利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

以下实验的总体目标是在小鼠新鲜收获的组织中直接鉴定红细胞前体细胞。这使得我们能够在小鼠红细胞生成系统发生改变的时期研究其分子特性。例如，在胚胎发育过程中或对缺氧应激反应期间，首先从小鼠胎肝、成年脾脏或骨髓中分离出造血组织，并将其解离为单细胞悬液。

接下来，细胞使用针对细胞表面标志物CD 71和TER 119的抗体以及其他感兴趣的标志物进行标记，例如用于检测细胞存活率或细胞周期状态。标记后的细胞悬液通过流式细胞仪进行分析，以鉴定处于不同成熟阶段的特定成红血细胞亚群。这些特定亚群可通过细胞分选进行纯化。随后，可对每个成红血细胞成熟亚群进行细胞和分子水平的分析。

能够在新鲜分离的造血组织中直接鉴定处于特定成熟阶段的成红细胞，使我们有机会在生理环境下研究这些细胞。因此，该方法使我们能够研究不同成熟阶段的高纯度成红细胞在体内的反应。当小鼠受到刺激时，其红细胞生成速率会加快。

例如，模拟高海拔的低氧条件或注射促红细胞生成素激素。我们采用多参数流式细胞术，在复杂的组织环境中鉴定原红细胞，并同时研究其信号转导、存活状态和细胞周期状况。我们还可以从新鲜组织中直接分选处于特定成熟阶段的原红细胞，并分析其基因表达水平、染色质状态或其他分子功能。

成年小鼠的确定性红细胞生成发生在脾脏和骨髓中。因此，将从安乐死的小鼠中采集这些组织。在处死小鼠后，通过心脏穿刺将血液采集至含EDTA或肝素的采血管中，该血液后续可用于红细胞压积计数、网织红细胞计数或全血细胞分析（CBC）。

将收获的脾脏和股骨分别放入含有冷染色缓冲液的试管中。如有需要，将收获的组织置于冰上。称量脾脏重量。

经历促红细胞生成应激反应的小鼠脾脏重量可能会显著增加。随后，通过先前在小鼠胚胎中已演示过的方法，从收获的组织中制备脾细胞和骨髓细胞。定型红细胞生成发生在胚胎第12.5至15.5天之间的胎肝中。

准备妊娠时间明确的雌性小鼠，于妊娠第12.5至14.5天获取胎肝细胞。对妊娠时间明确的雌性小鼠实施安乐死，取出子宫角并置于含有冰的培养皿中，内含冷培养基或染色缓冲液。

解剖显微镜是解剖胚胎第12.5天或更早期的胎肝以及从子宫中取出胚胎所必需的。首先将每个孕囊从角部分离出来，然后轻轻切除子宫壁，以释放位于羊膜囊内的胚胎。

轻轻剥离羊膜。胎肝是位于较小心脏下方的最大红色腹部组织。解剖胎肝时，用镊子固定肝脏两侧的胚胎组织，轻柔地将肝脏从腹腔推出至培养基中。

将肝脏轻柔转移至含有新鲜染色缓冲液的离心管中。待所有胎肝组织完成解剖并转移至含有新鲜染色缓冲液的离心管后，通过移液器进行机械性解离，随后将解离后的细胞经40微米尼龙滤膜过滤，再通过离心洗涤细胞两次，弃去上清液，最后将细胞重悬于染色缓冲液中。

第二次洗涤后，用台盼蓝对细胞进行染色，并使用血细胞计数板计数。E13.5时期的胎肝约含有10的7次方个细胞，将细胞重悬于每200 µL样本含1×10⁶至2×10⁶个细胞的溶液中，用于流式细胞术分析。

本视频实验方案仅以胎肝细胞为例演示用于流式细胞术的抗体染色。开始该操作前，配制一管初级抗体染色预混液，包含以下组分：用于阻断小鼠细胞 Fc 受体的纯化兔 IgG、CD71 FETR119 PE 抗体，以及针对细胞表面蛋白 FAST 的抗体。通过轻轻翻转离心管 2 至 3 次，温和混匀抗体溶液；将 200 微升该初级抗体染色预混液加入此前制备好的胎肝细胞样品中，再用移液器轻柔吹打数次，以充分重悬细胞。

接下来，准备以下六个对照细胞样本：一个未染色样本，即细胞置于染色缓冲液中，用于提供细胞自身的背景自发荧光；每个抗体或本实验中使用的每种荧光染料的单色对照，用于校正通道间的光谱重叠，本实验中涉及的染料包括 TUR one 19、PE、CD 71、fz fast、biotin、streptavidin、A PC 和 seven A A DA；以及 fast biotin 的荧光减一对照（fluorescence minus one control），该对照中细胞使用除 fast biotin 以外的所有荧光染料或抗体进行染色，以提供该通道的真实背景信号。将待测样本及相应的对照样本在冰上避光孵育，与一抗染色液共同作用 45 分钟至 1 小时。

孵育结束后，向每管样品中加入三毫升染色缓冲液洗涤细胞，并在4°C下以约400 × g离心3至5分钟。接着，加入链霉亲和素-藻红蛋白（strep avidin-PE），将各管置于冰上孵育30至45分钟。孵育完成后，按照第一抗体染色的相同方法洗涤细胞。

最后，将细胞重悬于含有细胞非通透性DNA染料7-AAD的染色液中，以排除死细胞。样品现可进行流式细胞术分析。该实验步骤中最困难的部分在于对流式细胞术检测事件进行准确的设门分析，从而可靠地鉴定出成红细胞亚群。

需要仔细设置仪器，准备所有正确的对照样本，仔细进行光谱重叠的补偿，并在后续设门过程中排除死细胞、细胞聚集体以及非常微小的事件。在数据分析开始时，需使用未染色样本和单色对照样本，为每种颜色组合设置光谱重叠的补偿参数。

在此示例中，我们将展示 fit e 荧光如何渗入 PE 通道，以及在补偿后如何校正这种光谱重叠。首先，使用未染色对照，我们定义一个 fit E 阳性且 PE 阴性的区域。接着，利用 fit E 单色对照，我们可以观察到光谱溢出至 PE 通道的情况。

使用 FlowJo 软件进行数字补偿后，PE 通道中的溢出拟合 E 信号被最小化。补偿完成后，可去除已死亡的细胞、聚集体以及微小事件。通过绘制前向散射光高度（forward scatter height）与前向散射光面积（forward scatter area）的散点图，并选择位于狭窄对角门控范围内的事件，从而去除聚集体和细胞双联体。

通过选择对DAPI（一种细胞不可渗透的DNA染料）呈阴性的细胞来去除死细胞。DAPI阴性的活细胞门控还可排除前向散射信号极低的微小事件，例如细胞核或碎片。接下来，我们将展示胎肝细胞的设门策略。

freshly harvested cells 被标记了 CD71 TUR 一 19 以及一组针对非红系谱系标志物的 ZI 标记抗体。在此示例中，样本已经对光谱重叠进行了补偿，随后设门以排除聚集体、死亡细胞以及极小的事件。我们使用 FMO 样本（包含除谱系阳性 fitzy 染料外的所有荧光染料）绘制 fitzy 直方图，并定义谱系阴性细胞门。接下来，我们将此门应用于经 ZI 偶联谱系标志物染色的胎肝细胞样本。

选择谱系阴性细胞，并以Y轴为CD71、A轴为TER19进行绘图。A轴上的细胞现已可被划分为S0至S5亚群。Lin耗竭的S0亚群主要包含在依赖EPO之前具有CFU-E潜能的细胞。

S1 亚群主要包含处于细胞周期 S 期的依赖促红细胞生成素（EPO）的 CFU-E 细胞。S2 亚群细胞已失去集落形成能力，并开始表达血红蛋白。S3 亚群细胞主要为嗜碱性成红细胞。S4 和 S5 亚群包含晚期成红细胞。此处展示的是对脾脏细胞进行处理并用针对 CD71 和 TER-119 的抗体以及死亡受体 Fas 的直方图进行标记后，获得数据的分析策略。

其中一个图显示了所有获取的事件，其中对角线门控代表可能是单个细胞的事件，排除双联体或更大的聚集体。该门控内的细胞将在第二个直方图中进一步分析。非常小的事件（可能是细胞核或碎片）被排除在外。

门控细胞显示在第三个直方图中，其中排除了DAPI阳性且可能具有膜通透性的凋亡细胞，不再进行后续分析。第四个直方图显示了最终获得的活脾细胞群体。前体eGate包含CD71高表达、TER-119中等表达的细胞，而TER-119高表达细胞则在第五个直方图中进一步分析。

此处，CD71高表达细胞被进一步划分为成熟度较低、面积较大的有核红细胞，以及体积较小、成熟度较高的A型和B型有核红细胞。其中最成熟的有核红细胞亚群为ARIC。可通过在染色时同时加入针对TER119和CD71的相应抗体，对上述各亚群细胞表面蛋白的表达水平进行同步检测。染色直方图六显示了在基础状态下以及单次注射Epo后的小鼠中，死亡受体Fas在A亚群细胞表面的特异性表达情况。

结果表明，EPO 抑制该区域的快速表达。还可测量每个亚群细胞中细胞内蛋白的体内表达水平或细胞周期状态。在此代表性细胞周期分析中，小鼠经腹腔注射 BRDU，30 至 60 分钟后采集骨髓样本。

除了用 CD71 和 TER119 进行染色外，还对细胞进行了溴脱氧尿苷（BrdU）掺入检测，以标记其复制中的 DNA。BrdU 阳性细胞处于细胞周期的 S 期。界面细胞为 BrdU 阴性，可进一步区分为 G1 期或 G2/M 期。利用 DNA7-AAD 染色，可从 PRO-E、Area I、Area II 和 AEC 各亚群中分选出细胞。

此处显示的是在胞嘧啶制备样本中，细胞依次成熟的过程，表现为细胞体积逐渐减小、细胞核浓缩以及棕色着色加深，后者反映了血红蛋白的表达。最后，展示了E13.5胎肝中S3亚群的代表性细胞周期分析结果。对怀孕小鼠注射了BRDU。

在30至60分钟后收获胎肝，固定、透化并用抗CD71、TER-119和BRDU抗体进行染色。分析S3细胞的细胞周期状态，其中S期细胞为BRDU阳性，DNA含量通过七氨基放线菌素（7-AAD）DNA染色进行定量。

我们所描述的流式细胞术方法能够同时检测细胞功能，例如细胞表面标志物及其他蛋白的表达、细胞存活、细胞信号转导（使用磷酸化特异性抗体）以及细胞周期状态。因此，该方法使我们能够研究红细胞前体细胞在不同成熟阶段对多种刺激或基因突变所产生的分子响应。需要注意的是，流式细胞术定义的成熟亚群是基于细胞表面标志物的表达和前向散射光信号来界定的。

我们发现，在多种小鼠模型中，每个亚群中的细胞通常对应相似的形态学红细胞阶段。然而，建议在分析新的小鼠模型时验证这一点。可通过分选各亚群的细胞并观察其形态来进行验证。此外，各亚群的细胞也可用于RNA或转录组分析；分选实验应采用较低的分选压力和较宽的喷嘴，以尽量减少对细胞的剪切应力。

我们还建议在每次分选实验后检测细胞纯度和活力。最后，当检测到某一特定亚群频率发生变化时，重要的是要确定这种变化是源于该亚群细胞数量的真实改变，还是由于其他亚群的变化所导致。因此，除了测量亚群频率外，始终有必要同时测定每个亚群中细胞的绝对数量。