一个快速高分辨率的荧光成像的方法在半厚的脑片

在这里，我们描述了一个快速和简单的的方法，形象荧光标记的细胞在半厚的脑片。通过固定，切片，和光清除脑组织中，我们介绍了如何标准啶或共焦成像可用于个人完整的神经组织内的细胞和神经网络的可视化。

该程序的总体目标是更容易地可视化厚脑切片内的荧光神经元。这是通过首先将大脑嵌入 aeros 插头支架来实现的。该程序的第二步是在压缩的书上将大脑切成厚片。

该程序的第三步是在甘油梯度中光学清除脑切片。该程序的最后一步是将清除的脑切片安装到载玻片上进行荧光成像。最终，可以通过 epi 荧光或共聚焦显微镜获得显示高分辨率荧光蛋白报告基因在厚脑切片内的神经元中表达的结果。

与薄片、连续荧光显微镜或多光子成像等现有方法相比，该技术的主要优点是它更快速、劳动强度更低，并且不需要昂贵或复杂的显微镜技术。首先取回通过心脏灌注进行 NC 2 固定并在 4 摄氏度下后固定 1 到 2 小时的小鼠脑组织。接下来，在 PBS 中制备 2% 高强度低胶点 agro 溶液，并在微波炉中加热直至溶解。

将熔融的 agros 转移到试管中，并放置一个 40 摄氏度的加热块以平衡温度，同时 agros 平衡将固定的脑组织粘在样本注射器的柱塞上。使用 Sano Aate 胶水将封固的组织浸入饱和的蔗糖 PBS 溶液中，以涂覆大脑表面，然后将柱塞向下拉入柱塞外壳。将温暖的 aros 移液到柱塞中，完全覆盖脑组织，同时确保不引入任何气泡。

最后，用冷冷却块夹住样本注射器约一分钟。要设置 aros，请将包含嵌入脑组织的标本注射器组装到压缩的家中。将刀片的边缘与样品注射器的出口紧密对齐，然后用 PBS 填充缓冲罐。

旋转千分尺。一旦切片厚度向前，以将嵌入的脑组织从标本注射器中挤出。要生成第一个切片，请按下控制单元上的开始按钮。

重复推进包埋组织并按下开始按钮以生成所需数量的切片的过程。用移液管收集切片，并将其转移到装满 PBS 的玻璃吸入瓶中，从收集的切片中移出大部分 PBS，并用 PBS 溶液中的 10% 甘油替换。在台式旋转摇床上以 4 摄氏度轻轻摇动样品瓶，直到切片下沉。

通过 25 50 和 75% 甘油溶液重复倾析和重新填充过程，继续逐渐清除。吸出 75% 甘油溶液，用 90% 甘油替换。小心不要引入任何气泡，并在 4 摄氏度时轻轻摇晃以平衡。

现在，切片已被最大程度地清除，它们将不再下沉，而是显示中性浮力。使用一对镊子将双面胶粘剂切成具有 2 到 3 毫米边界的开放矩形，以适应 25 x 75 毫米显微镜载玻片的可视区域。将脑切片排列在幻灯片的边框内。

轻轻地将盖玻片放到胶带上。小心不要引入气泡并施加压力以形成密封，吸出任何多余的甘油，然后用透明指甲油密封盖玻片的边缘。密封件干燥后，载玻片可以存放在 4 摄氏度的载玻片盒中或进行成像。

立即使用 epi 荧光显微镜。表达增强型 GFP 的病毒载体的表达模式可以在小鼠脑组织的 200 μm 厚的冠状切片中看到。在这里，使用共聚焦显微镜以高分辨率显示落射荧光图像的突出显示区域，以揭示单个第 5 层皮质神经元。

观看此视频后，您应该对如何准备固定到厚的脑切片以进行快速和高分辨率的荧光成像有很好的了解。