使用CD71/TER119流流式细胞仪检测小鼠红系祖细胞的识别和分析

以下实验的总体目标是直接在小鼠新鲜收获的组织中鉴定红细胞前体。这使我们能够在这些小鼠的红细胞生成系统发生变化期间研究它们的分子特性。例如，在胚胎发育过程中或对低氧应激的反应期间，从小鼠胎儿肝脏或成人脾脏或骨髓中分离出第一个造血组织，并解离成单细胞悬液。

接下来，用针对细胞表面标志物 CD 71 和 TER one 19 的抗体标记细胞，并使用任何其他感兴趣的标志物标记细胞，例如，为了测量细胞存活或细胞周期状态，然后使用流式细胞术分析仪分析标记的细胞悬液，并鉴定处于不同成熟阶段的特异性成红细胞亚群。这些特异性亚群可以通过细胞分选进行纯化。随后，可以对每个成红细胞成熟亚群进行细胞和分子分析。

直接在新鲜分离的造血组织中识别特定成熟阶段的成红细胞的能力使我们有机会研究生理皮层中的细胞。因此，这种方法使我们能够研究不同成熟阶段的高成红细胞，在体内做出反应。当小鼠受到刺激时，它们会加速红细胞生成板条箱。

例如，模拟高海拔或注射促红细胞生成素激素的缺氧条件。我们使用多参数流式细胞术来识别复杂组织环境中的 blats，并同时研究它们的信号转导存活和细胞周期状态。我们还可以直接从新鲜组织中对成红细胞的特定成熟阶段进行分类，并探索它们的基因表达水平、染色质状态或其他分子功能。

小鼠确定性红细胞生成发生在成年小鼠的脾脏和骨髓中。因此，这些组织将从安乐死的小鼠中收获。对小鼠实施安乐死后，通过心脏穿刺将血液抽入 EDTA 或肝素采血管，这些血液稍后将用于血细胞比容计数、网织红细胞计数或 CBC 分析。

将收获的脾脏和股骨放入含有冷染色的单独管中。缓冲区。如果需要，将收获的组织放在冰上。称量脾脏。

经历红细胞生成应激反应的小鼠可能表现出脾脏重量的显着增加。随后，通过先前在小鼠胚胎中证明的程序从收获的组织制备脾细胞和骨髓细胞。最终红细胞生成发生在胚胎第 12.5 天和第 15.5 天之间，发生在胎儿肝脏中。

定时怀孕雌性小鼠准备在怀孕的第 12.5 至 14.5 天获得胎儿肝细胞。对定时怀孕的雌性小鼠实施安乐死，并将子宫角取出到含有冰的培养皿中。冷培养基或染色缓冲液。

胚胎第 12.5 天或更年轻的胚胎开始解剖胎儿肝脏，以从子宫中取出胚胎，需要解剖显微镜。首先将每个珠子从牛角上分离出来。然后轻轻切除子宫壁以释放羊膜囊内的胚胎。

轻轻撕下羊膜。胎肝是位于小得多的心脏下方的最大红色腹部组织。要解剖胎儿肝脏，请使用镊子将胚胎固定在肝脏的两侧，然后轻轻地将肝脏从腹部推出培养基中。

轻轻地将肝脏转移到含有新鲜染色缓冲液的试管中。在所有胎儿肝脏被解剖并转移到含有新鲜染色的试管中。缓冲液通过移液机械解离肝脏，然后通过 40 微米尼龙网过滤解离的细胞，通过离心洗涤细胞两次，弃去上清液并复苏悬浮在染色缓冲液中。

第二次洗涤后，用 trian blue 对细胞进行染色，并使用血细胞计数器计数。E 13.5 的胎儿肝脏大约有 10 到 7。细胞以每 200 μL 样品 10 至 6 个细胞的 1 至 2 倍重悬细胞，用于流式细胞分析。

出于本视频方案的目的，将仅在胎儿肝细胞上演示用于流式细胞术的抗体染色。要开始此程序，请制备一抗染色预混液，其中包含以下内容、用于阻断小鼠细胞 CD 71 FETR one 19 PE 中的 FC 受体的纯化兔 IgG 和针对细胞表面蛋白的抗体。将试管倒置 2 至 3 次，轻轻混合抗体溶液，将 200 微升预混的一抗染色剂加入先前制备的胎儿肝细胞样品中，轻轻上下移液以重悬细胞。

接下来，准备这 6 个对照细胞样品。一个未染色的样品，其中细胞留在染色缓冲液中以提供细胞的背景自发荧光，每种抗体的单一颜色或方案中使用的颜色，以校正通道之间的光谱重叠，在本实验中是 TUR one 19 PE CD 71 fz fast、生物素和链霉亲和素 A PC 和 7 A A DA 荧光减去一个快速生物素对照， 它为该通道提供了真正的背景，其中细胞用方案中的所有颜色或抗体染色，但快速生物素除外。将样品和相关对照品在冰上一抗染色剂中避光孵育 45 分钟至 1 小时。

孵育结束时，向每个样品管中加入 3 mL 染色缓冲液洗涤细胞，并在 4 摄氏度下以大约 400 倍重力离心 3 至 5 分钟。接下来，在 PC 中涂抹 strep avid，并将试管在冰上孵育 30 至 45 分钟。孵育完成后，按照第一次抗体染色洗涤细胞。

最后，将细胞重悬于含有细胞不渗透性的染色溶液中，DNA 染料 7 a a d 以排除死细胞。样品现在可用于流式细胞术分析。该程序最困难的方面是对流式细胞术事件进行正确的门控分析，从而能够可靠地鉴定成红细胞亚群。

它需要仔细的机器设置所有正确的对照样品，仔细补偿光谱重叠和随后的设门，以排除死细胞、聚集体和非常小的事件。在数据分析开始时。未染色样品和单色对照样品用于设置每种颜色组合的光谱重叠补偿。

在本例中，我们将展示拟合 e 荧光如何溢出到 PE 通道中，以及如何在补偿后校正这种光谱重叠。首先，使用未染色的对照，我们定义一个拟合 E 阳性和 PE 阴性区域。接下来，使用 fit E 单色控件，我们可以可视化光谱溢出到 PE 通道中。

使用 FlowJo 软件进行数字补偿后，PE 通道中的溢出拟合 E 信号被最小化。补偿后，可以去除死细胞、聚集体和小事件。通过绘制前向散射高度与前向散射区域并选择狭窄对角线门内的事件来去除聚集体和单元双峰。

通过选择对 dapi A 细胞不可渗透的 DNA 死亡阴性的细胞来去除死细胞。DAPI 阴性活细胞门还排除了非常小的事件，例如细胞核或碎片，这些事件具有非常低的前向散射。接下来，我们将展示胎儿肝细胞的设门策略。

新鲜收获的细胞标记 CD 71、TUR、one 19 和针对非红系标志物的 ZI 标记抗体混合物。在此示例中，样品已经针对光谱重叠进行了补偿，然后进行了门控以排除聚集体、死细胞和非常小的事件。我们使用包含除谱系阳性 fitzy 染色之外的所有颜色的 FMO 样品来绘制 fitzy 直方图并定义谱系阴性细胞门，接下来我们将该门应用于用 ZI 偶联谱系标记染色的胎儿肝细胞样品。

选择谱系阴性细胞，并在 Y 轴上用 CD 71 和 TER 1 19 绘制。在 A 轴上，单元格现在可以划分为子集 S 0 到 S 5。Lin 耗尽的 S 零亚群主要包含在 EPO 依赖性开始之前具有 CFUE 电位的细胞。

S 1 亚群包含主要处于细胞周期 S 期的 EPO 依赖性 CFUE 细胞。S 2 亚群细胞失去了集落形成潜力并开始表达血红蛋白 S3 亚群细胞主要是嗜碱性成红细胞 S 4 和 S 5 亚群包含晚期成红细胞。此处显示的是从用针对 CD 71 和 TER one 19 的抗体处理和标记的脾细胞以及死亡受体快速直方图处理和标记的脾细胞中采集数据的分析策略。

一个显示所有获取的事件，其中对角线门表示可能是单个单元的事件，不包括双峰或更大的聚集体。该门中的单元格在此处的直方图 2 中进一步分析。排除了非常小的事件，可能是细胞核或碎片。

门控细胞显示在直方图 3 中，其中可能是膜渗透性凋亡细胞的 DAPI 阳性细胞被排除在进一步分析之外。直方图 4 显示了活脾细胞群的结果。pro eGate 包含 CD 71 高 TER 1 个 19 个中间细胞 tur R 19 个高细胞，在直方图 5 中进一步分析。

在这里，CD 71 高细胞被细分为不太成熟的大面积、A 型成红细胞和更小、更成熟的 A B 型成红细胞。最成熟的成红细胞亚群是 ARI C.通过与 TER、R、one、19 和 CD 71 同时添加相关抗体，可以同时测量每个亚群的细胞表面蛋白表达。染色直方图 6 显示死亡受体的细胞表面表达速度快，特别是在基础状态的小鼠和注射单剂量 E ppo 的小鼠的 A 子集区域。

结果表明，EPO 抑制了该区域的快速表达。还可以测量每个亚群中细胞的细胞内蛋白的体内表达或细胞周期状态。在这种代表性的细胞周期分析中，小鼠腹膜内注射 BRDU，并在 30 至 60 分钟后收获骨髓。

除了对 CD 71 和 TER one 19 进行染色外，还对细胞进行 BRDU 掺入染色，使其复制的 D-N-A-B-R-D-U 阳性细胞处于循环的 S 期。界面细胞是 BRDU 阴性的，可以分解为 G 1 或 G 2 M 期。使用 DNAD，可以从 PRO E、区域 A、A、B 和 A EC 亚群中分选 7 个 A、D、细胞。

这里，它们在胞嘧啶制剂中显示连续成熟，细胞大小减小，核浓缩和棕色增加，反映血红蛋白表达。最后，此处显示了 E 13.5 胎肝中 S3 亚群的代表性细胞周期分析。妊娠小鼠注射 BRDU。

30 至 60 分钟后收获胎肝，固定渗透，并用抗 CD 71、TER one 19 和 BRDU 的抗体染色。在 S 期细胞所在的位置分析 S3 细胞的细胞周期状态。BRDU 阳性和 DNA 含量通过对 DNA 染料 7 A a d 进行染色来定量。

我们描述的细胞计数方法可以同时研究细胞功能，例如细胞表面标志物和其他蛋白质的表达、使用窝特异性抗体的细胞存活细胞信号传导和细胞周期状态。因此，它使我们能够研究成红细胞的分子反应、对各种刺激的不同成熟阶段或基因突变的影响。应该注意的是，流式细胞术成熟亚群是根据细胞表面标志物表达和前向散射定义的。

我们发现，一般来说，每个亚群中的细胞对应于各种小鼠模型中相似的形态成红细胞阶段。但是，我们建议在检查新的鼠标模型时验证这一点。通过对每个亚群的细胞进行分选并检查其形态，还可以对每个亚群的细胞进行分选以进行 RNA 或转录组分析，分选实验使用低分选压力和宽鼻子，以最大限度地减少对细胞的绝对压力。

我们还建议在每次分选实验后检查细胞纯度和活力。最后，当检测到给定子集的频率变化时，重要的是要确定这是由于该子集中单元格数量的真实变化，还是由于其他子集的变化。因此，除了测量子集频率外，始终还需要测量每个子集中的单元绝对数量。