Name: Vibratome切片增强保尔蒂哺乳动物器官的细胞构筑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学习使用振动切片技术对小鼠内耳进行切片，结合免疫组织化学和共聚焦显微镜成像，最大程度保留耳蜗柯蒂氏器的细胞结构，实现细胞类型的精确识别与定量分析。

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作者感谢儿童研究所影像核心设施在共聚焦显微镜方面的支持，以及张健博士关于使用琼脂糖珠固定切片的建议。本研究由美国国立卫生研究院（N.I.H.）资助项目DC010387提供经费支持。

1. 内耳的分离与固定
<ol>
 <li>为分析耳蜗器官中的细胞排列模式，处死相应发育阶段的胚胎或成年个体。</li>
 <li>解剖取出包含膜迷路内耳的耳囊。在小鼠中，该操作可于胚胎第14.5天（E14.5）及以后阶段轻松完成，其中E0.5定义为检测到阴道栓的当天。耳囊的解剖首先通过断头并在中线处打开颅骨实现。移除脑组织以暴露双侧耳结构（图1A）。使用镊子（如Dumont #5，图1B）可完整地将内耳壳出。若需对耳蜗器官进行成像，则无需仔细去除与耳囊相关的所有神经和结缔组织。</li>
 <li>将完整的内耳组织浸入4%多聚甲醛（PFA）中，在4°C条件下轻轻振荡固定过夜，使用1.8 ml带螺帽的NUNC Cryo-tube管或其他适当大小的容器。PFA溶液应使用ddH20新鲜配制，然后储存于-20°C备用。</li>
 <li>次日，用1X磷酸盐缓冲液（PBS）更换三次溶液以洗去固定剂。组织可在无菌1X PBS中保存数天至数月，直至进行后续处理。对于成年组织，需在4°C条件下用10% EDTA（0.27 M）脱钙5天，随后用1X PBS冲洗并储存。</li>
 
</ol>

2. 切割振动切片机切片

<ol>
 <li> 在1× PBS中配制4%低熔点琼脂糖。将低熔点琼脂糖加入1× PBS中，微波加热至琼脂糖完全溶解。注意防止溶液沸腾溢出，加热过程中应定期取出并旋转混匀。将溶液置于55°C水浴中保温，待用。</li>
 <li>用镊子将内耳从1× PBS溶液中取出，放置于Peel-A-Way包埋模具底部。用移液器吸除模具中多余的1× PBS。加入足量液态4%低熔点琼脂糖，完全覆盖组织（图2A）。</li>
 <li>将内耳调整至合适的切片平面。为获得良好的柯蒂氏器横切面，可参照耳囊在头内原位的位置进行定位，并在横断面上进行切片。对于E14.5胚胎至成年样本，应将内耳侧向放置，使外半规管可见（图2B）。调整内耳角度，使耳囊后侧边缘形成的直线与预定切面大致呈45度角（图2A、B）。当耳囊背侧位于上方时，耳蜗基底回应位于下方（箭头所示，图2B），前半规管（asc）应位于上方（图2B）。</li>
 <li>琼脂糖在室温下30分钟内即可凝固。将含有包埋组织的Peel-A-Way模具转移至4°C冰箱中，待切片前使用。若需次日切片，应加入1× PBS覆盖模具中的琼脂糖，并将模具置于含有浸有1× PBS湿滤纸的盒子中保存。</li>
 <li>剥去塑料模具。使用剃刀片切割出包含内耳组织的琼脂糖块。注意确保切面平整，并与琼脂糖块另一侧平行，该侧面将作为琼脂糖块粘附固定的表面。由于琼脂糖不会渗入组织内部，因此不应过度修剪组织周围的琼脂糖，以保证组织得到充分支撑。</li>
 <li>使用速干胶将琼脂糖块粘附于切片台表面。</li>
 <li>使用振动切片机以40至100 μm厚度进行切片。将切片收集于盛有1× PBS、0.1% Triton X-100的组织培养皿中。图2C显示了耳蜗螺旋结构的代表性切片。</li>
 <li>用镊子小心剥离组织表面的琼脂糖。琼脂糖不会穿透组织，仅附着于内耳外表面。</li>
 <li>如需要，可使用带有大孔口的移液器吸头收集无琼脂糖残留的切片组织，以避免组织过度剪切。若需对多个不同组织进行多种抗体染色，可将切片分置于16孔或24孔组织培养板中进行管理。</li> 
</ol>
3. 抗体染色振动切片
继续进行抗体染色。将组织切片置于溶液中以整体装片、游离漂浮的方式处理。以下是以耳蜗柯蒂氏器支柱细胞的S100标记物为例的抗体染色方案，但该方案适用于任何抗体。除非另有说明，所有洗涤步骤均在室温下进行。
<ol>
 <li>在多孔组织培养皿中，将游离切片在 PBT（1X PBS、1% 牛血清白蛋白、0.1% Triton X-100）中轻轻振荡孵育 30 分钟。</li>
 <li>吸除旧溶液，将游离切片在含正常山羊血清的 PBT（50 μl NGS / 1 ml PBT）中轻轻振荡封闭 30 分钟。</li>
 <li>吸除旧溶液，加入用 PBT + NGS 稀释的一抗（S100 抗体按 1:200 比例稀释），于 4°C 轻轻振荡孵育过夜。</li>
 <li>吸除一抗溶液，用 PBT 洗涤 3 次，每次 5 分钟，随后再用 PBT 洗涤 4 次，每次 30 分钟。</li>
 <li>用 PBT + NGS 封闭 30 分钟。</li>
 <li>加入用 PBT + NGS 稀释的荧光标记二抗（山羊来源），于 4°C 轻轻振荡孵育过夜，或在室温下孵育数小时，同时保持轻柔振荡。</li>
 <li>吸除二抗溶液，用 PBT 洗涤 3 次，每次 5 分钟，随后再洗涤 4 次，每次 30 分钟。</li>
 <li>吸除最后一次 PBT 洗涤液，替换为含有核复染剂的合适水溶性封片介质。</li>
</ol>
4. 在载玻片上贴附切片并进行共聚焦显微镜观察
为防止盖玻片压碎厚切片，在封片单个切片时，必须在载玻片与盖玻片之间插入垫片。以下是两种厚切片振动切片法的封片替代方法：
<ol>
 <li>
 <ol type="a">
 <li>可通过在组织切片周围呈方形涂抹一圈真空脂来创建间隔层。这样，当放置盖玻片时，其边缘将被真空脂密封。用拇指按压盖玻片边缘，使其牢固地粘附在载玻片上。若真空脂在盖玻片所有边缘处均整齐且均匀分布，则密封程度足以用于倒置共聚焦显微镜观察。</li>
 <li> alternatively，可使用已知网目尺寸的琼脂糖层析树脂（如 Affi-Gel Blue Gel，Bio-Rad）创建间隔层。用移液器将 1 μl 树脂分别点样于载玻片上的四个角，这些位置即为盖玻片的放置位置。在四个树脂点中间滴加一份组织切片及封片介质，然后加盖盖玻片。若使用倒置共聚焦显微镜，需用指甲油将盖玻片密封固定于载玻片上。</li> 
 </ol> 
 </li>
 <li>利用共聚焦显微镜获取染色后振动切片机切片的光学断层图像。为定量分析耳蜗柯蒂氏器内的各类细胞，应以特定步长（1.5 至 3 μm 之间）获取 z 轴层扫图像（z-stack）。切片应使用核染料进行复染（步骤 3.8）。共聚焦图像采集完成后，可在任意计算机屏幕上进行观察。通过在 z 轴层扫图像中逐层观察细胞核的出现与消失，可手动计数细胞数量。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
通过染色显示存在于柱细胞和Deiters细胞中的S100蛋白，并用核染料进行复染的振动切片机切片的代表性共聚焦z轴层扫图像（图3A-F）。每个图均为以3 μm步长采集的共聚焦图像，其中图A为最接近振动切片表面的光学切片，图F为位于振动切片最内部的光学切片。耳蜗器的形态结构基本保持完整，特别是柱细胞的胞质突起未见断裂。通过观察柱细胞核在z轴层扫图像中（图3A至3F）的出现与消失，可分别计数内柱细胞和外柱细胞的数量（见图3A-F中的计数标注）。由于每张共聚焦图像中每种细胞类型的数量较少，该方法可用于对耳蜗器内大多数细胞类型进行计数。
<img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="蛙类内耳解剖结构；标注的解剖图像显示半规管和耳蜗结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 包裹在耳囊中的完整15周龄成年个体的内耳。（A）右侧耳囊（用括号标示）包裹于颅骨内，从脑组织移除后自颅内视角观察，前方朝右。（B）从颅骨中分离后的完整15周龄内耳。左侧内耳的外侧面可见，右侧内耳的内侧面可见。标签指示前半规管（asc）、耳蜗（co）和卵圆窗（ow）的位置。
<img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="内耳切片过程；切面、解剖图、显微图像；教学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. (A) 来自一只15周龄成年个体的完整内耳，置于Peel-Away模具中央的琼脂糖中。图中所示为预定切片平面。(B) 15周龄完整内耳在包埋前的放大图像。部分周围骨组织已被解剖移除，以便更清晰地观察膜迷路。图中勾画出水平半规管（lsc）、前半规管（asc）和耳蜗（co）（白色曲线）。耳蜗基回（箭头）及预定切片平面（虚线）已标出。(C) 耳蜗的代表性横切面。在一个耳蜗导管的横切面上，柯蒂器官（oC）用方框标出，血管纹（sv）用方括号标出，前庭膜（Rm）已指明。
<img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="耳蜗结构细胞免疫荧光；不同深度的内毛细胞、外毛细胞示意图；S100蛋白。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. P21野生型小鼠的柯蒂氏器。（A-F）对经S100抗体染色的柯蒂氏器进行连续共聚焦成像，步长为3 μm，以显示柱细胞和德伊特细胞。从系列图像起始到结束，内侧和外侧柱细胞的数量已编号。缩写：IHC（内毛细胞）、aIHC（相邻内毛细胞）、OHC（外毛细胞）、PC（柱细胞）、DC（德伊特细胞）。

<ol><li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li>
<li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li>
<li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li>
<li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li>
<li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li>
<li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty2%2C+a+mouse+deafness+gene%2C+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li>
</ol>

动物实验按照威斯康星医学院动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南和规定进行。

使用振动切片机切片，随后进行免疫组织化学染色和共聚焦成像，可实现耳蜗柯蒂氏器的可视化观察，同时将组织损伤降至最低。显然，从振动切片内部区域获取的共聚焦图像显示出优异的细胞形态保存效果，其局限性仅来源于固定过程中产生的假象。尽管偶尔可观察到细胞结构的破坏（如柱细胞胞质突起的断裂，未展示），但靠近振动切片两个切割表面区域所获得的共聚焦图像通常与内部区域的图像难以区分。该方法操作简便，所需主要设备——振动切片机和共聚焦显微镜——均为大多数研究人员普遍可及的常规仪器。此外，该方法适用于任何在柯蒂氏器中能产生特异性染色的抗体。实际上，该方法的主要限制因素正是抗体的特异性，因此可能需要对本方案的第3步进行适当调整，以确保特定抗体能够产生特异性染色信号。综上所述，本文介绍了一种简便且通用的方法，适用于各类抗体，可最大限度地保存并分析柯蒂氏器的细胞组织结构。

<table><tbody><tr><td>Leica VT1000S 振动刀片切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 包埋模具</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986 或 18646A</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>S100</td><td>Dako</td><td>Z0311</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11036</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>YO-PRO-1</td><td>Invitrogen</td><td>Y3603</td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>S41718</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301</td><td></td></tr></tbody></table>

用于增强保存哺乳动物耳蜗柯蒂器官细胞结构的振动切片法

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

哺乳动物的柯蒂氏器是由机械感觉毛细胞和非感觉支持细胞构成的高度有序的细胞镶嵌结构 （详见文献1,2）。要观察这种细胞排列结构，通常需要对柯蒂氏器进行横切。特别是柱细胞和德伊特尔细胞等非感觉细胞，其细胞核位于毛细胞的基底部，若不横切柯蒂氏器则无法观察到。然而，哺乳动物柯蒂氏器精细的细胞结构，包括柱细胞和德伊特尔细胞纤细的细胞质突起，很难通过常规组织学方法（如石蜡切片和冷冻切片）得以完好保存，而这些方法通常需与标准免疫组织化学染色技术相兼容。
本文描述了一种简单且可靠的实验流程，包括耳蜗的振动切片、这些振动切片的整体免疫组织化学染色，以及随后的共聚焦显微镜观察。该方法已广泛用于多种器官的免疫组织化学分析，包括小鼠肢芽、斑马鱼肠道、肝脏、胰腺和心脏（参见3-6中的部分示例）。此外，该方法在胚胎和成年小鼠的柯蒂氏器突变体与对照组中，均成功实现了支柱细胞成像及数量定量分析7。然而，目前该方法尚未被广泛应用于哺乳动物柯蒂氏器的研究。本文阐述了该方法在更好地保存成年柯蒂氏器精细细胞结构以及实现多种细胞类型定量方面的潜力。

本文描述了一种简单的振动切片机切取耳蜗柯蒂器官组织，随后进行免疫组织化学染色和共聚焦显微镜观察的实验方法。该方法可更好地保存哺乳动物耳蜗柯蒂器官精细的细胞结构，从而实现对不同类型细胞的准确定量分析。

哺乳动物的柯蒂氏器是由机械感觉毛细胞和非感觉支持细胞构成的高度有序的细胞镶嵌结构（详见综述1,2）。……的可视化

以下实验的总体目标是尽可能保持耳蜗柯蒂器官的细胞结构完整性进行成像。通过使用振动切片机对分离并固定的内耳进行切片，可在减少每耳蜗切割面数量的同时获得较厚的切片，从而实现上述目标。随后对振动切片进行免疫组织化学染色，以识别柯蒂器官中多种细胞类型及细胞结构。接下来，将切片进行贴片，并通过共聚焦显微镜成像，以获得高分辨率图像，从而确定每个较厚的Vibram切片中各Z轴位置。该方法获得的结果能够在最大程度减少切片过程干扰的情况下，实现对耳蜗柯蒂器官内细胞和结构的共聚焦显微观察。与现有的石蜡包埋和冷冻切片等方法相比，该技术的主要优势在于最大限度地减少了对耳蜗的物理损伤，从而更好地保存了柯蒂器官的细胞结构。为了分离内耳，首先使用刀片将已处死的成年小鼠断头。沿中线打开颅骨，然后用镊子小心地取出脑组织以暴露双侧耳部，挖出两侧内耳。将内耳浸入含有新鲜4%多聚甲醛的冻存管中，在4°C下轻轻振荡过夜。次日，用一倍磷酸盐缓冲液（PBS）更换三次溶液以洗去固定液，将成年组织在4°C下用10% EDTA孵育五天进行脱钙处理。用一倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗内耳，并将其保存在其中，直至准备进行后续处理。通过将琼脂糖加入一倍浓度的PBS中并微波加热至琼脂糖完全溶解，制备4%的低熔点琼脂糖溶液。将熔化的琼脂糖置于55摄氏度水浴中保温，待用。用镊子从 PBS 中取出内耳，将其置于可剥离模具的底部。吸去残留液体，然后向模具中加入 mol 和 aros，完全覆盖内耳，以便获得通过柯蒂器官的横切面。放置内耳时，应使其侧向朝上，以显示外半规管。可视角度为内耳的耳蜗最尾端区域所形成的线与预期切面平面呈45度角。待琼脂糖凝固后，剥去塑料模具。使用剃刀切去多余的琼脂糖，修整成一个立方体。确保留有足够的周围琼脂糖，以充分支撑组织。切片时，使用超级胶水将琼脂糖块的底面固定在振动切片机的切割表面，以 40 至 100 微米的厚度进行切片，并用镊子将切片收集到含有 0.1% Triton X-100 的一倍 PBS 溶液的培养皿中。将组织切片从周围组织中分离。使用带有宽口吸头的移液器将切片转移至含有0.1% Triton X-100的新鲜PBS溶液的培养皿中，并在组织培养板中进行抗体染色。抗体染色完成后，将组织切片贴附于显微镜载玻片上。为防止压碎厚组织切片，将一层真空脂涂抹成方形，围绕切片放置，以在盖玻片与载玻片之间留出空间。将组织切片转移至显微镜载玻片上。用力按压盖玻片边缘，以形成密封。或者，在盖玻片将要接触的四个角处，每处点加一微升经高效液相色谱纯化的、已知网目大小的树脂微点，然后盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘，再进行成像。在共聚焦显微镜对耳蜗组织切片进行的第一幅图像中，可观察到内毛细胞、相邻的内毛细胞、外毛细胞以及德特细胞。当进行核染色时，柱细胞可通过S100抗体染色显示，呈黄色。随着显微镜以3微米为步长逐层扫描切片，可通过观察其细胞核的出现与消失来计数柱细胞的数量。观看本视频后，您应充分了解如何使用振动切片机对内耳进行切片，如何对这些切片进行免疫组织化学染色，以及如何通过共聚焦显微镜成像。这一简便的通用方法适用于任何抗体，可最大程度地保持柯蒂氏器的细胞结构完整性。

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