用于增强保存哺乳动物耳蜗柯蒂器官细胞结构的振动切片法

以下实验的总体目标是尽可能保持耳蜗柯蒂器官的细胞结构完整性进行成像。通过使用振动切片机对分离并固定的内耳进行切片，可在减少每耳蜗切割面数量的同时获得较厚的切片，从而实现上述目标。随后对振动切片进行免疫组织化学染色，以识别柯蒂器官中多种细胞类型及细胞结构。

接下来，将切片进行贴片，并通过共聚焦显微镜成像，以获得高分辨率图像，从而确定每个较厚的Vibram切片中各Z轴位置。该方法获得的结果能够在最大程度减少切片过程干扰的情况下，实现对耳蜗柯蒂器官内细胞和结构的共聚焦显微观察。与现有的石蜡包埋和冷冻切片等方法相比，该技术的主要优势在于最大限度地减少了对耳蜗的物理损伤，从而更好地保存了柯蒂器官的细胞结构。为了分离内耳，首先使用刀片将已处死的成年小鼠断头。

沿中线打开颅骨，然后用镊子小心地取出脑组织以暴露双侧耳部，挖出两侧内耳。将内耳浸入含有新鲜4%多聚甲醛的冻存管中，在4°C下轻轻振荡过夜。次日，用一倍磷酸盐缓冲液（PBS）更换三次溶液以洗去固定液，将成年组织在4°C下用10% EDTA孵育五天进行脱钙处理。

用一倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗内耳，并将其保存在其中，直至准备进行后续处理。通过将琼脂糖加入一倍浓度的PBS中并微波加热至琼脂糖完全溶解，制备4%的低熔点琼脂糖溶液。将熔化的琼脂糖置于55摄氏度水浴中保温，待用。

用镊子从 PBS 中取出内耳，将其置于可剥离模具的底部。吸去残留液体，然后向模具中加入 mol 和 aros，完全覆盖内耳，以便获得通过柯蒂器官的横切面。放置内耳时，应使其侧向朝上，以显示外半规管。

可视角度为内耳的耳蜗最尾端区域所形成的线与预期切面平面呈45度角。待琼脂糖凝固后，剥去塑料模具。使用剃刀切去多余的琼脂糖，修整成一个立方体。

确保留有足够的周围琼脂糖，以充分支撑组织。切片时，使用超级胶水将琼脂糖块的底面固定在振动切片机的切割表面，以 40 至 100 微米的厚度进行切片，并用镊子将切片收集到含有 0.1% Triton X-100 的一倍 PBS 溶液的培养皿中。

将组织切片从周围组织中分离。使用带有宽口吸头的移液器将切片转移至含有0.1% Triton X-100的新鲜PBS溶液的培养皿中，并在组织培养板中进行抗体染色。抗体染色完成后，将组织切片贴附于显微镜载玻片上。

为防止压碎厚组织切片，将一层真空脂涂抹成方形，围绕切片放置，以在盖玻片与载玻片之间留出空间。将组织切片转移至显微镜载玻片上。用力按压盖玻片边缘，以形成密封。

或者，在盖玻片将要接触的四个角处，每处点加一微升经高效液相色谱纯化的、已知网目大小的树脂微点，然后盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘，再进行成像。在共聚焦显微镜对耳蜗组织切片进行的第一幅图像中，可观察到内毛细胞、相邻的内毛细胞、外毛细胞以及德特细胞。当进行核染色时，柱细胞可通过S100抗体染色显示，呈黄色。随着显微镜以3微米为步长逐层扫描切片，可通过观察其细胞核的出现与消失来计数柱细胞的数量。

观看本视频后，您应充分了解如何使用振动切片机对内耳进行切片，如何对这些切片进行免疫组织化学染色，以及如何通过共聚焦显微镜成像。这一简便的通用方法适用于任何抗体，可最大程度地保持柯蒂氏器的细胞结构完整性。