Name: 乳腺的发育和功能在小鼠模型的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 了解小鼠乳腺发育与功能评估方法，通过解剖、染色和催产素刺激实验分析乳腺导管形成及肌上皮细胞收缩功能，为研究基因突变对乳腺形态和功能的影响提供可靠技术框架。

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本研究由CIHR和CBCRA向DWL提供的资助项目资助。IP获得了CIHR-STP、FRSQ和CIHR博士后奖学金的资助。MKGS获得了OGS和CIHR-STP奖学金的资助。作者感谢Kevin Barr在小鼠繁育方面提供的帮助。

1. 乳腺组织解剖
<ol>
<li>使用 CO2 吸入麻醉。应尽量避免颈椎脱臼法，因其可能损伤颈部主要血管，导致血液在乳腺周围积聚，从而增加解剖难度。然而，若需在同一小鼠中评估其他指标（如催产素血清水平），则可能需要采用其他安乐死方法，但此类方法必须经由本单位动物护理与使用委员会（IACUC）评估批准。</li>
<li>在包裹有锡箔的聚苯乙烯泡沫上，将小鼠仰卧放置并展开四肢。使用16至20号针头牢固固定四肢（图1A）。</li>
<li>用70%乙醇充分喷洒小鼠。</li>
<li>用镊子提起腹中线处的皮肤，用锐利的剪刀做一小切口。</li>
<li>从切口处开始，沿动物体表向颈部方向剪开皮肤，注意避免刺破腹腔或胸腔（图1B）。 </li>
<li>将前肢皮肤沿中线切开，形成“Y”形切口（图1B）。以相同方式切开后肢皮肤（图1B）。 </li>
<li>使用止血钳，轻轻将小鼠腹部和胸部的皮肤向两侧剥离。如有需要，可轻轻剪开结缔组织。</li>
<li>使用16至20号针头将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫上，暴露附着在皮肤下方的乳腺组织。依次逐侧进行并完成操作（图1C）。</li>
<li>使用镊子轻轻提起目标乳腺，并用小型锋利剪刀从动物体侧向外向脊柱方向剪开乳腺与皮肤之间的连接。注意仔细剪切，确保乳腺上不残留任何皮肤或肌肉组织。所有乳腺（图1）均可采用本方案进行剥离，但腹部乳腺（#4）最适合整体封片。2nd 和 3rd 腺体具有一些交错分布的肌肉，因此尽管可用于整体封片和组织学分析，但可能并不适用于所有类型的分析。</li>
</ol>
2. 整体装片
<ol>
<li>至少在解剖前一日，配制卡明明矾溶液：将1 g卡明和2.5 g硫酸铝钾溶于500 ml蒸馏水中，于1 L锥形瓶中煮沸20分钟。加水定容至500 ml。用Whatman滤纸过滤，并加入少量百里香酚（数粒）作为防腐剂。置于冰箱中保存。染色后，卡明明矾溶液可倒回原储存瓶中，在数周内多次重复使用。当溶液颜色变淡时，需重新配制新溶液。 </li>
<li>在从小鼠体内切除乳腺组织后（步骤1），立即将其铺展在载玻片上。尽量将其展平，保持原有的形态结构 原位 形状。当适当拉伸时，腺体会很好地黏附在载玻片上。</li>
<li>将腺体置于载玻片上，浸入卡诺固定液（100% EtOH、氯仿、冰醋酸；6:3:1）中，在室温下通风橱内的容器中固定4小时。需注意，其他研究者曾使用2小时，似乎亦足够。 alternatively，腺体也可在 4°C 过夜。</li>
<li>用70%乙醇洗涤15分钟。然后通过逐步加水复水：从容器中移除一半乙醇溶液，并以ddH₂O替代。2O. 孵育5分钟，重复3次。或者，依次使用70%、35%、15%乙醇及水浴，每步各5分钟。</li>
<li>用蒸馏水冲洗5分钟。 </li>
<li>室温下用卡红明矾染色液染色过夜。需要注意的是，染色时间可能因腺体厚度而延长。 </li>
<li>去除胭脂红明矾染液以重复利用，并通过系列乙醇溶液（50%、70%、95%、100%）对染色组织进行逐级脱水，每级5分钟，随后用二甲苯或无毒替代试剂（如Histo-clear）透明过夜。对于较厚的样本，脱水和透明步骤可能需要更长的孵育时间。</li>
<li>将乳腺组织浸入水杨酸甲酯中。乳腺组织可在通风橱内的水杨酸甲酯中保存，直至准备进行成像。</li>
<li>可在通风橱内将载玻片置于透射光灯台上，使用固定在三脚架上的普通数码相机拍摄图像（如有，可使用“微距”功能）；如需更高放大倍数，可使用解剖显微镜。或者，在步骤2.7之后，可将乳腺组织用Permount等封片介质封片，若封片足够薄，则可在非化学通风橱环境下的任意成像平台上进行拍照。</li>
<li>为了利用整体封片法量化乳腺发育情况，可评估导管部分的分支（或侧支）数量、主导管长度，或上皮组织与脂肪组织面积的比值。最后，在完成摄影记录后，乳腺整体封片样本可包埋于石蜡中，用于切片及常规组织学染色。</li>
</ol>
3. 催产素诱导的乳汁排出
<ol>
<li>在幼崽进食后立即将其与母鼠分离。在进行检测前等待1小时。</li>
<li>处死母鼠，并如前所述（步骤1.1至1.8）暴露乳腺组织，但不将其从动物体内移除。</li>
<li>使用移液管将PBS或催产素溶液均匀滴加到目标乳腺上，以启动检测。可使用广泛剂量范围；通常采用约8 pg/ml（生理剂量）。然而，为了确保在基因修饰小鼠模型中无反应，也可使用较高的非生理性剂量（高达1 mg/ml）。建议在本实验中使用胸部（#2-3）乳腺，一侧作为对照（暴露于PBS），另一侧用于检测乳汁排出（暴露于催产素）。</li>
<li>孵育1分钟后，用移液管小心吸除溶液。可通过录像记录，或在PBS或催产素处理前后拍照，以监测乳汁进入导管的情况。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
在制作良好的全组织染色标本中，乳腺组织应充分展开，上皮导管易于观察（图 2A）。如果乳腺组织未充分展开，在置于固定液中时，组织可能会部分或完全从载玻片上翘起，进而变得坚硬且无法使用（图 2B）。同样，如果乳腺未彻底解剖，可能导致部分上皮缺失（图 2C），或残留的皮肤及腹肌组织干扰对乳腺的分析（图 2D）。
进行催产素检测时，每次实验都必须将吮吸乳汁的幼崽与母鼠分离相同的时间。这样可以确保在暴露于催产素之前，导管中不存在乳汁或仅有微量乳汁，同时保证腺泡中有足够的乳汁可通过肌上皮细胞收缩将其排入导管（图3A）。如果过早移除幼崽，乳汁可能在腺泡和导管中积聚，从而难以监测催产素的作用（图3B）。相反，若在移除幼崽后过早进行实验，乳汁尚未在腺泡中充分积聚，催产素诱导的肌上皮细胞收缩将无法触发足够的乳汁释放到导管中以供观察（图3C）。
<img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="小鼠解剖图；药理学研究中标注的实验性药物给药部位。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 小鼠乳腺组织解剖。将小鼠四肢朝下仰卧固定（A）。先从腹部向颈部切开皮肤，然后从腹部中心向各肢作垂直切口，如虚线所示（B）。轻轻将动物侧边的皮肤剥离并用针固定，暴露乳腺组织（C）。
<img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="腺体组织切片的组织学显微图像，显示结构及肌肉存在的差异。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠乳腺全组织铺片。在铺展良好的第4对乳腺全组织铺片中（A），上皮导管（箭头）和淋巴结（箭头指示）清晰可见。铺展不良的乳腺组织可能从载玻片上脱落并塌陷，导致无法使用（B）。取材不当的乳腺组织可能出现部分缺失（C），或残留肌肉或皮肤组织（D）。注意 2nd 和 3rd 腺体具有交错的肌肉，但仍可用于整体封片或组织学分析。
<img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="催产素对组织血管化的影响；比较结果；显微图像；实验研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 给予催产素后，可在导管上皮中观察到催产素诱导的泌乳现象（箭头所示）（A）。然而，若由于幼崽上次哺乳后间隔时间过长，导致实验开始时导管内已充满乳汁（箭头所示），则在给予催产素后难以观察到导管内乳汁的进一步积聚（箭头所示）（B）。相反，若哺乳后间隔时间过短，则腺泡内无法积聚足够的乳汁，从而在给予催产素后亦难以在导管中清晰观察到乳汁（箭头所示）（C）。图像使用数码相机（Cybershot, Sony）在给予催产素前后拍摄。
<img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="催产素检测示意图；整体封片，PBS/催产素处理，藏红花精铝染色过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 整体封片与催产素处理检测的示意图。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

乳腺发育与功能受到精密调控。携带基因突变的小鼠可能表现出乳腺发育或功能受损，凸显了评估腺体结构的重要性。13,12整体封片可在乳腺发育的所有阶段按照本文所述方法进行。通常在青春期开始时评估上皮的发育情况（ &tilde;4 周龄），处于青春期中期（ &tilde;6 周龄）及青春期后（ &tilde; 10-12周龄2,10在这些阶段，可通过测定导管分支数量、末端芽的数量及导管长度，以量化腺体发育程度。14,15同样，肺泡发生（妊娠期间肺泡的发育）通常在妊娠过程中选取2-3个时间点进行评估；哺乳期和复旧期发生的结构变化也可通过全组织腺体铺片进行观察和定量分析。16然而，由于晚期妊娠和哺乳期小鼠乳腺组织密度较高，对其进行全组织染色定量分析可能较为困难。建议将全组织染色与组织学分析相结合，尤其是针对这些阶段的样本 12对于更详细的组织学评估，可采用本报告所述相同方案摘除乳腺组织，经甲醛固定后进行苏木精和伊红染色。全组织标本也可在成像完成后进行石蜡包埋，用于组织学分析。两种技术均要求对乳腺组织进行准确而精细的解剖。若评估突变小鼠，应将...

<table><tbody><tr><td>胭脂红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铝钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6435</td><td></td></tr><tr><td>百里酚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>水杨酸甲酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6752</td><td></td></tr><tr><td>催产素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠模型中乳腺发育与功能的评估

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

人类乳腺由15-20个叶组成，这些叶将乳汁分泌至通向乳头开口的分支导管系统。每个叶又由多个终末导管小叶单位构成，这些单位包括分泌性腺泡和汇合的导管。1在小鼠中，妊娠期间可观察到类似的结构，其中导管和腺泡散布于结缔组织间质内。小鼠乳腺上皮由导管构成的树状系统组成，导管由两层细胞构成：内层为腔面细胞，外层为肌上皮细胞，二者由基底膜界定。2出生时，仅存在一个初级导管树，由一条主导管和15–20条分支组成。在激素影响下，导管的延伸和扩增始于青春期初期，约4周龄时开始3,4,5在10周时，大部分间质已被复杂的导管系统侵入，这些导管在每个动情周期中将经历分支与退化循环，直至妊娠。2妊娠初期，发育进入第二阶段，此时上皮细胞开始增殖并分化，形成葡萄状的乳汁分泌结构，称为腺泡。6,7分娩后及整个哺乳期间，乳汁由腺泡腔内的分泌细胞产生，并储存在腺泡腔内。幼崽吮吸乳头可刺激神经反射，促使催产素释放，进而引起腺泡周围及导管沿线的肌上皮细胞同步收缩，使乳汁经导管输送至乳头，供幼崽摄取。 8乳腺的发育、分化和功能受到精密调控，不仅需要间质与上皮之间的相互作用，还需要上皮内部肌上皮细胞与腔面细胞之间的相互作用。9,10,11因此，参与这些相互作用的许多基因发生突变，可能会影响青春期期间的导管伸长，或影响早孕期间的腺泡形成、晚孕期间的分化以及导致泌乳的分泌激活过程。12,13本文中，我们描述了如何解剖小鼠乳腺并利用全组织制片技术评估其发育情况。我们还展示了如何通过基于催产素的离体功能实验来评估肌上皮细胞收缩及乳汁排出。由此可确定基因突变对乳腺发育和功能的影响。 原位 通过在突变型和野生型对照小鼠中执行这两种技术。

本方法介绍了如何对小鼠乳腺组织进行解剖，并评估其发育情况和功能。通过整体封片法评估切除的乳腺组织的发育程度，同时采用基于催产素的肌上皮细胞收缩实验来评价泌乳功能。

人类乳腺由15至20个腺叶组成，这些腺叶将乳汁分泌至通向乳头开口的分支导管系统。这些腺叶本身……

本实验的总体目标是评估野生型和突变型小鼠中乳腺的发育情况。首先通过解剖小鼠以暴露乳腺组织，随后正确采集乳腺并展平于玻璃载片上，进行后续分析。随后使用染色方法分析上皮发育的程度。最后，在催产素暴露条件下分析肌上皮细胞的收缩情况，INEA J.。最终，所获得的结果将揭示乳腺导管和腺泡是否已正常形成，以及肌上皮层在催产素刺激下是否能够发生收缩并排出乳汁。该方法有助于回答与乳腺发育和分化相关的关键科学问题，例如基因突变或基因敲除对乳腺形态与功能的影响。该方法的可视化演示可确保乳腺组织的正确解剖，因为无论是打孔固定还是基于催产素的检测，均需要制备良好的乳腺组织。若解剖操作不当，可能导致部分上皮导管缺失，或残留皮肤、肌肉等无关组织。解剖前至少一天，将1克CalMin和2.5克硫酸铝钾溶解于500毫升蒸馏水中，配制CalMin明矾溶液。将溶液在1 L的烧瓶中煮沸20分钟，加水定容至500 mL。用沃特曼滤纸过滤溶液，并加入少量硫醇作为防腐剂。染色后将溶液冷藏保存。碳酸铝溶液可倒回原试剂瓶中，在数周内多次重复使用。当溶液颜色变浅时，需重新配制新鲜溶液。开始记忆腺解剖前，采用二氧化碳吸入法处死一只小鼠。应尽量避免颈椎脱位，因为它可能会损伤颈部的主要血管，导致血液在乳腺周围积聚，从而增加在包有铝箔的聚苯乙烯泡沫上进行解剖的难度。将小鼠仰卧放置，并展开四肢。使用16至20号针头牢固固定四肢。用镊子夹取浸有70%乙醇的棉球，充分喷洒小鼠体表。在腹中线处提起腹部皮肤，用锐利的剪刀从小切口处开始剪开一个小口。在避免刺破腹部或胸腔的情况下，将动物皮肤切至颈部。将前肢的皮肤切至正中切口，形成 Y 形。以相同方式切开后肢的皮肤。使用止血钳。如有需要，轻轻将小鼠腹部和胸部的皮肤向侧面剥离。轻轻剪开结缔组织。使用16至20号针头将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫上，暴露附着在皮肤下方的乳腺组织。用镊子逐个解剖乳腺。用镊子轻轻提起目标乳腺组织，从小动物体侧向脊柱方向，用小型锐利剪刀在乳腺与皮肤之间进行剪切分离。务必小心切割，确保腺体上无皮肤或肌肉残留。所有乳腺均可采用本方案进行切除，但以第四对腹侧乳腺最适合整体封片。从小鼠体内切除乳腺后，应直接将其展开于载玻片上。尽量将其压平。保持腺体原有的原位形态，腺体会很好地贴附在载玻片上。在通风橱中适当拉伸后，将载玻片浸入盛有car noise的容器中固定腺体。在室温下固定四小时。或者，可在 4°C 条件下过夜固定腺体。随后，用 70% 乙醇洗涤组织 15 分钟。然后通过从容器中移除一半的乙醇溶液，并用双蒸水替代，逐步进行水化。孵育5分钟。重复此步骤三次，用双蒸水冲洗并浸泡5分钟。然后在室温下用明矾炭染色液对腺体染色过夜。次日，取出明矾炭染色液以备重复使用，并将染色后的组织依次浸入系列乙醇溶液中，每种浓度乙醇处理5分钟，逐步脱水。随后将组织置于二甲苯中透明过夜。透明完成后，将乳腺组织浸入水杨酸甲酯中，并将水杨酸甲酯置于通风橱内，直至准备拍摄图像。乳腺发育情况可通过计数导管部分区域的分支或侧支数量、主导管的长度，或评估上皮组织与脂肪组织面积的比值来进行定量分析。另一项用于评估乳腺发育和功能的实验，是通过将乳腺暴露于催产素并检测乳汁是否被排出至导管上皮来完成的。进行该检测时，应将刚哺乳后的幼崽从母鼠身上断奶，并将母鼠单独隔离一小时。随后处死母鼠，并按照乳腺解剖所述方法暴露乳腺组织。然而，将其保留在动物体内。开始实验时，使用移液管将三到五毫升的 PBS 或催产素溶液均匀滴加到目标乳腺上。在本实验中，建议使用胸部乳腺，一侧作为对照，另一侧用于检测乳汁排出情况。将腺体孵育一分钟，然后用移液管小心吸除溶液，并通过录像记录或在暴露于PBS或催产素前后拍照来监测乳汁进入导管的情况。以下是小鼠乳腺的示例：在充分展开的完整乳腺组织中，腺体铺片上的上皮导管（由箭头指示）以及淋巴结（由箭头末端标记）均清晰可见。乳腺组织涂片不佳可能导致组织从载玻片上脱落并塌陷，从而无法使用。乳腺切除不当可能导致部分组织缺失，或残留肌肉或皮肤碎片。给予催产素后，可在上皮细胞中观察到催产素诱导的乳汁排出现象。然而，如果由于幼崽上次哺乳后存在不适当的过长潜伏期，导致在实验开始时乳腺内已充满乳汁，则在给予催产素后难以观察到乳汁在乳腺中的进一步积聚。相反，若幼崽哺乳后的潜伏期过短，则腺泡内无法积聚足够的乳汁，从而在给予催产素后解剖乳腺时难以在导管中清晰观察到乳汁排出。除了采用打孔固定法或评估催产素诱导的乳汁射出外，还可将乳腺组织冷冻，进行冷冻切片，并对乳腺组织中多种驻留蛋白进行免疫标记分析。或者，也可将腺体裂解并制备用于蛋白质印迹分析。上述两种方法相结合，可针对任何经过基因工程改造以缺失关键基因或携带基因突变的小鼠模型，研究与腺体发育、分化及功能相关的基本科学问题。

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生物学

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