一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

本实验的总体目标是更清晰地观察厚脑片中的荧光神经元。首先将脑组织嵌入气溶胶插件支架中，以实现这一目标。实验的第二步是在压缩切片机上将脑组织切成厚片。

该实验步骤的第三步是使用甘油梯度对脑切片进行光学透明化处理。最后一步是将透明化后的脑切片固定在载玻片上，用于荧光成像。最终，可通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜获得高分辨率的荧光蛋白报告基因在厚脑切片神经元中表达的结果。

与现有的薄切片、连续荧光显微镜或多光子成像等方法相比，该技术的主要优势在于其速度更快、劳动强度更低，且无需昂贵或复杂的显微镜技术。首先，获取经心脏灌注完成NC双重固定，并在4°C下后固定1至2小时的小鼠脑组织。接下来，配制2%高浓度低凝胶点琼脂糖溶液于PBS中，并在微波炉中加热至完全溶解。

将融化的琼脂转移至试管中，放入40摄氏度的加热块中平衡温度。在琼脂平衡的同时，用胶水将固定的脑组织粘附在样本注射器的推杆上。使用Sano Aate胶水将已固定的组织浸入饱和蔗糖PBS溶液中，以包被脑组织表面，然后将推杆推入推杆套筒内。用移液器将温热的琼脂注入推杆内，完全覆盖脑组织，同时确保不引入任何气泡。

最后，用冰冷的冷却块夹住样本注射器约一分钟。为设置 aros，将含有包埋脑组织的样本注射器安装到压缩的 home 中。将刀片边缘与样本注射器的出口紧密对齐，然后用 PBS 填充缓冲液储液罐。

旋转千分尺。向前调节切片厚度，将包埋的脑组织从样本注射器中推出。要生成第一张切片，请按下控制单元上的启动按钮。

重复推进包埋组织并按下启动按钮，以获得所需数量的切片。使用移液管收集切片，并将其转移至含有 PBS 的玻璃孵育小瓶中。吸去大部分 PBS，加入含 10% 甘油的 PBS 溶液。将小瓶置于台式旋转摇床中，4 °C 轻柔振荡，直至切片完全沉降。

通过重复倾倒和更换甘油溶液，依次使用25%、50%和75%的甘油溶液继续逐步透明处理。用移液管吸除75%甘油溶液，并替换为90%甘油溶液。注意避免引入任何气泡，并在4°C下轻轻摇动使其平衡。

现在切片已达到最大程度的透明化，它们将不再下沉，而是表现出中性浮力。使用镊子将双面胶裁剪成开口矩形，留出2至3毫米的边框，以适配25乘75毫米显微镜载玻片的可视区域。将脑切片整齐排列在载玻片的边框范围内。

轻轻将盖玻片放置在粘性胶带上，注意避免产生气泡，并施加适当压力以形成密封。用移液工具吸去多余的甘油，然后用透明指甲油封固盖玻片边缘。待封固完全干燥后，可将载玻片置于载玻片盒中，在4摄氏度下保存或直接进行成像。

立即使用落射荧光显微镜进行观察。在小鼠脑组织200微米厚的冠状切片中，可观察到表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP）的病毒载体的表达模式。此处，通过共聚焦显微镜对落射荧光图像中高亮区域进行高分辨率成像，以显示第五层皮层中的单个神经元。

观看本视频后，您应能充分掌握如何制备固定的大脑厚切片，以进行快速且高分辨率的荧光成像。