20 摄氏度下冷冻以杀死寄生虫。为便于计数寄生虫，将盲肠组织解冻后置于含有约 5 毫升水的培养皿中，使用剪刀进行操作。

切开盲肠以暴露管腔，并轻轻摇晃，将粪便收集到培养皿中。将清洁的盲肠放入盛有水的新培养皿中，用光滑的弯头镊子刮取肠上皮细胞。然后将盲肠转移至另一盛有水的培养皿中，将组织撕成小块。

在解剖显微镜下观察粪便、肠上皮细胞和盲肠组织，计数虫体，边计数边将其移除，并放入新的培养皿中。此处展示的是盲肠内的虫体在分离前后的正常形态。感染后，tragus mirrors black six小鼠能够控制寄生虫，而KR小鼠则出现寄生虫负荷升高的现象。

同样易感的A KR小鼠在感染后产生的TRA特异性IgG2a抗体滴度显著高于C57BL/6小鼠，该结果通过血清ELISA测定确定。本实验中，Western blot分析显示，在感染后，C57BL/6小鼠粪便中杯状细胞特异性蛋白RELMβ的含量增加，而A KR小鼠则无此现象。对盲肠远端进行组织学分析表明，在抵抗性TRA感染的C57BL/6小鼠中出现杯状细胞增生及黏液分泌，而在易感的A KR小鼠中则未见此现象。

观看本视频后，您应充分了解如何扩增三日疟原虫卵囊、感染实验小鼠，并获取肠道组织、肠系膜、肠系淋巴结和血液，以分析易感或抗性小鼠体内的感染情况。