Name: 卵巢和输卵管的三维器官培养的海藻酸钙凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学习使用海藻酸钙凝胶进行卵巢和输卵管的三维器官培养技术。该方法可在保留细胞天然三维结构的同时培养正常卵巢和输卵管上皮细胞，有助于研究卵巢癌早期形成事件。

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本研究工作得到了卵巢癌研究基金［资助号 LT/UIC/01.2011］、伊利诺伊大学芝加哥分校临床与转化科学中心、伊利诺伊大学芝加哥分校癌症中心以及美国国立卫生研究院资助项目 C06RR15482 的支持。
动物实验严格遵循美国实验动物管理评估和认证协会（AAALAC）制定的指南和规定，并经伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理与使用委员会批准的动物护理方案实施。本项目所用动物饲养于芝加哥伊利诺伊大学生物资源实验室（BRL）的屏障环境中。BRL配备有完整的兽医团队，每天至少对动物进行两次监测，并提供动物护理方面的专业建议。

1. 卵巢解剖与组织分离
<ol>
	<li>制备0.5% (w/v)的海藻酸钠溶液，采用先前描述的方案5进行改良，使用无菌PBS并加热至37°C。通过倒置或摇动混合，切勿涡旋。用25 G针头将海藻酸钠吸入1 ml注射器中，并保持在37°C。</li>
	<li>制备10 mM无菌CaCl2溶液，用于组织包封过程中海藻酸钠的交联，并预热至37°C。</li>
	<li>每项实验在24孔板中每孔准备1 mL培养基（αMEM + 5单位青霉素和5 μg/mL链霉素）。在培养基中加入各种药物、多肽或病毒。若需在器官包封前进行转染，将组织与Lipofectamine 2000和质粒DNA在37°C下孵育4小时。</li>
	<li>从动物体内解剖出器官，去除所有脂肪或残留组织，轻轻剥离包裹卵巢的囊膜，并通过将器官纵向切开的方式将卵巢或输卵管切成四部分。动物通过CO2窒息安乐死后，再行颈椎脱位。对于输卵管，先用镊子轻轻拉开连接膜，并将管状结构两端向相反方向拉伸，再进行切割。</li>
	<li>将单滴海藻酸钠溶液（约1–3 μL）滴加至灭菌的网格纤维上。</li>
	<li>使用无菌镊子将一块器官组织移入海藻酸钠液滴中，并用镊子或无菌针头将组织置于液滴中央。</li>
	<li>用无菌镊子夹住网格纤维，将含有组织块（类器官）的液滴翻转，使其倒置，利用重力使海藻酸钠形成悬滴。</li>
	<li>将镊子轻敲于含有10 mM CaCl2溶液的10 cm培养皿边缘，使液滴落入溶液中。</li>
	<li>孵育2分钟，用带孔的无菌小勺取出凝胶以去除多余的10 mM CaCl2，然后转移至培养基中。每个含培养基的24孔板孔中最多可转移四个海藻酸钠凝胶。在设定的时间段内进行培养。</li>
</ol>
2. 藻酸盐的降解与细胞收集
<ol>
	<li>为溶解海藻酸盐凝胶，将培养物在含有溶藻胶裂解酶（3.4 mg/ml）的Leibovitz's L-15培养基中孵育 37°C 30 分钟，或直至凝胶完全溶解。</li>
	<li>从藻酸盐裂解酶中取出组织。</li>
	<li>为收集卵巢类器官上清液（OSE），将类器官置于含有500单位胶原酶的Leibovitz's L-15培养基中孵育1小时8以中等功率涡旋振荡，先以2秒脉冲（涡旋2秒，静置2秒）持续1分钟，随后以1秒脉冲（涡旋1秒，静置1秒）持续1分钟。让组织碎片沉降至微量离心管底部，用移液器将上清液转移至新的无菌微量离心管中。在3000 rpm条件下离心3分钟，以沉淀卵巢表面上皮细胞。</li>
	<li>为收集输卵管上皮，将输卵管沿纵轴切开，置于含5单位青霉素的DMEM培养基中的组织培养塑料器皿上 5 μg/ml 链霉素和4% (v/v) 胎牛血清。在3-5天内，细胞将从输卵管间质中“爬出”并在组织培养塑料表面生长9。</li>
</ol>
3. 用于石蜡切片的海藻酸盐包埋器官培养物的固定
<ol>
	<li>在选定的时间点，从培养基中收集海藻酸盐包封的微珠。</li>
	<li>将培养物滴入无菌的 10 mM CaCl2 溶液中，持续两分钟，以重新交联海藻酸盐，使凝胶硬化。</li>
	<li>使用含有 50 mM 蔗糖、10 mM CaCl2 和 50 mM 二甲胂酸钠的 2% 多聚甲醛溶液固定海藻酸盐包封的器官，以确保凝胶在固定过程中保持固态并完全包封组织。</li>
	<li>在组织处理完成后，将整个海藻酸盐包封的器官培养样本包埋于石蜡中，并用切片机切片，获得 5 μm 厚的切片。</li>
	<li>若进行免疫组织化学染色，由于基于加热的抗原修复步骤，海藻酸盐将被溶解并从载玻片上移除；而在常规的苏木精-伊红染色中，海藻酸盐将保留并被伊红染色。</li>
</ol>
4. 典型结果：
图1展示了一个卵巢和输卵管的三维器官培养示例。卵巢可被切割成不同大小的组织块，卵巢表面上皮（OSE）会增殖并迁移，以修复手术刀切割造成的表面损伤。在此过程中，卵巢表面上皮相对于下方间质的正确空间取向得以维持，即卵巢表面上皮包裹着整个卵巢。如图2所示，被切成两半的卵巢其表面上皮对卵巢的包裹比切成四分之一或八分之一的更为完整。在完整卵巢的背景下可研究卵巢表面的损伤修复过程，这有助于阐明排卵及表面修复如何诱导卵巢表面的转化。
实验的终点取决于所需获取的信息。使用石蜡切片可方便地监测组织结构、细胞形态以及特定细胞的生长速率。例如，在无血清αMEM培养基中培养7天后，可见单层卵巢表面上皮（图3A）；而在培养基中加入5 μg/ml胰岛素培养7天，则可诱导卵巢表面上皮过度增殖，并形成多层细胞结构（图3B）。在固定前24小时向培养物中添加终浓度为10 μM的溴脱氧尿苷，可用于检测细胞增殖情况（图3A和3B插图）。在无血清αMEM培养条件下，约有3-5%的卵巢表面上皮细胞在24小时标记期内发生增殖（插图3A），而颗粒细胞的增殖比例更高。在培养基中添加胰岛素后，增殖的卵巢表面上皮细胞比例上升至总卵巢表面上皮细胞的约30%（插图3B）。在转染cDNA后，通过标准显微镜观察，可在海藻酸盐凝胶中直接检测绿色荧光蛋白（GFP）的免疫荧光信号（图3C）。尽管海藻酸盐器官培养体系适用于卵巢表面上皮和初级卵泡的生长与分析，但需注意的是，成熟的次级卵泡在此培养系统中无法存活（图3D）。个别卵泡在海藻酸盐水凝胶基质中培养至成熟的方法已在其他文献中报道10。
可以利用酶降解方法（图4），从整个器官或特定细胞类型中分析蛋白质或RNA的变化。用胶原酶处理培养的卵巢类器官时，可保留下方的间质组织完整（图4C），同时使处理后获得的细胞沉淀物中上皮细胞（OSE）得到富集，尽管也会分离出部分间质细胞（图4D）。
<img alt="显微镜下的细胞培养过程；显示组织制备、解剖和孵育步骤。" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 用于伤口后小鼠卵巢表面上皮（OSE）扩增的三维培养系统。A) 在显微镜下，去除卵巢包膜（bursa）及周围脂肪垫。B) 完整的卵巢（O），带有输卵管（T）和脂肪垫（F）。C) 去除包膜和脂肪垫后的卵巢（左）以及展开的输卵管（右）。D) 将卵巢或输卵管类器官置入海藻酸盐液滴中。E) 将包裹类器官的海藻酸盐液滴滴入 CaCl2 溶液，使海藻酸盐交联形成凝胶。F) 海藻酸盐包封的卵巢类器官。G) 海藻酸盐包封的输卵管类器官。H) 海藻酸盐包封的类器官在培养基中孵育。
<img alt="组织学组织样本，稀释倍数，组织染色强度的显微分析。" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过细胞角蛋白 8（cytokeratin 8）测定的卵巢表面再生表面积。将卵巢类器官切割为八分之一、四分之一和二分之一后，置于 BSA 培养基中培养，卵巢表面被卵巢表面上皮（OSE）包裹，通过细胞角蛋白 8（CK8）抗体进行免疫组织化学分析测定。
<img alt="组织学显微图像；组织切片、免疫染色、荧光标记分析。" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 藻酸盐培养系统允许生长因子通过并实现cDNA向卵巢表面上皮（OSE）的转染，但不支持卵泡的快速生长和成熟。A) 在基础培养基中培养7天的卵巢类器官，检测CK8表达，CK8为卵巢表面上皮（OSE）的标志物。插图：连续切片经BrdU掺入染色。B) 培养基中添加胰岛素可诱导卵巢表面上皮（OSE）增生。插图：连续切片经BrdU掺入染色。C) 卵巢类器官转染表达绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA。D) 藻酸盐培养系统支持原始卵泡（红色箭头）的生长，但不支持成熟次级卵泡（黑色箭头）的生长。
<img alt="组织切片的显微镜图像；组织学、免疫荧光、蛋白质表达分析。" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 卵巢表面上皮（OSE）可在培养后分离用于分析。A) 器官样结构在培养基中培养长达2周。B) 将包埋的器官样结构用海藻酸盐裂解酶处理，以保持器官样结构完整。卵巢组织用CK8染色以标记OSE。C) 用胶原酶处理器官样结构，以分离OSE与其下方的基质组织。剩余组织块用CK8染色，以显示卵巢表面组织的去除。D) 处理后收集的细胞经CK8染色（红色）显示富含OSE。细胞用DAPI复染以标记细胞核。

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</ol>

无任何披露内容。

利用海藻酸盐水凝胶开发三维器官培养系统，是一种用于分析多种生物来源的不同组织类型的通用方法。三维培养的应用可扩展至组织工程学和再生医学领域，因为它为细胞生长提供了支架结构11。目前，我们实验室正在开展使用人卵巢和输卵管组织的初步研究；然而，已有文献报道对人和非人灵长类动物卵泡的培养方法12,13。
使用海藻酸盐水凝胶培养类器官相较于其他类型的水凝胶（如含有胶原蛋白、纤维蛋白或透明质酸的水凝胶）具有多项优势。海藻酸盐在室温和中性pH条件下即可形成凝胶，因而在包埋类器官时对组织造成的干扰极小14。海藻酸盐不与细胞蛋白发生反应，为组织生长提供了化学惰性的支撑环境5。该凝胶可通过海藻酸盐裂解酶进行酶促降解，而该酶不会破坏被包埋的组织，从而可实现培养细胞的回收15。海藻酸盐水凝胶用于三维组织培养的一个缺点是，其通过离子交联提供的机械支撑会随时间推移而逐渐失去稳定性，因此需要限制培养时间，并在固定前对海藻酸盐重新交联5。本实验方案的关键环节包括在整个培养过程中维...

<table><tbody><tr><td>Leibovitz L-15 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#945;MEM 培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠</td><td>NovaMatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯网状纤维</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>45&quot; 宽卷；0.0041&quot; 孔径</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>A1603</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9697</td><td>来源于 &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MP Biomedicals</td><td>103700</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>Gibco</td><td></td></tr><tr><td>ITS 溶液</td><td>Roche Group</td><td>11074547001</td><td>胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠</td></tr><tr><td>细胞角蛋白 8 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>TROMA-1</td><td>使用稀释比例为 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>溴脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B50002-1G</td><td>终浓度为 10 &amp;#x03BC;M</td></tr></tbody></table>

用于卵巢和输卵管三维器官培养的海藻酸盐水凝胶

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

卵巢癌是女性癌症死亡的第五大原因，在美国的死亡率为63%1。目前尚不清楚卵巢癌的起源细胞类型，可能是卵巢表面上皮（OSE），也可能是输卵管伞部的远端上皮2,3。将正常细胞在体外进行原代培养，可使科学家建立特定变化的模型，从而明确导致卵巢癌发生的特定上皮细胞类型，最终确定其起源细胞类型。这将有助于开发更精确的生物标志物、具有组织特异性基因改变的动物模型，以及针对该疾病的更有效的预防策略。
将正常细胞维持在海藻酸盐水凝胶中，可促进细胞在三维环境下的短期体外培养，并允许导入质粒DNA、siRNA和小分子。通过使用手术刀进行有策略的切割，将器官切成小块进行培养，可从单个器官获得多个培养样本，从而增加单只动物可开展的实验数量。这些切口可模拟排卵过程中的某些特征，引发卵巢表面上皮（OSE）增殖，而该过程与卵巢癌的形成相关。对于在塑料表面不易生长的细胞类型（例如OSE），本方法尤为适用，有助于研究正常细胞活动或癌症发生的最初事件4。
海藻酸盐水凝胶可用于支持多种类型组织的生长5。海藻酸盐是一种线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的重复单元组成，可通过钙离子交联，产生温和的凝胶化作用，不会损伤组织6,7。与其他三维细胞培养基质（如Matrigel）类似，海藻酸盐为组织提供机械支撑；然而，蛋白质不与海藻酸盐基质发生反应，因此海藻酸盐可作为合成的细胞外基质，不启动细胞信号传导5。海藻酸盐水凝胶可在标准细胞培养基中漂浮，并支持组织在体外的结构生长in vitro。
本文介绍了一种将卵巢和输卵管器官组织制备、分离并包埋于海藻酸盐水凝胶中的方法，该器官培养物可维持培养长达两周。同时描述了通过酶解法释放细胞，以分析器官培养物中的蛋白质和RNA样品。最后，该方法无需基因永生化即可实现小鼠原代细胞类型的生长，使研究人员能够使用基因敲除小鼠和转基因小鼠进行研究。

在三维环境中培养正常细胞是研究细胞转化和肿瘤发生早期事件的替代方法。该方法用于培养正常的卵巢和输卵管细胞，以研究卵巢癌形成过程中的早期事件。

卵巢癌是女性癌症死亡的第五大原因，在美国的死亡率为63%1。其起源细胞类型为……

该方案描述了将正常卵巢和输卵管上皮细胞作为三维类器官进行培养的步骤。首先，从小鼠体内分离出卵巢、输卵管脂肪垫以及部分子宫组织。随后去除包膜，用镊子分离输卵管膜结构，并将每个卵巢或输卵管切成两至四段，称为类器官（organoids）。最后将类器官包裹在网状纤维片上的海藻酸盐液滴中。由于在特定培养基中培养的卵巢干细胞（OSC）和输卵管上皮细胞（TEC）可保持其天然三维结构中的正常细胞特性，因此通过对组织切片进行免疫组织化学分析，以及对RNA和蛋白质进行分析，可深入了解OSC和TEC在卵巢癌中的作用。与传统的二维永生化细胞培养相比，该技术的主要优势在于，细胞可以在不进行基因永生化的情况下，与底层的细胞外基质和基质细胞直接接触生长，从而避免因基因永生化而改变细胞信号通路。该方法有助于解答卵巢癌研究领域中的关键问题，例如明确癌症发生的早期事件，以及确定浆液性卵巢癌起源于哪种细胞类型。尽管该方法主要用于研究卵巢癌，但也可应用于其他体系，如卵巢卵泡培养和胰腺β细胞团培养。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为去除滑膜囊和尿囊绒毛膜而不损伤卵巢和尿囊绒毛膜蒂具有挑战性。首先，配制0.5%的海藻酸钠无菌PBS溶液，并加热至37摄氏度，通过倒置或摇动混合均匀。然后，用25号针头将海藻酸钠溶液吸入1毫升注射器中，并保持在37摄氏度。接下来，配制10毫摩尔的氯化钙溶液，用于在组织包封时交联海藻酸盐，并将溶液预热至37°C。同时，每个实验在24孔板中每孔准备1毫升培养基，培养基中可包含各种药物、多肽或病毒。从动物体内解剖器官时，应去除所有脂肪或残留组织。用镊子轻轻剥离包裹卵巢的包膜，将卵巢或输卵管（UCT）沿器官中线切开，分为四份，以轻柔地展开输卵管组织。分开连接的膜组织，并将管状结构的两端向相反方向拉伸。使用镊子操作。切割前，将约两微升的海藻酸盐液滴置于已灭菌的网状纤维上。用无菌镊子将一块组织放入海藻酸盐液滴中，并调整液滴位置，使包含类器官的液滴翻转至下方。将网状纤维翻转，利用重力使海藻酸盐液滴落入含有10毫摩尔氯化钙溶液的10厘米培养皿边缘，形成悬滴。轻敲镊子，使液滴落入溶液中。孵育两分钟。用无菌多孔勺取出，以去除多余的10毫摩尔氯化钙，并转移至培养基中培养一段确定的时间。为了溶解海藻酸盐凝胶，将培养物在含有3.4毫克/毫升海藻酸盐裂解酶的Ovitz L-15培养基中，于37°C孵育30分钟，或直至凝胶完全溶解。然后将组织从藻酸盐裂解酶中取出。现在为了收集OSE，将类器官与500单位的胶原酶在Ovitz ISS. L 15培养基中孵育一小时，以中等功率每两秒涡旋振荡一次，持续一分钟，随后静置一秒。脉冲震荡一分钟。待器官碎片沉降至微量离心管底部后，将上清液转移至新的无菌微量离心管中，以3000 RPM离心三分钟，以沉淀卵巢表面上皮细胞。最后，为收集输卵管上皮细胞，将输卵管沿纵轴切开，置于组织培养塑料皿上，培养三至五天。细胞将从输卵管间质中爬出，并在组织培养塑料表面生长。在选定的时间点，从培养基中收集藻酸盐包封的微珠。将培养物放入无菌的10毫摩尔氯化钙溶液中孵育两分钟，使藻酸盐交联，从而硬化凝胶。现在，固定海藻酸盐包埋的器官，确保凝胶在固定过程中保持固态并完全包埋组织。对于在塑料表面不易良好生长的细胞类型（如OSC），可利用此方法进行培养，并有助于研究正常细胞过程或癌症形成的早期事件。在显微镜下，切除滑囊及其周围脂肪垫，并处理成海藻酸盐包埋的类器官，于培养基中孵育。口腔鳞状细胞（OSC）随时间和距离逐渐修复了手术刀切口造成的创面。使用细胞角蛋白8抗体进行的免疫组织化学分析表明，与切成四分之一或八分之一的卵巢相比，将卵巢切成两半能更完全地包埋卵巢组织。利用石蜡切片可方便地监测组织结构、细胞形态以及特定细胞的生长速率。例如，在无血清MEM培养基中培养七天后，可观察到单层卵巢表面上皮细胞。虽然添加每毫升五微克胰岛素培养七天可诱导卵巢表面上皮的过度增殖，并形成多层细胞。在此，通过标准显微镜观察，在cDNA转染后可透过海藻酸盐凝胶观察到绿色荧光蛋白的免疫荧光信号。尽管海藻酸盐器官培养体系可用于卵巢表面上皮和初级卵泡的生长与分析，但需注意成熟的次级卵泡在此培养系统中无法存活。通过酶解法，可从整个器官或特定细胞类型中分析蛋白质或RNA的变化。用胶原酶处理培养的卵巢类器官时，可保持其下方的间质结构完整，同时使处理后获得的细胞沉淀中富集卵巢表面上皮细胞。若操作得当，该技术可在一至两小时内完成。在进行该操作时，必须始终注意保持无菌状态。完成该操作后，可进一步开展其他方法，如免疫组织化学、蛋白质印迹和转录组分析，以回答更多问题，例如细胞形态和组织结构如何参与早期转化事件。观看本视频后，您应能够充分掌握卵巢和输卵管三维海藻酸盐培养的操作方法。

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