小鼠骨髓来源树突状细胞的制备及其使用Qdot纳米晶体的标记用于示踪研究

本实验的总体目标是利用量子点纳米晶体为成像研究制备树突状细胞。首先从小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞，随后在存在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的条件下建立骨髓细胞培养体系，以促进其分化为树突状细胞。

然后，在培养八天后从骨髓细胞培养物中回收树突状细胞。该实验步骤的最后一步是用荧光量子点纳米晶体对细胞进行染色。最终，可通过荧光显微镜观察到明显染色的树突状细胞。

与使用GFP标记树突状细胞等其他方法相比，该技术的主要优势在于，量子点纳米晶体即使在经丙酮等有机溶剂染色后仍能保持其荧光特性。该方法有助于解答树突状细胞生物学领域中的一些关键问题，例如这些细胞在不同疾病状态下或特定疾病背景下的迁移特性。本次染色实验操作将由我实验室的研究生Maria Ali进行演示。

处死后，从两只小鼠身上仔细解剖出胫骨和股骨，注意不要切断骨端。然后用纸巾轻轻清除附着在骨骼上的所有组织，注意避免折断骨骼。操作在生物安全柜中进行。

用70%乙醇填充一个35毫米的培养皿，然后将骨骼浸入乙醇中消毒10分钟。消毒完成后，从乙醇中取出骨骼，转移至新的培养皿中静置晾干5分钟。接着，在股骨中段进行剪切，并从胫骨最细的末端处剪断。

使用无菌注射器向骨组织内部注入1毫升RPMI培养基。将细胞悬液收集至15毫升离心管中，并用RPMI培养基洗涤两次，每次在4°C条件下，以300 × g离心10分钟，离心机需配备水平转子。最后一次洗涤后，将细胞重悬于2毫升CK裂解缓冲液中，在室温下孵育5分钟，以去除红细胞。

接着，加入13毫升含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基，用相同的离心条件在此培养基中再洗涤细胞两次。计数细胞，并将细胞浓度调整为每毫升2 × 10⁵个细胞。在含10% FBS的RPMI培养基中加入重组小鼠G-M-C-S-F，使其终浓度为20纳克/毫升。

然后将10毫升该悬浮液加入无菌微生物级10厘米培养皿中进行培养。将细胞悬浮液置于二氧化碳培养箱中。三天后，向每个准备好的培养皿中再加入10毫升RPMI，其中添加10%胎牛血清（FBS）以及20纳克/毫升重组小鼠G-M-C-S-F。

三天后，从每个培养皿中回收10毫升细胞悬液，在相同条件下离心细胞，将沉淀重悬于与从培养皿中回收时相同体积的含10%胎牛血清的RPMI培养基中，并补充新鲜的重组小鼠G-M-C-S-F。最后，将细胞悬液返回至各自的原始培养皿中，在二氧化碳培养箱中继续培养两天。培养八天后，用新鲜培养基冲洗培养皿，收集悬浮细胞及 loosely adherent 细胞。

然后使用Q tracker 655细胞标记试剂盒对收集的细胞进行标记，严格按照生产商说明书操作，用10纳米浓度的Q纳米晶体标记5×10⁶个小鼠骨髓来源的树突状细胞。首先，在离心管中混合试剂盒组分A和B各5微升，并在室温下孵育5分钟。然后加入1毫升含10%胎牛血清的RPMI培养基，并涡旋震荡30秒。

接着，将5 × 10⁵个悬浮于0.5毫升含10%FBS的RPMI培养基中的Dcs加入离心管中，于37°C条件下在D溶液中孵育细胞60分钟。然后在相同条件下，用含10%FBS的RPMI培养基洗涤细胞两次，再将细胞沉淀重悬于RPMI培养基中。

该图展示了一例树突状细胞（dcs）的荧光显微照片。标记完成后，立即将一滴标记过的细胞置于载玻片上，并加盖盖玻片。随后使用荧光显微镜对样品进行观察。

在此图中，可见标记为体外成熟48小时后的树突状细胞（DCs）的荧光显微照片。将DCs在二氧化碳培养箱中的载玻片培养室中，用100纳克/毫升LPS和20纳克/毫升TNF-α培养48小时。随后，样品用PBS洗涤，丙酮固定，DPI复染，并使用荧光显微镜进行观察。

通过流式细胞术分析体外成熟的标记树突状细胞（dcs）。Q点染色的细胞在FL3通道中产生强信号，而未染色的Q点细胞无此信号。此外，树突状细胞还用针对成熟标志物CD86和CD40的特异性抗体以及同型对照抗体进行染色，随后通过流式细胞术分析细胞。此外，还测定了成熟Q点染色树突状细胞及其对照组上清液中IL-6和一氧化氮的水平。

此处展示了一张在解剖组织中标记的树突状细胞（DCS）的代表性图像。将成熟的DCS通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内，三天后处死小鼠并收集脾脏。

将样本用OCT包埋后迅速冷冻，并使用冷冻切片机制备8微米切片。随后用丙酮固定样本，用DPI复染，再通过荧光显微镜进行观察。按以下步骤操作。

为了回答其他问题，例如树突状细胞在不同成熟刺激下的迁移情况，还可以采用抗原呈递或使用不同刺激物诱导成熟等其他方法。