Name: 多重PCR和反向线杂交检测（MPCR / RLB） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学习多重PCR和反向线杂交检测方法，用于同时检测多达43种分子靶标。该技术具有高通量、低成本的优势，适用于临床样本中多种病原体的快速鉴定和微生物分型研究。

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Matthew O'Sullivan 和 Fei Zhou 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究理事会研究生医学研究奖学金。

在引物和探针设计时必须仔细考虑。应利用 GenBank 等数据库中目标序列的所有可用信息，识别出适合作为靶点的保守区域。当在单个多重 PCR（mPCR）检测中扩增大量目标序列时，每个扩增产物的长度应相近，且不应超过 300 个碱基对，以避免扩增竞争。该方法的另一种应用是：使用针对保守区域的引物扩增一个较长的目标片段，并通过多个探针来鉴定扩增子内部的序列变异。在这种情况下，扩增的 PCR 产物可以更长。所有引物的退火温度应相近，并相应调整 PCR 反应条件。应避免使用容易形成强二级结构或引物二聚体的引物。可使用 Sigma Aldrich DNA 计算器（<a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a>）可靠地预测这些特性。
DNA探针的设计应使其退火温度接近60°C。为了最大限度提高特异性，可在检测中为每个目标序列设计两个探针，其中一个与反向引物结合位点附近的正向DNA链杂交，另一个与正向引物结合位点附近的反向DNA链杂交。在此情况下，正向和反向引物都必须进行生物素修饰。如果每个扩增目标仅使用一个探针，则只需对其中一个引物进行生物素修饰。
在为多重PCR/反向斑点杂交（mPCR/RLB）实验设计引物和探针时，强烈建议使用in silico方法预测PCR产物及探针杂交情况，以便与in vitro实验结果进行比对。理想情况下，应使用已知全基因组序列的分离株进行分析。可使用如FastPCR等软件（可从http://primerdigital.com/fastpcr.html获取）完成此目的。当in silico分析显示存在碱基错配，导致探针退火温度较低时，可预测出探针信号微弱或缺失。
DNA提取技术将根据被测样本的不同而有所差异，PCR条件则取决于引物设计。有关DNA提取和PCR试剂及反应条件的更多信息，读者可参考关于各个检测方法的出版物1-19。
每次实验均需设置适当的对照，以确保膜上的每条探针至少产生一个阳性信号和一个阴性信号，同时还需设置无DNA对照。此外，建议在膜的上方加入一条针对所有样本均预期呈阳性的探针（例如：在微生物检测中使用物种或属特异性探针）。该探针既可作为阳性对照，也有助于结果的快速定位与判读。
1. 膜的制备
<ol>
<li>配制以下溶液：
	<ul>
		<li>100 ml 0.5 M NaHCO₃（pH 8.4）</li>
 	<li>100 ml 0.5M NaHCO₃3</li>
		<li>20 ml 16% EDAC</li>
		<li>250 ml 0.1 M NaOH</li>
		<li>250 ml 2xSSPE</li>
		<li>250 ml 2xSSPE/0.1% SDS — 置于水浴中加热至 60°C</li>
		<li>250 ml 20 mM EDTA</li></ul></li>
<li>将烤箱预热至 60°C.</li>
<li>用70%乙醇清洁Immunetics Miniblotter。</li>
<li>将寡核苷酸探针稀释于 0.5 M NaHCO₃ 中3 至终浓度为 2 pmol/μl 以及一个体积的 200 μl.</li>
<li>将Biodyne C尼龙膜裁剪为15 cm × 15 cm。使用铅笔和直尺，在膜的顶部标记出0.5 cm的空白区域，并在此处书写相关信息。</li>
<li>将膜放入塑料袋中，加入20 ml新配制的16% EDAC溶液，室温下轻轻摇动10分钟。</li>
<li>用去离子水洗涤膜30秒。</li>
<li>将膜放入小型转印槽中，使槽道横跨膜面（与铅笔标记线平行）。放入支撑垫并合上转印槽。吸去槽道中的液体。</li>
<li>在1号和45号泳道中加样 150 μl 0.5 M NaHCO₃3使用 150 μl 依次加入每种探针溶液以填充第2至第44泳道，注意避免产生气泡。若通道中出现气泡，保持移液器位置不变，快速吸取溶液使气泡上浮至移液器顶端，然后重新操作。室温孵育5分钟。</li>
<li>吸去探针溶液，取出膜，在室温下用 250 ml 0.1 M NaOH 洗涤 9 分钟。</li>
<li>用250 ml 2xSSPE缓冲液洗涤膜30秒。</li>
<li>在烘箱中用 250 ml 预热的 2xSSPE/0.1% SDS 洗涤膜 60°C 5 分钟。</li>
<li>若不立即用于杂交，将膜在240 ml 20 mM EDTA溶液中室温洗涤20分钟（保留剩余10 ml），然后将膜与剩余的10 ml 20 mM EDTA一同密封于塑料袋中，置于冰箱中保存 4°C.</li>
<li>用Pyroneg去垢剂清洗微型印迹装置并用刷子刷洗。冲洗后晾干。</li>
</ol>
2. 杂交与检测
<ol>
<li>准备以下溶液：
	<ul>
		<li>250 ml 2xSSPE/0.1% SDS — 置于60°C水浴中保存。</li> 
		<li>500 ml 2xSSPE/0.5% SDS — 置于60°C水浴中保存</li>
		<li>500 ml 2xSSPE/0.5% SDS — 置于42°C烘箱中保存</li>
		<li>500 ml 2xSSPE — 室温保存</li>
		<li>500 ml 1% SDS — 初始时置于60°C水浴中保存（用于步骤3）</li>
		<li>250 ml 20 mM EDTA — 室温保存（用于步骤3）。</li>
 </ul>
</li>
<li>开启一个60°C的烘箱和一个42°C的烘箱。在加热板上的大烧杯中将水煮沸。</li>
<li>用70%乙醇清洁Immunetics Miniblotter。</li>
<li>将10 ml 2xSSPE/0.1% SDS分装至小容器中。在编号的试管中，向150 μl 2xSSPE/0.1% SDS中加入20 μl每种PCR产物。</li> 
<li>使用泡沫塑料支架在100°C下将PCR产物煮沸10分钟。立即置于冰上至少5分钟。</li>
<li>将膜在60°C烘箱中用剩余的240 ml 2xSSPE/0.1% SDS洗涤5分钟。</li>
<li>将膜放入miniblotter中并加上背垫。方向应使通道垂直运行（与铅笔线垂直）。</li>
<li>用负压吸除miniblotter通道中的多余液体。</li>
<li>向第一和最后一个通道中加入剩余的150 μl 2xSSPE/0.1% SDS。按顺序向其余通道（2–44）中加入已煮沸的PCR产物，注意避免产生气泡。</li>
<li>将miniblotter平放于60°C烘箱中1小时，以进行杂交反应。</li>
<li>吸出每个通道中的液体，然后将膜从miniblotter中取出。</li>
<li>在60°C烘箱中用预热的250 ml 2xSSPE/0.5% SDS洗涤两次，每次10分钟。</li>
<li>用42°C的2xSSPE/0.5% SDS润湿尼龙分离网，并用其将膜卷起。</li>
<li>将卷好的膜放入滚筒管中，展开以确保膜紧贴内壁表面。在15 ml 42°C的2xSSPE/0.5% SDS中加入3 μl链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（Roche Applied Science），混匀后加入滚筒管中。拧紧盖子，在42°C滚筒烘箱中孵育60分钟。确保滚动方向不会使膜收紧。定期检查是否泄漏。</li>
<li>用Pyroneg洗涤剂和水清洗miniblotter，冲洗后晾干。</li>
<li>从滚筒管中取出膜。在42°C下用剩余的2xSSPE/0.5% SDS洗涤两次，每次10分钟。</li>
<li>在室温下用2xSSPE洗涤两次，每次5分钟。</li>
<li>将烘箱温度升至80°C，并将500 ml 1% SDS放入烘箱中预热。</li>
<li>配制15 ml Amersham ECL检测试剂（7.5 ml溶液A和7.5 ml溶液B）。弃去2xSSPE，加入检测试剂。手动轻轻摇动2分钟，确保膜完全被溶液覆盖。弃去化学发光溶液。</li>
<li>裁剪两张大小合适的透明塑料片以适配曝光盒。将膜夹在两张塑料片之间，并放入曝光盒中。</li>
<li>进入暗室。在红光下将ECL检测胶片放入曝光盒，曝光5分钟。取出胶片时将右下角折角（狗耳标记），以便后续观察时正确辨识方向。</li>
<li>按照制造商说明，使用自动显影机或化学显影液显影胶片。</li>
<li>如需要，可重复进行更长或更短时间的曝光。</li>
</ol>
3. 膜的再生
<ol>
 <li>在 250 ml 1% SDS 中，80°C 条件下洗涤膜两次，每次 30 分钟。</li>
 <li>在 240 ml 20 mM EDTA 中，室温下洗涤膜 15 分钟。</li>
 <li>将膜与 10 ml 20 mM EDTA 一起密封于塑料袋中，4°C 冷藏以备后续重复使用。</li>
</ol>
4. 代表性结果： 
通过将膜置于打印的网格上观察，或扫描图像后导入BioNumerics（Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium）等软件中查看，可获得最佳结果。每种探针的结果均需参照阳性和阴性对照探针进行判读。结果最好分为阴性、弱阳性或阳性。阳性结果指信号强度等于或强于阳性对照探针；阴性结果指无信号或信号强度与阴性对照相同（即背景信号水平）；弱阳性结果指信号弱于阳性对照探针，但强于阴性对照。弱阳性结果可能由导致探针结合减弱的点突变引起，也可能源于引物二聚体形成的非特异性信号。对每个目标使用两个探针可提高特异性，若仅其中一个探针呈弱阳性，则可安全地将其判读为非特异性信号。若仍有疑问，可进行单重PCR反应，并通过凝胶电泳检测及对扩增产物测序，以确认结果是否真正为阳性。图2展示了一个代表性结果。
<img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="胺基-生物素标记DNA检测示意图；尼龙膜上的化学发光。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 多重PCR/反向斑点杂交（mPCR/RLB）原理。（P1）步骤1.9：经胺基修饰的探针共价结合至尼龙膜上。（P2）步骤2.10：经生物素修饰的PCR产物与膜上的探针发生杂交。（P3）步骤2.14：用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与膜孵育，使其结合至生物素。（P4）步骤2.19–2.21：辣根过氧化物酶催化ECL检测试剂中的反应，产生光信号，使感光胶片曝光。随后将膜洗涤，以供重复使用。
<img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="点印迹分析；样品与探针的网格；分子相互作用；示意图；数据可视化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 典型的多重PCR/反向线点杂交（mPCR/RLB）结果。样品1至6为阳性对照——它们共同包含了全部43个探针中每个探针至少一次的阳性信号。每个靶序列（A至U）均使用两个不同的探针进行检测，以提高特异性。探针A1和A2为种特异性探针，预期在每个样品中均为阳性，有助于确定膜的方向。探针A1在膜的底部重复出现。样品7和8为阴性对照。请注意，探针Q1、Q2、T1和T2在阴性对照中出现信号，表明引物可能存在非特异性结合或引物二聚体产物。这些探针或引物需要重新设计。探针C1、D1和F1在膜上呈现条带状扩散，可能是由于链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物或化学发光底物的非特异性吸附所致，但此类信号易于与真正的阳性探针信号区分。探针D1和D2的信号强度相对其他探针较弱，可能由于扩增片段较大，导致扩增效率较低。在多个样品（1、3、4、6、39）中，探针J2为阴性而J1为阳性，最可能的原因是这些样品中J2结合位点发生了突变。

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<li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

多重PCR/反向斑点杂交（mPCR/RLB）方法可同时检测大量PCR扩增产物。由于基于化学发光探针的检测具有高灵敏度，因此仅需一次包含大量引物对的多重PCR反应即可扩增DNA模板。
如果一个或多个样本未获得探针信号，可对剩余的PCR产物进行凝胶电泳，以帮助判断问题是出在PCR扩增还是探针杂交环节。若膜上所有探针信号均微弱或缺失，但凝胶电泳结果显示PCR扩增成功，则可能原因包括：膜的标记存在问题、膜在先前使用后再生不当、杂交或链霉亲和素孵育过程中温度设置错误，或链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物及检测试剂存在缺陷。
如果对照样品表明个别探针可能产生假阴性信号，可进行单重PCR结合凝胶检测，并随后进行测序，以确认PCR产物的扩增情况，并检测探针结合位点是否存在序列变异。探针信号弱或缺失可能源于扩增子过大：应尽可能使所有扩增子长度相近，且小于300 bp。扩增子的二级DNA结构也可能导致探针结合不良，此时可能需要重新设计引物。也可调整单个引物或探针的浓度，以优化信号强度。
由于探针与未扩增的引物或引物二聚体产物结合而导致的假阳性信号，可通过进行单重PCR结合凝胶检测及后续测序来分析。若出现此类情况，可能需要重新设计探针。探针结合位点的点突变可能导致信号微弱或缺失。为每个扩增产物设计两条探针，可便于此类问题的检测。通过精心设计引物和探针，可利用这一特性检测靶DNA中的微小序列变异。
总之，尽管目前存在多种可用于多重PCR反应后产物检测的方法，但多重PCR/反向线性杂交（mPCR/RLB）具有高通量、成本低廉且启动费用低的优势。该方法的灵活性使其可广泛应用于多种场景。

<table><tbody><tr><td>5&amp;rsquo; 胺基 C6 修饰的寡核苷酸探针</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>配制成 pH 8.4 的 0.5 M 溶液</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>0.1 M 溶液</td></tr><tr><td>20xSSPE 缓冲液</td><td>Amresco</td><td>0810-4L</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4390</td><td>配制成 10% 储存液，勿高压灭菌，最多保存 1 周后使用</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>配制成 0.5 M 溶液，调节 pH 至 8.0 后高压灭菌</td></tr><tr><td>N-(3-二甲基氨基丙基)-N&amp;#8242;-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750</td><td>使用前立即配制 20 ml 16% 溶液，含 3.2 g EDAC 和 18 ml 超纯水</td></tr><tr><td>BiodyneC 0.45 &amp;mu;m 尼龙膜 20x20 cm</td><td>Pall Corporation</td><td>74480C</td><td></td></tr><tr><td>去离子纯化水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Pyroneg 去污剂</td><td>Johnson Diversey</td><td>HH12291</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-过氧化物酶偶联物</td><td>Roche Group</td><td>11 089 153 001</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL 检测试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2105</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL 检测试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2105</td><td></td></tr><tr><td>OHP 透明胶片</td><td>Corporate Express</td><td>EXP 504 OHP</td><td></td></tr><tr><td>Amersham hyperfilm ECL 高性能化学发光胶片 18x24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1.&lt;/strong&gt; mPCR/RLB 检测中使用的耗材。</td></tr><tr><td>Hybaid Shake&amp;rsquo;n&amp;rsquo;Stack 烤箱（2 台），带滚动瓶和尼龙分离网</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBSNSRS220</td><td>只要能在使用前维持溶液温度在 42&amp;#x00B0;C 和 60&amp;#x00B0;C，也可使用单台烤箱完成本方法</td></tr><tr><td>Belly Dancer 摇床平台</td><td>Stovall Life Sciences, IBI Sciences</td><td>Euro BDbo</td><td></td></tr><tr><td>Miniblotter</td><td>Immunetics</td><td>MN100-45</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抽吸装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>曝光暗盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z36,009-0</td><td></td></tr><tr><td>X 射线胶片显影仪</td><td></td><td></td><td>也可在暗室中使用显影液、定影液和水盘代替自动显影仪。也可使用化学发光成像仪代替 X 射线胶片</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 2.&lt;/strong&gt; mPCR/RLB 检测所需设备。</td></tr></tbody></table>

多重pcr与反向线点杂交分析（mpcr/rlb）

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

多重PCR/反向斑点杂交检测技术可在一次多重PCR反应后，通过探针与尼龙膜的杂交，实现对43个样本中多达43个分子靶标的检测，且尼龙膜可重复使用。探针在5'端经氨基修饰，以便固定于膜上；引物在5'端经生物素修饰，从而可通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶与化学发光底物反应，利用感光膜检测杂交后的PCR产物。该技术设备投入和耗材成本低，单个样本检测费用约为2美元，通量高（可同时处理多张膜），且周转时间短（约10小时）。 
该技术可通过多种方式加以应用。可设计多个探针以检测单个扩增产物内的序列变异，也可同时扩增多个产物，并使用一个（或多个）探针进行后续检测。在单个检测中亦可结合使用这两种方法。由于能够针对单个靶序列包含多个探针，该检测具有高度特异性。
多重PCR/反向线性杂交（mPCR/RLB）已发表的应用包括检测抗生素耐药基因1,2、对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌3-5和沙门氏菌sp6进行分型、肺炎链球菌7,8、无乳链球菌9及肠道病毒10,11的分子血清型鉴定、分枝杆菌sp12的鉴定、生殖道13-15、呼吸道16及其他部位17病原体的检测，以及支原体的检测与鉴定18。然而，该技术具有高度通用性，其应用几乎不受限制，并不仅限于微生物的分子分析。
多重PCR/反向斑点杂交（mPCR/RLB）的五个步骤包括：a) 引物和探针设计，b) DNA提取与PCR扩增，c) 膜的制备，d) 杂交与检测，以及 e) 膜的再生。

本文描述了一种低成本、高通量的方法，可同时检测多达43个分子靶标。多重PCR/反向线性杂交（mPCR/RLB）的应用包括微生物分型以及从临床样本中检测多种病原体。

多重PCR与反向线点杂交分析（mPCR/RLB）

多重PCR/反向线点杂交法可在一次多重PCR反应中，对43个样本中的多达43个分子靶标进行检测。

本实验的总体目标是检测一组特定核酸序列的存在与否，这些序列此前已在多重PCR反应中被扩增。该目标通过以下步骤实现：首先将带有氨基标记的DNA探针固定于可重复使用的尼龙膜上；随后，将生物素标记的PCR产物与膜上固定的探针进行杂交，并与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（strep TTR in peroxidase）结合。将偶联物加入已结合的PCR产物中。接着，通过添加化学发光检测试剂并使膜接触高灵敏度X射线胶片来检测结合的PCR产物。最后，清洗膜以去除杂交的PCR产物，使其可重复用于后续实验。最终可获得结果显示，PCR产物与X射线胶片上的膜结合探针发生杂交。该技术相较于现有方法（如多重PCR结合凝胶电泳、实时PCR或微阵列）的主要优势在于通量高、相对快速、无需任何专用设备，且最重要的是成本低廉。在开始实验前，请根据本方案的书面部分配制以下溶液。为制备膜，将烘箱预热至 60 摄氏度。用 70% 乙醇清洗小型转印装置，将寡核苷酸探针用 0.5 摩尔碳酸氢钠稀释至终浓度为每微升 2 皮摩尔，体积为 200 微升。使用铅笔和直尺将尼龙膜裁剪为 15 厘米 × 15 厘米，并在膜顶部标记出 0.5 厘米的空白区域，在该区域书写实验的详细信息。将膜放入塑料袋中，加入 20 毫升新配制的 16% EDAC 溶液，室温下轻轻摇动 10 分钟。用去离子水洗涤膜 30 秒。接着，将膜放入小型转印装置中，使通道横跨膜面。然后放置支撑垫并合上印迹装置，彻底抽吸通道中的任何液体。在第1道和第45道中各加入150 µL的0.5 mol/L碳酸氢钠溶液。使用每种探针溶液 150 微升，按顺序依次填充第 2 至第 44 泳道，注意避免产生气泡。如果通道中出现气泡，保持移液器位置不动，迅速吸取溶液，使气泡上浮至移液器吸头顶部，然后重新操作。室温孵育 5 分钟。吸去探针溶液。将膜取出，在250毫升0.1摩尔氢氧化钠溶液中室温下洗涤9分钟。再用250毫升2倍SSPE溶液洗涤膜30秒。然后将膜在60摄氏度的烘箱中，用250毫升预热的2倍SSPE缓冲液（含0.1% SDS）洗涤5分钟（若不立即用于杂交）。随后在室温下用240毫升20毫摩尔EDTA溶液洗涤20分钟。最后将膜连同剩余的10毫升20毫摩尔EDTA溶液一起放入塑料袋中密封，并于4摄氏度保存。最后，用含锥形颈的洗涤剂和刷子清洗微型花器，并用清水冲洗，然后使其在多重条件下干燥。本演示未描述目标片段的PCR扩增步骤，但在杂交前必须完成PCR扩增。在开始杂交程序之前，请根据本方案的书面部分配制以下溶液。打开一个烤箱并将其温度设置为 60 摄氏度，另一个烤箱设置为 42 摄氏度。在电热板上用一个大烧杯将水加热至沸腾。用 70% 乙醇清洁小型印迹装置。将10毫升的2×SSPE 0.1%SDS分装至一个小容器中。然后在编号的离心管中，将每种PCR产物各20微升加入150微升的2×SSPE 0.1%SDS溶液中。使用泡沫塑料架将PCR产物在100°C下煮沸10分钟，随后立即置于冰上冷却至少5分钟。将膜置于60°C的烘箱中，用剩余的240毫升2×SSPE 0.1% SDS溶液洗涤5分钟。将膜放入小型转印装置中，并放置背衬垫。调整方向，使通道垂直排列。用吸管吸去微型印迹通道中的过量液体。向第一个和最后一个通道加入剩余的150微升2倍SSPE 0.1% SDS溶液。按顺序向第2至第44个通道加入煮沸后的PCR产物，注意避免产生气泡。将小型印迹装置平放在60摄氏度的烘箱中一小时，以使杂交反应发生。喷出每个通道中的液体，然后从小型印迹装置中取出膜。在60°C烘箱中，用250毫升预热的2×SSPE、0.5% SDS溶液洗涤两次，每次10分钟。用42°C的2×SSPE、0.5% SDS溶液润湿尼龙支撑膜，并用其将膜卷起。将卷好的膜放入滚轮管中，缓慢滚动以确保膜紧贴内壁表面。在42摄氏度下，将3微升辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素加入15毫升2倍SSPE、0.5% SDS溶液中，混匀后加入管中。拧紧管盖，在42摄氏度滚轴烘箱中孵育60分钟。确保滚动方向使膜不会绷紧。定期检查有无泄漏。用锥形瓶专用洗涤剂清洗迷你印迹装置，再用水冲洗，并使其干燥。从滚轴管中取出膜，在剩余的两份SSPE 0.5% SDS溶液中于42摄氏度下洗涤两次，每次10分钟。然后在室温下用两倍浓度的 SSPE 溶液洗涤两次，每次五分钟。将两个烘箱温度调至 80 摄氏度，并在其中一个烘箱中放置 500 毫升 1% SDS 溶液以预热。配制 ECL 溶液，并将膜在 ECL 检测溶液中孵育两分钟。然后将膜曝光于胶片并进行显影。若需再生膜，可重复进行不同时间（较长或较短）的曝光。用250毫升1% SDS溶液在80摄氏度下洗涤两次，每次30分钟。然后在室温下用240毫升20毫摩尔EDTA孵育15分钟。将膜用含有10毫升20毫摩尔EDTA的塑料袋密封，并在4摄氏度冰箱中保存以备将来重复使用。该图显示了多重PCR反向线点杂交实验的结果，样品1至6代表彼此之间的阳性对照。43个探针中每个至少有一个呈阳性信号。目标序列A至U均使用两种不同的探针进行检测，以最大限度提高探针的特异性。探针a1和a2代表物种特异性探针，预期在每个样本中均呈阳性，有助于确定膜上探针的方向。在膜的底部重复了一号样品。样品七和样品八为阴性对照。请注意，探针 Q1、Q2、T 一和 T 二在阴性对照中显示出信号，表明引物可能发生非特异性结合或形成引物二聚体。这些探针或引物需要进行产品重新设计，C1、D1 和 F1 在膜上出现条带拖尾现象，可能是由于链霉亲和素-过氧化物酶偶联物或化学发光底物存在一定程度的非特异性结合所致。然而，这种现象很容易与真正的阳性信号区分开来。探针 D1 和 D2 的信号强度相较于其他探针较弱。这可能是由于较大的扩增子导致扩增效率降低。最后，在多个样本中探针 J two 呈阴性而探针 J one 呈阳性，这很可能表明这些样本中 J two 结合位点发生了突变。一旦掌握该技术，从DNA提取到PCR扩增、杂交、结果解读以及膜的再生，整个过程可在10小时之内完成。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

多重PCR和反向线杂交检测（MPCR / RLB）

我们描述了一种利用寡核苷酸偶联的荧光微球对样本中微生物进行多重检测的方法。将样本中所有生物体的扩增子与一组探针偶联的微球进行杂交，然后使用Luminex或Bio-Plex仪器对每种微球进行检测，以识别微球类型及杂交信号。...

使用寡核苷酸偶联荧光微球在复杂临床和环境样本中进行细菌多重检测

在本视频中，我们演示双通道数字PCR（ddPCR）技术——这是传统PCR技术的一种改进方法，可用于同时检测两种不同的遗传标志物。单个PCR反应被分割成纳升级大小的乳化液滴，每个液滴独立进行扩增，通过检测部分液滴中不同颜色的荧光扩增信号，计算出目标序列的初始浓度。...

双重数字PCR同时定量双基因标志物

我们展示了一种简单的多重PCR检测方法，用于快速筛查和分型耐甲氧西林Staphylococcus...

多重PCR检测法用于对耐甲氧西林Staphylococcus aureus中I至V型葡萄球菌染色体Mec元件进行分型

线性扩增介导PCR——遗传元件的定位与未知侧翼DNA的表征

基因报告基因检测是一种成熟且强大的工具，用于解析DNA序列与其基因调控活性之间的关系。将候选调控元件与携带可识别序列标签的报告基因相偶联，可实现这些检测的大规模平行化。...

在培养的哺乳动物细胞中进行大规模平行报告基因分析

本文提供了一种利用实时重组酶聚合酶扩增技术定量DNA样本初始浓度的实验方案，该方法可使用热循环仪或显微镜配合载物台加热器进行。同时介绍了内参阳性对照的构建方法。此外，提供了用于处理原始实时荧光数据的脚本。...

建立一种带有内参阳性对照的定量重组酶聚合酶扩增检测方法

本方案描述了一种小型即用型卡盒的制备方法，该卡盒可用于单次检测中对多种核酸进行可视化检测，操作简便。该方法采用毛细管阵列，实现对转基因目标物的多重、高效检测。...

毛细管阵列中多种核酸的可视化检测

目前用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒的多重诊断方法需要复杂的样品制备过程和昂贵的仪器设备，难以在资源有限的环境中应用。我们展示了一种基于等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针的诊断方法，可高灵敏度、高特异性地检测并区分这些病毒。...

基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

本方案描述了在膜片钳记录后进行单细胞多重逆转录聚合酶链式反应所需的关键步骤和注意事项。该技术是一种简单而有效的方法，可用于分析通过膜片钳记录所鉴定的单个细胞中预设基因集的表达谱。...

膜片钳后单细胞多重逆转录聚合酶链式反应

本文介绍了基于重组酶的等温扩增反应和基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）反应的预混、冻干试剂的逐步制备方法，可用于检测传染病病原体的核酸生物标志物或其他感兴趣的遗传标志物。...

基于CRISPR的现场快速诊断技术及其预混冻干试剂

本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。...

利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

学习多重PCR和反向线杂交检测方法，用于同时检测多达43种分子靶标。该技术具有高通量、低成本的优势，适用于临床样本中多种病原体的快速鉴定和微生物分型研究。

多重PCR与反向线点杂交分析（mPCR/RLB）

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