小鼠模型中乳腺发育与功能的评估

本实验的总体目标是评估野生型和突变型小鼠中乳腺的发育情况。首先通过解剖小鼠以暴露乳腺组织，随后正确采集乳腺并展平于玻璃载片上，进行后续分析。

随后使用染色方法分析上皮发育的程度。最后，在催产素暴露条件下分析肌上皮细胞的收缩情况，INEA J.。最终，所获得的结果将揭示乳腺导管和腺泡是否已正常形成，以及肌上皮层在催产素刺激下是否能够发生收缩并排出乳汁。该方法有助于回答与乳腺发育和分化相关的关键科学问题，例如基因突变或基因敲除对乳腺形态与功能的影响。

该方法的可视化演示可确保乳腺组织的正确解剖，因为无论是打孔固定还是基于催产素的检测，均需要制备良好的乳腺组织。若解剖操作不当，可能导致部分上皮导管缺失，或残留皮肤、肌肉等无关组织。解剖前至少一天，将1克CalMin和2.5克硫酸铝钾溶解于500毫升蒸馏水中，配制CalMin明矾溶液。

将溶液在1 L的烧瓶中煮沸20分钟，加水定容至500 mL。用沃特曼滤纸过滤溶液，并加入少量硫醇作为防腐剂。染色后将溶液冷藏保存。

碳酸铝溶液可倒回原试剂瓶中，在数周内多次重复使用。当溶液颜色变浅时，需重新配制新鲜溶液。开始记忆腺解剖前，采用二氧化碳吸入法处死一只小鼠。

应尽量避免颈椎脱位，因为它可能会损伤颈部的主要血管，导致血液在乳腺周围积聚，从而增加在包有铝箔的聚苯乙烯泡沫上进行解剖的难度。将小鼠仰卧放置，并展开四肢。

使用16至20号针头牢固固定四肢。用镊子夹取浸有70%乙醇的棉球，充分喷洒小鼠体表。在腹中线处提起腹部皮肤，用锐利的剪刀从小切口处开始剪开一个小口。

在避免刺破腹部或胸腔的情况下，将动物皮肤切至颈部。将前肢的皮肤切至正中切口，形成 Y 形。以相同方式切开后肢的皮肤。

使用止血钳。如有需要，轻轻将小鼠腹部和胸部的皮肤向侧面剥离。轻轻剪开结缔组织。

使用16至20号针头将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫上，暴露附着在皮肤下方的乳腺组织。用镊子逐个解剖乳腺。用镊子轻轻提起目标乳腺组织，从小动物体侧向脊柱方向，用小型锐利剪刀在乳腺与皮肤之间进行剪切分离。

务必小心切割，确保腺体上无皮肤或肌肉残留。所有乳腺均可采用本方案进行切除，但以第四对腹侧乳腺最适合整体封片。从小鼠体内切除乳腺后，应直接将其展开于载玻片上。

尽量将其压平。保持腺体原有的原位形态，腺体会很好地贴附在载玻片上。在通风橱中适当拉伸后，将载玻片浸入盛有car noise的容器中固定腺体。

在室温下固定四小时。或者，可在 4°C 条件下过夜固定腺体。随后，用 70% 乙醇洗涤组织 15 分钟。

然后通过从容器中移除一半的乙醇溶液，并用双蒸水替代，逐步进行水化。孵育5分钟。重复此步骤三次，用双蒸水冲洗并浸泡5分钟。

然后在室温下用明矾炭染色液对腺体染色过夜。次日，取出明矾炭染色液以备重复使用，并将染色后的组织依次浸入系列乙醇溶液中，每种浓度乙醇处理5分钟，逐步脱水。随后将组织置于二甲苯中透明过夜。透明完成后，将乳腺组织浸入水杨酸甲酯中，并将水杨酸甲酯置于通风橱内，直至准备拍摄图像。乳腺发育情况可通过计数导管部分区域的分支或侧支数量、主导管的长度，或评估上皮组织与脂肪组织面积的比值来进行定量分析。

另一项用于评估乳腺发育和功能的实验，是通过将乳腺暴露于催产素并检测乳汁是否被排出至导管上皮来完成的。进行该检测时，应将刚哺乳后的幼崽从母鼠身上断奶，并将母鼠单独隔离一小时。随后处死母鼠，并按照乳腺解剖所述方法暴露乳腺组织。

然而，将其保留在动物体内。开始实验时，使用移液管将三到五毫升的 PBS 或催产素溶液均匀滴加到目标乳腺上。在本实验中，建议使用胸部乳腺，一侧作为对照，另一侧用于检测乳汁排出情况。

将腺体孵育一分钟，然后用移液管小心吸除溶液，并通过录像记录或在暴露于PBS或催产素前后拍照来监测乳汁进入导管的情况。以下是小鼠乳腺的示例：在充分展开的完整乳腺组织中，腺体铺片上的上皮导管（由箭头指示）以及淋巴结（由箭头末端标记）均清晰可见。

乳腺组织涂片不佳可能导致组织从载玻片上脱落并塌陷，从而无法使用。乳腺切除不当可能导致部分组织缺失，或残留肌肉或皮肤碎片。给予催产素后，可在上皮细胞中观察到催产素诱导的乳汁排出现象。

然而，如果由于幼崽上次哺乳后存在不适当的过长潜伏期，导致在实验开始时乳腺内已充满乳汁，则在给予催产素后难以观察到乳汁在乳腺中的进一步积聚。相反，若幼崽哺乳后的潜伏期过短，则腺泡内无法积聚足够的乳汁，从而在给予催产素后解剖乳腺时难以在导管中清晰观察到乳汁排出。除了采用打孔固定法或评估催产素诱导的乳汁射出外，还可将乳腺组织冷冻，进行冷冻切片，并对乳腺组织中多种驻留蛋白进行免疫标记分析。

或者，也可将腺体裂解并制备用于蛋白质印迹分析。上述两种方法相结合，可针对任何经过基因工程改造以缺失关键基因或携带基因突变的小鼠模型，研究与腺体发育、分化及功能相关的基本科学问题。