Name: 使用CD71/TER119流流式细胞仪检测小鼠红系祖细胞的识别和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 32 s
Description: 学习使用CD71和TER119流式细胞术识别小鼠红系祖细胞的方法。该技术可从新鲜组织（胎肝、脾脏或骨髓）中精确分析红细胞前体的分化阶段，为研究造血发育和血液疾病提供重要工具。

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感谢马萨诸塞大学流式细胞术核心实验室：Richard Konz、Ted Giehl、Barbara Gosselin、Yuehua Gu 和 Tammy Krupoch。本工作由美国国立卫生研究院/国立心肺血液研究所（NIH/NHLBI）RO1 HL084168（M.S.）和 NIH CA T32-130807（J.R.S.）资助。研究还使用了糖尿病与内分泌研究中心资助项目 DK32520 支持的核心资源。

1. 组织的采集
<ol>
<li>准备含有 2 至 5 ml 冷染色缓冲液（含 0.2% BSA 和 5 mM 葡萄糖的磷酸盐缓冲液（PBS））的离心管。组织采集前将离心管置于冰上。</li>
<li>根据适当的批准方案处死小鼠（例如，先吸入 CO2，随后进行颈椎脱位）。</li>
<li>通过心脏穿刺将血液收集至含 EDTA 或肝素的采血管中，用于后续分析，例如 hematocrit、网织红细胞计数或全血细胞计数（CBC）分析。</li>
<li>取出脾脏和骨骼，将每只小鼠的组织分别放入步骤 1 中准备好的离心管中。从左侧可较容易地获取脾脏。对于骨髓，可采集一侧或双侧股骨。采集的组织应保持在冰上。</li>
<li>如有需要，称量脾脏重量。经历促红细胞生成应激反应的小鼠脾脏重量通常会显著增加。</li>
</ol>
2. 脾细胞的制备
<ol>
<li>使用预先润湿的3 ml注射器活塞，将脾脏或部分脾脏（理想情况下，重量不超过0.1克，相当于约108个细胞）轻轻推过置于50 ml锥形管顶部的40 μm无菌细胞筛（Fisherbrand目录号22363547或其他同类产品）。操作过程中将锥形管置于冰上。用总共2 ml染色缓冲液冲洗细胞通过细胞筛。</li>
<li>轻柔吹打滤过的细胞悬液，以分散任何细小的团块。如有必要，可再次过滤细胞。</li>
<li>通过离心洗涤细胞两次，并重新悬浮于冷缓冲液中。</li>
<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。通常每只脾脏可获得1-2 × 108个细胞。进行流式细胞术分析时，每份样品分装100万至200万个细胞，可分装至FACS染色管（BD Falcon聚苯乙烯圆底管，352008）或U型底96孔板（BD Falcon 353910）中。每份样品染色体积为200 μl，最终细胞浓度为0.5至1 × 107个细胞/ml，或每200 μl样品含1-2 × 106个细胞。</li>
</ol>
3. 骨髓细胞的制备
<ol>
<li>准备1 ml或3 ml注射器，连接26G针头，并预先装入冷染色缓冲液。</li>
<li>去除附着在股骨上的肌肉，以便清晰观察骨骼。 </li>
<li>使用锋利的手术剪尽可能靠近股骨两端将其剪断。每个切割端应露出一个小孔，通向贯穿股骨全长的骨髓腔。</li>
<li>使用步骤1中的预装注射器，将针头穿过其中一个孔，从另一端的孔中轻柔地将骨髓冲洗到离心管中。</li>
<li>通过轻柔吹打使冲洗下来的细胞解离，并经一滤器过滤 40 μm 筛网，与上述脾脏处理相同（见第节 2.1).</li>
<li>用预冷的染色缓冲液通过离心洗涤细胞两次</li>
<li>计数细胞并按照第节中的方法重新悬浮 2.4典型的产量约为107 每根股骨的细胞数</li>
</ol>
4. 胎肝细胞的制备
<ol>
<li>为准备特定妊娠阶段的雌性小鼠，应在傍晚安排小鼠交配，并于次日上午10点前检查阴道栓；发现阴道栓的当天记为妊娠0.5天。对于不熟悉该技术的研究人员，兽医人员可协助鉴定妊娠雌鼠。也可通过监测小鼠体重变化来确定是否妊娠。</li>
<li>在妊娠第12.5至14.5天处死特定妊娠阶段的雌性小鼠，将子宫角取出并置于含有冰上预冷的培养基或染色缓冲液的培养皿中。</li>
<li>从每只子宫中取出胚胎，并解剖获取胎肝。对于妊娠12.5天（E12.5）或更早期的胚胎，需要使用解剖显微镜进行操作。</li>
<li>胎肝可通过在缓冲液中吹打进行机械解离，根据实验需求，可将样品分别处理于96孔板中，或合并处理。</li>
<li>妊娠13.5天（E13.5）的胎肝约含有107个细胞。细胞用染色缓冲液洗涤两次后，重悬于200 μl体积中，浓度为1–2 × 106 个细胞/样本，用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
5. 流式细胞术抗体染色
<ol>
<li>为所有样本（对照样本除外）配制一种一抗染色预混液，包含以下组分：
<ul>
<li>ChromePure 兔 IgG（Jackson，015-000-003），终浓度为 200μg/ml。请检查瓶上标注的原液浓度（可能有所差异）。该试剂用于阻断小鼠细胞中的 Fc 受体；可用于此目的的其他物种包括小鼠 IgG 或大鼠 IgG。阻断抗体的物种选择取决于染色方案中是否使用针对大鼠/小鼠/兔一抗的二抗，若存在此类二抗，则相应物种的 IgG 不可作为阻断抗体使用。此外，也可用 5% 兔血清替代纯化的 IgG。另一种替代方案是使用针对小鼠 Fc 受体的单克隆抗体或 Fab 片段。下述基本方案中不包含任何二抗，因此三种物种的 IgG 均可使用。</li>
<li>CD71-FITC，按 1:200 稀释（原液 0.5mg/ml，BD-Biosciences，553266）</li>
<li>Ter119-PE，按 1:200 稀释（原液 0.2mg/ml，BD-Biosciences，553673）</li>
<li>任何其他针对目标表面表位的一抗，例如抗 Fas 或 FasL 抗体（见 1,2）。通过轻轻颠倒混匀管 2–3 次，温和混匀抗体溶液。</li>
</ul>
</li>
<li>向每个细胞样本中加入 200 μl 预混液，并轻轻重悬细胞。</li>
<li>按如下方式制备对照细胞样本：
<ul>
<li>“未染色”对照：这些细胞仅保留在染色缓冲液中，用于提供细胞自身的背景自发荧光。</li>
<li>“单色”对照：本方案中每种抗体/荧光染料均需设置一个此类对照。这些对照细胞使用直接偶联荧光染料的一抗染色，或同时使用一抗和偶联荧光染料的二抗进行染色。此类对照用于校正通道间的光谱重叠。</li>
<li>“减去一色荧光”（FMO）对照：本方案中每种抗体/荧光染料均需设置一个 FMO 对照。细胞使用除该 FMO 对照所对应的抗体/荧光染料外的所有其他抗体/荧光染料进行染色。特定通道的 FMO 对照可提供该通道的真实背景信号。该对照中可包含同型对照抗体（即与待测抗体相同同型、偶联相同荧光染料的非特异性抗体）。</li>
</ul>
</li>
<li>将样本及相应对照在冰上避光孵育 45 分钟至 1 小时（在冰桶外包裹铝箔）。</li>
<li>孵育结束后，向每管样本中加入 3ml 染色缓冲液洗涤细胞，并在 4°C 下以约 400 × g 离心 3 至 5 分钟。若使用 96 孔板，则每孔用 200 μl 染色缓冲液洗涤三次。</li>
<li>如需进行二抗染色，请在此步骤中进行。操作方式与一抗染色相同，包括染色与洗涤步骤。</li>
<li>如需进行 Annexin V 染色，则在孵育结束后按照制造商说明书使用 HEPES 缓冲液进行染色。该染色可在室温下进行 15 分钟，或在冰上进行 1 小时。</li>
<li>将细胞重悬于含有细胞不可透过性 DNA 染料的染色液中，用于流式细胞术分析，以排除死细胞。可选的 DNA 染料包括碘化丙啶（Propidium Iodide）、7-氨基放线菌素 D（7AAD）或 DAPI。具体选择取决于抗体染色所占用的检测通道以及流式细胞仪可用的检测通道。7AAD 来自 BD-Biosciences（559925），按制造商说明书使用。对于 DAPI 染色，使用粉末（Roche，货号 # 236276）以二甲基甲酰胺（DMF）配制 1mg/ml 储存液，-20°C 保存，并在染色缓冲液中稀释 10,000 至 15,000 倍使用。</li>
</ol>
6. 流式细胞分选
<ol>
<li>按照流式细胞术分析（第5节）所述方法，使用抗CD71、Ter119、谱系标记物抗体及活细胞染料对细胞进行标记。标记过程中细胞浓度可提高至5 × 107/ml。</li>
<li>将以下每种抗体取等体积混合，配制谱系主混合液：
<ul>
<li>FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848</li>
<li>FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087</li>
<li>FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061</li>
<li>FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396</li>
<li>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126 </li>
<li>主混合液使用稀释比例为1:80（相当于将每种浓度均为0.5 mg/ml的单个抗体原液按1:400稀释）。</li>
</ul>
</li>
<li>采用低压分选条件和大口径喷嘴。对于Aria（BD Biosciences）仪器，我们使用100 μm喷嘴和20 psi压力。</li>
<li>收集缓冲液：添加20%胎牛血清的PBS。</li>
<li>为检测分选后细胞群的纯度，取每份样品少量等分试样，重新在含有活细胞染料（7AAD或类似染料）的缓冲液中上机检测。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
成年小鼠骨髓或脾脏的CD71/Ter119染色可鉴定出四个发育阶段的细胞亚群，分别标记为ProE、EryA、EryB和EryC（图1）1。从形态学上看，这些亚群对应于逐渐成熟的有核红细胞。图1展示了数据分析阶段的设门流程，该流程排除了体积过小的事件（包括细胞核、红细胞）、聚集的细胞以及死亡细胞。
可通过在对 Ter119 和 CD71 进行染色的同时加入相应抗体，同步检测上述各亚群细胞表面蛋白的表达。图1展示了死亡受体Fas细胞表面表达的一个示例 1该检测在注射了促红细胞生成素（Epo）的小鼠或注射生理盐水的对照小鼠中进行。结果显示，Epo可抑制EryA细胞群中Fas的表达。 体内 1. 
还可对各亚群细胞内的细胞内蛋白表达或细胞周期状态进行检测。图2展示了新鲜分离的骨髓细胞的代表性细胞周期分析结果。这些检测除需要使用CD71和Ter119进行细胞表面染色外，还需对细胞进行固定和透化处理，以便进行细胞内标记（详见讨论部分）。
在胎肝中，首先通过设门排除表达 CD41、Mac-1、Gr-1、B220 和 CD3 的“Lin-”非红系细胞（图3）。剩余细胞进一步分为6个亚群，即 S0 至 S5。胎肝中细胞的精确分布模式取决于胚胎发育年龄（见讨论部分）。图4展示了 E13.5 胎肝中 S3 亚群的代表性细胞周期分析结果。
<img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="红细胞生成阶段的流式细胞术分析；Fas表达比较；生理盐水处理组与Epo处理组。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1">
 图1. 小鼠脾脏中的CD71/Ter119红系细胞亚群。 A. 分选策略：脾脏细胞经处理后，使用针对CD71、Ter119和Fas的抗体进行标记。本图展示了数据采集完成后的分析策略。图I显示所有采集到的事件。对角门控代表可能为单个细胞的事件，排除双联体或更大的聚集体。该门控内的细胞进一步在图II中分析。此处排除体积非常小的事件，这些事件可能为细胞核或碎片。被门控的细胞在图III中显示，其中排除DAPI阳性细胞，这些细胞可能为细胞膜通透性的凋亡细胞，不进入后续分析。图IV显示最终获得的活脾细胞群体。ProE门包含CD71highTer119intermediate细胞。Ter119high细胞进一步在图V中分析。在此，CD71high细胞被细分为较不成熟的、体积较大的“EryA”型成红细胞（CD71highTer119highFSChigh）和较小的、更成熟的“EryB”型成红细胞（CD71highTer119highFSClow）。最成熟的成红细胞亚群为EryC（CD71lowTer119highFSClow）。图VI显示在基础状态（注射生理盐水）的小鼠和单次注射Epo的小鼠中，EryA亚群表面Fas的表达情况。Fas抗体染色与CD71/Ter119染色同时进行。B. 从各指定亚群分选细胞后制备的细胞涂片。细胞经吉姆萨染色和二氨基联苯胺染色，后者可与血红蛋白反应产生棕色沉淀。细胞涂片数据最初发表于Liu et al., Blood. 2006 Jul 1;108(1):123-33. Epub 2006 Mar 9。
<img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="流式细胞术示意图；CD71、Ter119 标记物；骨髓细胞周期分析；G1、S、G2/M 期。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠骨髓中 CD71highTer119high 红系前体细胞的细胞周期分析。 小鼠经腹腔注射 BrdU，30 至 60 分钟后取脾脏或骨髓组织。细胞经固定和透化处理后，除使用 CD71 和 Ter119 抗体染色外，还使用抗 BrdU 单克隆抗体检测 BrdU 在复制 DNA 中的掺入情况（固定、透化及 BrdU 染色操作按试剂盒说明书进行）。BrdU 阳性细胞处于细胞周期的 S 期。间期细胞为 BrdU 阴性，可通过 DNA 染料 7AAD 进一步区分成 G1 期或 G2/M 期。
<img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="流式细胞术图示，对活的、谱系阴性细胞设门；分析红细胞前体阶段 E13、E14。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 小鼠胎肝中的 CD71/Ter119 红系亚群。 A. 设门策略：胎肝细胞用 CD71、Ter119 及针对非红系谱系标志物（“Lin”）的 FITC 标记抗体混合物进行标记。对活细胞（7AAD 阴性）分析其 Lin 表达情况，Lin 阴性细胞进一步划分为 S0 至 S5 红系亚群。较早期的 E13 胎肝主要由较不成熟的红细胞前体组成，表现为成熟 S4/S5 亚群中无细胞存在。B. 从所示各亚群分选细胞制备的细胞涂片。细胞经吉姆萨染色和二氨基联苯胺染色，后者可与血红蛋白反应产生棕色着色。细胞涂片数据最初发表于 Pop et al., PLoS Biol 8(9): e1000484. doi:10.1371/journal.pbio.1000484 。
<img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="使用CD71、Ter119、BrdU和7AAD进行流式细胞术分析；细胞周期各时相G1、S3、G2M被标出。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 胎肝红系细胞亚群的细胞周期分析。 对怀孕小鼠注射BrdU，30至60分钟后获取胎肝组织，经固定、透化处理后，用抗CD71、Ter119和BrdU的抗体进行染色。图中显示S3细胞的细胞周期状态。

<ol><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li>
<li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li>
<li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li>
<li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a%28-%2F-%295b%28-%2F-%29+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li>
<li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li>
<li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid+dysplasia%2C+megaloblastic+anemia%2C+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li>
<li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li>
<li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells%3A+where+flow+meets+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li>
<li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li>
<li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li>
</ol>

动物实验严格按照马萨诸塞大学医学院IACUC委员会制定的指南和规定进行。

流式细胞术方法能够同时检测任何可通过荧光标记的特异性抗体或配体识别的细胞功能，包括细胞表面标志物、蛋白质表达、细胞存活以及利用磷酸化特异性抗体检测的细胞信号转导 3 以及细胞周期状态。这些测量可在新鲜分离的红细胞生成组织中，针对多个特定分化阶段的亚群分别进行。因此，该方法可用于评估红细胞生成系统在不同水平上对多种红细胞生成刺激或遗传突变所产生的一系列功能和分子变化。 
任何抗体都存在交叉反应性，且交叉反应性可能具有组织特异性。因此，即使对于已测试过的抗体，也必须在红系造血组织的背景下，利用基因敲除或基因敲低的细胞模型，验证其特异性。
可对特定红系亚群的细胞进行分选，用于RNA或转录组分析。分选实验应采用较低的分选压力和较宽的喷嘴，以最大限度地减少细胞所受的剪切应力。我们建议在每次分选实验后检查细胞纯度和活力。值得注意的是，在多参数流式细胞术中，每种荧光通道的真实背景为其“FMO”对照（见5.3节），该对照除自发荧光外，还包括来自所有其他荧光通道的光谱重叠所导致的背景信号。在数据分析阶段，需使用特定细胞亚群...

<table><tbody><tr><td>Fas-biotin</td><td>BD 生物科学</td><td>554256</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-APC</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S868</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 无菌细胞筛</td><td>费舍尔科技</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>FACS 染色用聚苯乙烯圆底管</td><td>BD 生物科学</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 U 型底板</td><td>BD 生物科学</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>ChromePure 兔 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>CD71-FITC（储存液 0.5 mg/mL）</td><td>BD 生物科学</td><td>553266</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-PE（储存液 0.2 mg/mL）</td><td>BD 生物科学</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD 生物科学</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 粉末</td><td>罗氏集团</td><td>236276</td><td></td></tr><tr><td>FITC 大鼠抗小鼠 CD41 MWReg30</td><td>BD 生物科学</td><td>553848</td><td></td></tr><tr><td>FITC 大鼠抗小鼠 CD45R/B220 RA3-6B2</td><td>BD 生物科学</td><td>553087</td><td></td></tr><tr><td>FITC 大鼠抗小鼠 CD11b/Mac-1 M1/70</td><td>BD 生物科学</td><td>557396</td><td></td></tr><tr><td>FITC 大鼠抗小鼠 Ly-6G 和 Ly-6C（Gr-1）RB6-8C5</td><td>BD 生物科学</td><td>553126</td><td></td></tr><tr><td>FITC 仓鼠抗小鼠 CD3e 145-2C11</td><td>BD 生物科学</td><td>553061</td><td></td></tr><tr><td>APC BrdU 流式检测试剂盒</td><td>BD 生物科学</td><td>557892</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-biotin</td><td>BD 生物科学</td><td>556418</td><td></td></tr></tbody></table>

利用cd71/ter119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

红细胞生成的研究旨在阐明红细胞如何由早期造血细胞和红系祖细胞发育而来。具体而言，红细胞的生成速率由激素促红细胞生成素（Epo）调控，该激素的合成由组织缺氧触发。当组织氧供不足时，Epo水平迅速升高，从而加快红细胞生成速率，这一过程称为红细胞生成应激反应。循环中红细胞数量的增加可改善组织的氧输送。因此，有效的红细胞生成应激反应对于机体在高海拔、贫血、出血、化疗或干细胞移植等生理和病理条件下的存活与恢复至关重要。
小鼠是研究红细胞生成及其应激反应的关键模型。小鼠确定型（成年型）红细胞生成发生在胚胎期12.5至15.5天的胎肝中，以及新生小鼠的脾脏和成年小鼠的脾脏与骨髓中。传统鉴定组织中红系祖细胞的方法依赖于这些细胞在含有促红细胞生成素（Epo）的半固体培养基中形成红细胞集落的能力。其红系前体细胞后代则基于形态学标准进行鉴定。然而，这两种经典方法均无法获得大量特定分化阶段的红系细胞用于分子水平研究。本文介绍一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠组织中鉴定和研究特定分化阶段红系祖细胞及前体细胞的方法。该检测方法依赖于细胞表面标志物CD71、Ter119以及流式细胞术中的“前向散射”（forward-scatter）参数（该参数反映细胞大小）。CD71/Ter119检测可用于研究红系祖细胞在体内应对红细胞生成应激时的变化，例如在贫血小鼠或处于低氧环境饲养的小鼠中。该方法也可直接用于分析基因修饰成年小鼠或胚胎组织中的红系祖细胞，以评估特定分子通路在红细胞生成过程中的作用。

一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。

利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞

红细胞生成研究旨在阐明红细胞如何从早期造血细胞和红系祖细胞发育而来。具体而言，……的速率

以下实验的总体目标是在小鼠新鲜收获的组织中直接鉴定红细胞前体细胞。这使得我们能够在小鼠红细胞生成系统发生改变的时期研究其分子特性。例如，在胚胎发育过程中或对缺氧应激反应期间，首先从小鼠胎肝、成年脾脏或骨髓中分离出造血组织，并将其解离为单细胞悬液。接下来，细胞使用针对细胞表面标志物CD 71和TER 119的抗体以及其他感兴趣的标志物进行标记，例如用于检测细胞存活率或细胞周期状态。标记后的细胞悬液通过流式细胞仪进行分析，以鉴定处于不同成熟阶段的特定成红血细胞亚群。这些特定亚群可通过细胞分选进行纯化。随后，可对每个成红血细胞成熟亚群进行细胞和分子水平的分析。能够在新鲜分离的造血组织中直接鉴定处于特定成熟阶段的成红细胞，使我们有机会在生理环境下研究这些细胞。因此，该方法使我们能够研究不同成熟阶段的高纯度成红细胞在体内的反应。当小鼠受到刺激时，其红细胞生成速率会加快。例如，模拟高海拔的低氧条件或注射促红细胞生成素激素。我们采用多参数流式细胞术，在复杂的组织环境中鉴定原红细胞，并同时研究其信号转导、存活状态和细胞周期状况。我们还可以从新鲜组织中直接分选处于特定成熟阶段的原红细胞，并分析其基因表达水平、染色质状态或其他分子功能。成年小鼠的确定性红细胞生成发生在脾脏和骨髓中。因此，将从安乐死的小鼠中采集这些组织。在处死小鼠后，通过心脏穿刺将血液采集至含EDTA或肝素的采血管中，该血液后续可用于红细胞压积计数、网织红细胞计数或全血细胞分析（CBC）。将收获的脾脏和股骨分别放入含有冷染色缓冲液的试管中。如有需要，将收获的组织置于冰上。称量脾脏重量。经历促红细胞生成应激反应的小鼠脾脏重量可能会显著增加。随后，通过先前在小鼠胚胎中已演示过的方法，从收获的组织中制备脾细胞和骨髓细胞。定型红细胞生成发生在胚胎第12.5至15.5天之间的胎肝中。准备妊娠时间明确的雌性小鼠，于妊娠第12.5至14.5天获取胎肝细胞。对妊娠时间明确的雌性小鼠实施安乐死，取出子宫角并置于含有冰的培养皿中，内含冷培养基或染色缓冲液。解剖显微镜是解剖胚胎第12.5天或更早期的胎肝以及从子宫中取出胚胎所必需的。首先将每个孕囊从角部分离出来，然后轻轻切除子宫壁，以释放位于羊膜囊内的胚胎。轻轻剥离羊膜。胎肝是位于较小心脏下方的最大红色腹部组织。解剖胎肝时，用镊子固定肝脏两侧的胚胎组织，轻柔地将肝脏从腹腔推出至培养基中。将肝脏轻柔转移至含有新鲜染色缓冲液的离心管中。待所有胎肝组织完成解剖并转移至含有新鲜染色缓冲液的离心管后，通过移液器进行机械性解离，随后将解离后的细胞经40微米尼龙滤膜过滤，再通过离心洗涤细胞两次，弃去上清液，最后将细胞重悬于染色缓冲液中。第二次洗涤后，用台盼蓝对细胞进行染色，并使用血细胞计数板计数。E13.5时期的胎肝约含有10的7次方个细胞，将细胞重悬于每200 µL样本含1×10⁶至2×10⁶个细胞的溶液中，用于流式细胞术分析。本视频实验方案仅以胎肝细胞为例演示用于流式细胞术的抗体染色。开始该操作前，配制一管初级抗体染色预混液，包含以下组分：用于阻断小鼠细胞 Fc 受体的纯化兔 IgG、CD71 FETR119 PE 抗体，以及针对细胞表面蛋白 FAST 的抗体。通过轻轻翻转离心管 2 至 3 次，温和混匀抗体溶液；将 200 微升该初级抗体染色预混液加入此前制备好的胎肝细胞样品中，再用移液器轻柔吹打数次，以充分重悬细胞。接下来，准备以下六个对照细胞样本：一个未染色样本，即细胞置于染色缓冲液中，用于提供细胞自身的背景自发荧光；每个抗体或本实验中使用的每种荧光染料的单色对照，用于校正通道间的光谱重叠，本实验中涉及的染料包括 TUR one 19、PE、CD 71、fz fast、biotin、streptavidin、A PC 和 seven A A DA；以及 fast biotin 的荧光减一对照（fluorescence minus one control），该对照中细胞使用除 fast biotin 以外的所有荧光染料或抗体进行染色，以提供该通道的真实背景信号。将待测样本及相应的对照样本在冰上避光孵育，与一抗染色液共同作用 45 分钟至 1 小时。孵育结束后，向每管样品中加入三毫升染色缓冲液洗涤细胞，并在4°C下以约400 × g离心3至5分钟。接着，加入链霉亲和素-藻红蛋白（strep avidin-PE），将各管置于冰上孵育30至45分钟。孵育完成后，按照第一抗体染色的相同方法洗涤细胞。最后，将细胞重悬于含有细胞非通透性DNA染料7-AAD的染色液中，以排除死细胞。样品现可进行流式细胞术分析。该实验步骤中最困难的部分在于对流式细胞术检测事件进行准确的设门分析，从而可靠地鉴定出成红细胞亚群。需要仔细设置仪器，准备所有正确的对照样本，仔细进行光谱重叠的补偿，并在后续设门过程中排除死细胞、细胞聚集体以及非常微小的事件。在数据分析开始时，需使用未染色样本和单色对照样本，为每种颜色组合设置光谱重叠的补偿参数。在此示例中，我们将展示 fit e 荧光如何渗入 PE 通道，以及在补偿后如何校正这种光谱重叠。首先，使用未染色对照，我们定义一个 fit E 阳性且 PE 阴性的区域。接着，利用 fit E 单色对照，我们可以观察到光谱溢出至 PE 通道的情况。使用 FlowJo 软件进行数字补偿后，PE 通道中的溢出拟合 E 信号被最小化。补偿完成后，可去除已死亡的细胞、聚集体以及微小事件。通过绘制前向散射光高度（forward scatter height）与前向散射光面积（forward scatter area）的散点图，并选择位于狭窄对角门控范围内的事件，从而去除聚集体和细胞双联体。通过选择对DAPI（一种细胞不可渗透的DNA染料）呈阴性的细胞来去除死细胞。DAPI阴性的活细胞门控还可排除前向散射信号极低的微小事件，例如细胞核或碎片。接下来，我们将展示胎肝细胞的设门策略。 freshly harvested cells 被标记了 CD71 TUR 一 19 以及一组针对非红系谱系标志物的 ZI 标记抗体。在此示例中，样本已经对光谱重叠进行了补偿，随后设门以排除聚集体、死亡细胞以及极小的事件。我们使用 FMO 样本（包含除谱系阳性 fitzy 染料外的所有荧光染料）绘制 fitzy 直方图，并定义谱系阴性细胞门。接下来，我们将此门应用于经 ZI 偶联谱系标志物染色的胎肝细胞样本。选择谱系阴性细胞，并以Y轴为CD71、A轴为TER19进行绘图。A轴上的细胞现已可被划分为S0至S5亚群。Lin耗竭的S0亚群主要包含在依赖EPO之前具有CFU-E潜能的细胞。S1 亚群主要包含处于细胞周期 S 期的依赖促红细胞生成素（EPO）的 CFU-E 细胞。S2 亚群细胞已失去集落形成能力，并开始表达血红蛋白。S3 亚群细胞主要为嗜碱性成红细胞。S4 和 S5 亚群包含晚期成红细胞。此处展示的是对脾脏细胞进行处理并用针对 CD71 和 TER-119 的抗体以及死亡受体 Fas 的直方图进行标记后，获得数据的分析策略。其中一个图显示了所有获取的事件，其中对角线门控代表可能是单个细胞的事件，排除双联体或更大的聚集体。该门控内的细胞将在第二个直方图中进一步分析。非常小的事件（可能是细胞核或碎片）被排除在外。门控细胞显示在第三个直方图中，其中排除了DAPI阳性且可能具有膜通透性的凋亡细胞，不再进行后续分析。第四个直方图显示了最终获得的活脾细胞群体。前体eGate包含CD71高表达、TER-119中等表达的细胞，而TER-119高表达细胞则在第五个直方图中进一步分析。此处，CD71高表达细胞被进一步划分为成熟度较低、面积较大的有核红细胞，以及体积较小、成熟度较高的A型和B型有核红细胞。其中最成熟的有核红细胞亚群为ARIC。可通过在染色时同时加入针对TER119和CD71的相应抗体，对上述各亚群细胞表面蛋白的表达水平进行同步检测。染色直方图六显示了在基础状态下以及单次注射Epo后的小鼠中，死亡受体Fas在A亚群细胞表面的特异性表达情况。结果表明，EPO 抑制该区域的快速表达。还可测量每个亚群细胞中细胞内蛋白的体内表达水平或细胞周期状态。在此代表性细胞周期分析中，小鼠经腹腔注射 BRDU，30 至 60 分钟后采集骨髓样本。除了用 CD71 和 TER119 进行染色外，还对细胞进行了溴脱氧尿苷（BrdU）掺入检测，以标记其复制中的 DNA。BrdU 阳性细胞处于细胞周期的 S 期。界面细胞为 BrdU 阴性，可进一步区分为 G1 期或 G2/M 期。利用 DNA7-AAD 染色，可从 PRO-E、Area I、Area II 和 AEC 各亚群中分选出细胞。此处显示的是在胞嘧啶制备样本中，细胞依次成熟的过程，表现为细胞体积逐渐减小、细胞核浓缩以及棕色着色加深，后者反映了血红蛋白的表达。最后，展示了E13.5胎肝中S3亚群的代表性细胞周期分析结果。对怀孕小鼠注射了BRDU。在30至60分钟后收获胎肝，固定、透化并用抗CD71、TER-119和BRDU抗体进行染色。分析S3细胞的细胞周期状态，其中S期细胞为BRDU阳性，DNA含量通过七氨基放线菌素（7-AAD）DNA染色进行定量。我们所描述的流式细胞术方法能够同时检测细胞功能，例如细胞表面标志物及其他蛋白的表达、细胞存活、细胞信号转导（使用磷酸化特异性抗体）以及细胞周期状态。因此，该方法使我们能够研究红细胞前体细胞在不同成熟阶段对多种刺激或基因突变所产生的分子响应。需要注意的是，流式细胞术定义的成熟亚群是基于细胞表面标志物的表达和前向散射光信号来界定的。我们发现，在多种小鼠模型中，每个亚群中的细胞通常对应相似的形态学红细胞阶段。然而，建议在分析新的小鼠模型时验证这一点。可通过分选各亚群的细胞并观察其形态来进行验证。此外，各亚群的细胞也可用于RNA或转录组分析；分选实验应采用较低的分选压力和较宽的喷嘴，以尽量减少对细胞的剪切应力。我们还建议在每次分选实验后检测细胞纯度和活力。最后，当检测到某一特定亚群频率发生变化时，重要的是要确定这种变化是源于该亚群细胞数量的真实改变，还是由于其他亚群的变化所导致。因此，除了测量亚群频率外，始终有必要同时测定每个亚群中细胞的绝对数量。

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