卵巢和输卵管的三维器官培养的海藻酸钙凝胶
June 20th, 2011
正常细胞在其三维背景的文化代表了一种替代方法研究所需的细胞转化和肿瘤的早期事件。这种方法是用来种植正常的卵巢和输卵管细胞研究在卵巢癌的形成早期事件。
该程序将正常卵巢和 od 韧性上皮细胞的增殖描述为三维器官培养。首先，从小鼠身上解剖卵巢 UCT 脂肪垫和部分子宫。然后取出滑囊，用一对镊子解剖 vid 韧性膜，将每个卵巢或 UCT 切成两到四块，称为类器官。
最后，将类器官封装在一块网状纤维上的藻酸盐液滴中。由于在成分明确的培养基中培养的 OSC 和 TEC 在其天然三维结构中保留了正常的细胞特性。组织切片上的免疫组织化学、RNA 分析和蛋白质分析可以深入了解 OSC 和 TEC 对卵巢癌的影响。
与传统的二维永生化细胞培养相比，该技术的主要优点是细胞可以在与底层细胞外基质和基质细胞接触时生长，而没有可能改变细胞通路的遗传永生。这种方法可以帮助回答卵巢癌领域的关键问题，例如定义癌症形成的早期事件并确定浆液性卵巢癌是从哪种细胞类型产生的。虽然这种方法可以提供对卵巢癌的了解，但它也可以应用于其他系统，例如卵巢卵泡培养和胰腺 β 孔培养。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在不损害卵巢和 UCT 的情况下去除滑囊和 UC 膜是具有挑战性的。首先，在无菌 PBS 中制备 0.5% 海藻酸盐溶液，并通过倒置或摇动混合加热至 37 摄氏度。然后用 25 号针头将藻酸盐吸入 1 毫升注射器中，并保持 37 摄氏度。
接下来，制备 10 毫摩尔氯化钙溶液，用于在组织包膜时交联藻酸盐，并加热至 37 摄氏度。此外，在 24 孔板中每孔制备 1 毫升培养基，因为每个实验在培养基中包括各种药物、肽或病毒。解剖动物的器官时，去除任何脂肪或残留组织。
轻轻拉下卵巢周围的车针膜，将器官一分为二，轻轻解开输卵管组织，将卵巢或 UCT 切成四块。拉开连接膜，沿相反方向伸展管子的末端。使用镊子。
切割前，将一个约 2 微升的藻酸盐液滴放在消毒的网状纤维上。使用无菌镊子，将一块器官移动到藻酸盐液滴中，并将液滴居中以倒置含有类器官的液滴。翻转网状纤维，让重力迫使藻酸盐在含有 10 毫摩尔氯化钙溶液的培养皿边缘的悬滴中。
敲击镊子，使液滴落入溶液中。孵育 2 分钟。用含有孔隙的无菌勺子去除，以释放额外的 10 毫摩尔氯化钙，并转移到培养基中培养一段规定的时间。
为了溶解藻酸盐凝胶，以 3.4 毫克/毫升孵育培养物。溶于 ovitz 中的藻酸盐裂解酶为 L 15。培养基在 37 摄氏度下放置 30 分钟或直到凝胶完全溶解。
然后从藻酸盐裂解酶中取出组织。现在要收集 OSE，在 ovitz ISS 中将类器官与 500 单位的胶原酶一起孵育。L 15 培养基以中等功率以 2 秒脉冲涡旋 1 小时，持续 1 分钟，然后 1 秒。
脉冲 1 分钟。让器官碎片落到微量离心管的底部，并将 supernat 移液到新鲜的无菌微量离心管中，以 3000 RPM 的速度离心 3 分钟，以沉淀卵巢表面上皮。最后，为了收集输卵管上皮，纵向切开试管并放在组织培养塑料上 3 到 5 天。
细胞将从输卵管基质中爬出，并在组织培养塑料上生长。在选定的时间点重新交叉从培养基中收集藻酸盐封装的珠子。将培养物滴入无菌的 10 毫摩尔氯化钙溶液中 2 分钟，连接藻酸盐以使凝胶变硬。
现在，固定藻酸盐包裹的器官，确保凝胶在固定过程中保持固体并完全包裹组织。可以培养在塑料表面上生长不佳的细胞类型，例如 OSC。使用这种方法并促进对正常细胞过程或癌症形成的最早事件的研究。
在显微镜下，去除滑囊和周围的脂肪垫并加工成孵育的藻酸盐封装类器官。在培养基中。OSC 用手术刀修复切口受伤的表面，作为时间和距离的函数。
使用细胞角蛋白 8 抗体的免疫组织化学分析表明，与切成四分之一或八分之一的卵巢相比，切成两半的卵巢更完全地包裹了卵巢。使用石蜡切片可以轻松监测组织结构、细胞形态和特异性细胞生长速率。例如，在无血清 MEM 中培养 7 天后观察到单层卵巢表面上皮。
而每毫升添加 5 微克胰岛素 7 天会诱导卵巢表面上皮过度增殖和多层细胞的形成。在这里，在 CDNA 转染后，通过海藻酸盐凝胶和标准显微镜观察绿色荧光蛋白的免疫荧光。虽然藻酸盐器官培养提供了卵巢表面上皮和原代卵泡的生长和分析，但应该注意的是，成熟的次级卵泡无法在该培养系统中存活。
可以使用酶降解从整个器官或特定细胞类型中分析蛋白质或 RNA 的改变。用胶原酶处理培养的卵巢类器官可保持底层基质完整，同时允许在处理后获得的细胞沉淀中富集卵巢表面上皮。如果执行得当，这种技术可以在一到两个小时内完成。
在尝试此程序时，请务必记住始终保持无菌。在此程序之后，可以执行其他方法，例如免疫组织化学、蛋白质印迹和转录阵列，以回答其他问题，例如细胞形态和组织结构如何促进早期转化事件。看完这个视频，你应该对如何进行卵巢和输卵管三维藻酸盐培养有一个很好的了解。
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概述
本研究提出了一种在三维器官培养中传播正常卵巢和输卵管上皮细胞的方法。这种方法使研究人员能够在保持细胞的原生结构的同时，研究卵巢癌形成的早期事件。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 肿瘤学
- 器官培养技术
背景
- 正常细胞可以在三维环境中培养。
- 这种方法有助于研究细胞转化和肿瘤发生。
- 由于其复杂性，卵巢癌是一个重要的研究领域。
- 理解癌症形成的早期事件对于开发治疗方法至关重要。
研究目的
- 在三维培养中培养正常的卵巢和输卵管细胞。
- 研究导致卵巢癌的早期事件。
- 在培养过程中保留正常细胞特征。
使用的方法
- 小鼠卵巢和UCT脂肪垫的解剖。
- 从解剖组织中创建类器官。
- 将类器官包裹在藻酸盐水滴中。
- 使用免疫组织化学、RNA和蛋白质分析来获得见解。
主要结果
- 正常细胞特征在三维培养中得以保留。
- 可以获得关于OSC和TEC对卵巢癌影响的见解。
- 免疫组织化学和分子分析提供了宝贵的数据。
- 这种方法为研究卵巢癌提供了新的视角。
结论
- 三维培养方法对研究卵巢细胞是有效的。
- 它允许研究癌症形成的早期事件。
- 这种方法可能增进对卵巢癌生物学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Three-dimensional alginate hydrogel organ culture enables disease-relevant modeling of ovarian and oviductal tissues, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery. This system preserves native tissue architecture and cell interactions, facilitating predictive confidence in studies of early cancer initiation and biomarker development. The approach enhances translational continuity by allowing direct interrogation of primary cells from genetically engineered models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of early transformative events in ovarian cancer using primary, non-immortalized cells.
- Supports mechanistic de-risking by maintaining native extracellular matrix and stromal interactions.
- Facilitates functional validation of candidate targets in a physiologically relevant context.
- Permits use of knockout and transgenic mouse models for pathway clarification.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for quantitative analysis of protein and RNA outputs from organ cultures.
- Supports reproducible preparation of multiple organoid cultures from a single animal, increasing experimental throughput.
- Enables standardized introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules for functional screening.
- Allows assessment of tissue-specific responses to candidate compounds or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for biomarker discovery and validation.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation using primary tissue models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling early disease processes in vitro.
- Permits analysis of tissue architecture and cellular morphology relevant to human disease.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and mechanistic studies in a three-dimensional, physiologically relevant system.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway interrogation in primary ovarian and oviductal tissues.
- Screening: Provides assay-ready organoid cultures for quantitative and reproducible analysis.
- Analytics: Delivers protein, RNA, and morphological readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges early discovery with preclinical validation through disease-relevant tissue models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to other tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early cancer research.
- Operational Value: Standardizes tissue culture and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection and three-dimensional culture techniques.
- Needs access to sterile instrumentation, alginate handling, and analytical platforms for protein and RNA analysis.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility across experiments and models.
- Adaptation to other organ systems may require protocol optimization for tissue-specific viability.
- Limited survival of mature secondary follicles may restrict certain applications, as supported by source data.
