利用活体成像实时评估肿瘤中纳米颗粒的摄取

本实验的总体目标是利用活体成像技术定量分析纳米颗粒在肿瘤中的摄取情况。首先需要进行禽类胚胎的脱壳与培养，第二步是在绒毛尿囊膜（CAM）上建立异种移植肿瘤，并使其生长约一周时间。

该实验步骤的第三步是将纳米颗粒通过静脉注射到鸡胚中，并对异种移植肿瘤进行实时活体共聚焦成像。最后一步是切除肿瘤并进行切片。最终，通过图像定量分析肿瘤对纳米颗粒的摄取情况，并可进一步开展肿瘤的二次分析。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于能够生成高分辨率图像，从而在显微水平上评估纳米颗粒在肿瘤中聚集的动力学过程。此外，利用该模型系统，单名研究人员可在两周内分析大量实验组。另外，雪伦贝谢胚胎的科里类胚膜易于进行物理操作和无创成像。

我的实验室致力于开发用于癌症靶向分子成像和药物递送的纳米颗粒。为了寻找一种快速且低成本的异种移植模型以进行详细的摄取分析，我们采用了改良的鸡胚壳模型。在此，我们利用高分辨率活体成像技术，在改良的鸡胚壳模型中评估纳米颗粒在人肿瘤异种移植中的摄取情况。

本方案中，于第4天准备并剥壳处理受精的鸡胚。采用标准方法，通过观察心跳确认胚胎已受精且具有活性，并在38摄氏度、相对湿度不低于60%的条件下继续孵育，直至胚胎发育至第9天，此时即可进行肿瘤细胞接种。

通过将18号针头与一段5至6英寸长的特氟龙管连接到1毫升注射器上，组装一个微型注射器。小心地将针头斜面插入管中，使约4至5英寸长的管子从针头尖端伸出。

现在，将肿瘤细胞悬液通过导管吸入注射器中，并将注射器倒置。轻轻敲击注射器侧面，同时下压推杆以排出所有气泡。接着，在导管末端连接一根显微注射玻璃针头，下压推杆直至细胞悬液到达针尖。

现在，在解剖显微镜下，缓慢而小心地将 10,000 至 100,000 个癌细胞注入绒毛尿囊膜的间质空间内。细胞应在绒毛尿囊膜内形成可见的团块；附着在绒毛尿囊膜表面的细胞可用无尘纸或棉签轻轻蘸拭去除。随后，将胚胎放回 38 摄氏度、湿度至少为 60% 的培养箱中继续孵育。

允许肿瘤生长并形成血管长达七天，直至直径达到至少五毫米，然后进行成像。纳米颗粒必须用荧光染料标记，该染料需与活体显微镜兼容，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中于4摄氏度保存，至少一年内保持稳定。随后将纳米颗粒离心一分钟，以沉淀任何聚集体，再将其吸入微量注射器中。现在使用PBS稀释纳米颗粒，配制工作浓度为每毫升一毫克，最终在50微升体积中注射50微克纳米颗粒。

现在开始在胚胎发育第16天进行注射。检查肿瘤是否已充分血管化，以选择最适合的荷瘤胚胎进行静脉注射。注射一种低分子量荧光葡聚糖，其光谱特性需与肿瘤细胞和纳米颗粒明显不同。

然后在荧光显微镜下观察葡聚糖，并挑选肿瘤血管化程度最高的胚胎。选定胚胎后，使用制备好的微注射器滴加至少200 µL的制备纳米颗粒。将注射器倒置。

轻轻敲击管壁并下压推杆，以排除所有气泡。接着，将一根长锥形玻璃显微注射针插入导管末端，下压推杆，使纳米颗粒溶液到达针尖。钝头针无法穿透外胚层，而过于尖细的针在插入组织时易发生断裂。

接下来，将30至200微升的纳米颗粒通过静脉注射到胚胎中，注射部位应远离需要成像观察的一侧。在注射纳米颗粒后立即进行成像。如下一节所述，肿瘤实验的开始需先准备胚胎成像装置。首先，在盖子底面成像孔的周围均匀涂抹一层薄薄的真空脂。

然后将一个18毫米的玻璃盖玻片安装到端口上。现在将胚胎装入装置中，使盖玻片位于成像所需区域的上方。缓慢放下装置的盖子，直到盖玻片刚好接触到胚胎，然后将盖子拧紧固定。

现在将含有胚胎的培养皿放入成像单元，并加入37摄氏度的水。该单元将在转盘共聚焦荧光显微镜的旋转盘共聚焦显微镜下固定胚胎的位置。检查环境腔室温度是否为37摄氏度。

现在，将成像单元放置在载物台上，使盖玻片窗口位于显微镜物镜正下方，然后开始成像。在注射后立即以及每隔一小时，采集肿瘤及其周围血管系统的高分辨率图像序列。

此后，图像将反映出肿瘤血管系统中发生的详细结构变化。可对胚胎进行连续成像，最长可达36小时，期间无需更换水浴。为了从图像中定量分析病毒纳米颗粒的摄取情况，可使用Velocity等软件工具。

首先，选择肿瘤并将其与周围的间质区分开来。通过使用荧光葡聚糖标记肿瘤，可便于进行选择。接下来，计算纳米颗粒在肿瘤内以及相邻间质代表性区域中的平均荧光信号。

接下来，计算平均信号的比值。增强肿瘤区域相对于平均信号的选择。增强间质区域的选择。

比值大于一表明纳米颗粒优先定位于肿瘤组织。将 HT 29 结肠癌细胞注射至第九天鸡胚绒毛尿囊膜，形成直径约一毫米的团块。孵化七天后的鸡胚通过静脉注射低分子量葡聚糖，以确认肿瘤血管化情况。

静脉注射CPMV LOR 6 47或聚乙二醇化CPMV LOR 6 47纳米颗粒，随后进行高分辨率实时共聚焦成像，结果显示CPMV和聚乙二醇化CPMV纳米颗粒均能快速标记整个血管系统。注射后12小时内，对肿瘤区域与间质区域荧光信号的定量分析表明，聚乙二醇化CPMV在肿瘤中的摄取量约为普通CPMV的三倍。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在禽类胚胎模型中开展高分辨率活体成像，以评估纳米颗粒在肿瘤异种移植体中的摄取情况，具体步骤包括禽类胚胎的准备、肿瘤细胞的异种移植、纳米颗粒的静脉注射，以及通过实时活体共聚焦成像对肿瘤内纳米颗粒摄取情况进行评估。