一个快速高分辨率的荧光成像的方法在半厚的脑片
2011年7月26日
在这里，我们描述了一个快速和简单的的方法，形象荧光标记的细胞在半厚的脑片。通过固定，切片，和光清除脑组织中，我们介绍了如何标准啶或共焦成像可用于个人完整的神经组织内的细胞和神经网络的可视化。
本程序的总体目标是更容易地在厚脑切片中可视化荧光神经元。这是通过首先将大脑嵌入气溶胶堵塞剂持有器中来实现的。该程序的第二步是在压缩的托姆上将大脑切成厚切片。
该程序的第三步是在甘油梯度中光学清除脑切片。该程序的最后一步是将清除的脑切片装载到载玻片上以进行荧光成像。最终，可以通过表观荧光或共聚焦显微镜获得结果，显示厚脑切片中神经元内的高分辨率荧光蛋白报告基因表达。
与现有的薄切片、串联荧光显微镜或多光子成像等方法相比，该技术的主要优势是它更快、更少劳动强度，并且不需要昂贵或复杂的显微镜技术。首先，取经过NC双重固定的小鼠脑组织，通过心脏灌流固定，并在4摄氏度下后固1至2小时。接下来，在PBS中制备2%高强度低凝胶点农溶液，并在微波炉中加热至溶解。
将熔融的农转移到试管中，将固定的脑组织粘贴到试剂瓶活塞上。用Sano Aate胶水将安装的组织浸入饱和蔗糖PBS溶液中以包裹大脑表面，然后将活塞拉入活塞壳体中。将温暖的农液体吸入活塞中，完全覆盖脑组织，同时确保不引入任何气泡。
最后，用冷却块将试剂瓶夹持约一分钟。为了设置农，将包含嵌入脑组织的试剂瓶组装到压缩的主体中。将刀片边缘与试剂瓶出口紧密对齐，然后用PBS填充缓冲液罐。
旋转微米表。一旦切片厚度向前推出嵌入的脑组织，从试剂瓶中排出。要生成第一片切片，按下控制单元上的开始按钮。
重复推进嵌入组织和按下开始按钮的过程，以生成所需数量的切片。用移液管收集切片，并将它们转移到装满PBS的玻璃吸入小瓶中，从收集的切片上移去大部分PBS，并用PBS中10%的甘油溶液替换。在四摄氏度下，在旋转摇床上轻轻摇晃瓶子，直到切片沉入。
继续逐步清除，重复进行煎取和重新注入过程，使用25、50，然后75%的甘油溶液。移去75%的甘油溶液，并用90%的甘油替换。小心不要引入任何气泡，并在四摄氏度下进行温和摇晃以平衡。
现在切片已经被最大程度地清除，它们将不再沉入，而是显示中性浮力。使用镊子将双面胶纸切成一个开放的矩形，边界为2至3毫米，以适应25 x 75毫米显微镜载玻片的可视区域。在载玻片上的边界内安排脑切片。
轻轻将盖玻片放在粘贴胶带上。小心不要引入气泡，并施加压力以创建密封，吸走多余的甘油，然后用清漆涂抹盖玻片边缘以密封。一旦密封干燥，载玻片可以在四摄氏度下存储在载玻片盒中或进行成像。
立即使用表观荧光显微镜。在小鼠脑组织的200微米厚冠状切片中可以看到表达增强型GFP的病毒载体的表达模式。在这里，表观荧光图像中突出显示的区域，使用共聚焦显微镜以高分辨率显示单个五层皮层神经元。
观看完此视频后，您应该对如何准备固定的厚脑切片以进行快速和高分辨率的荧光成像有了良好的理解。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
Overview
This article presents a method for imaging fluorescently labeled neurons in semi-thick brain slices. The technique involves fixing, slicing, and optically clearing brain tissue to enable visualization of individual cells and neuronal networks using standard imaging methods.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Cell Biology
- Imaging Techniques
Background
- Fluorescent imaging is crucial for studying neuronal structures.
- Thick brain slices pose challenges for visualization.
- Optical clearing techniques enhance imaging quality.
- Standard microscopy methods can be applied to cleared tissues.
Purpose of Study
- To simplify the visualization of fluorescent neurons in thick brain slices.
- To demonstrate a method that allows for high-resolution imaging.
- To provide a protocol that can be easily replicated in research settings.
Methods Used
- Embedding brain tissue in an aeros plug holder.
- Sectioning the brain into thick slices using a compressed tome.
- Optically clearing slices in a glycerol gradient.
- Mounting cleared slices onto slides for imaging.
Main Results
- High-resolution images of fluorescent protein expression in neurons.
- Successful visualization of neuronal networks within thick slices.
- Compatibility with both epifluorescent and confocal microscopy.
- Demonstration of the effectiveness of the imaging technique.
Conclusions
- The method provides a rapid and effective way to visualize neurons.
- It enhances the ability to study neuronal networks in intact tissue.
- This approach can be beneficial for various neuroscience research applications.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Agarose Embedding of Fixed Mouse Brain Tissue
1:55
Sectioning the Embedded Brain Tissue Using the Compresstome
2:33
Optical Clearing of the Brain Tissue Sections
3:14
Mounting the Brain Tissue Sections for Imaging
3:53
Epifluorescent and Confocal Microscopy of Intact Thick Brain Slices
4:16
Conclusion
