外周血中细菌微生物群的测序：我们在HIV感染者中的经验

对易位至外周血的细菌微生物组进行测序。我们针对HIV感染患者的研究经验，我是Marti，任职于意大利米兰大学传染病与热带医学临床诊所的助理教授。接下来，我们将向您展示如何从HIV感染患者的外周血中检测并测序细菌DNA的实验过程。

健康的胃肠道定植着多种多样的共生微生物，这些微生物影响体液和细胞免疫系统的发育。在感染、抗生素治疗、术后并发症以及癌症、胰腺炎和营养不良患者等若干临床情况下，微生物群通过强大的黏膜屏障与免疫系统隔离。胃肠道会发生改变。

HIV 感染会导致胃肠道屏障受损，黏膜免疫功能进行性下降，并使细菌生物产物（如脂多糖和细菌 DNA 片段）渗漏进入全身循环，从而导致全身性免疫激活。本实验旨在检测并测序 HIV 感染患者外周血中存在的细菌 DNA。参与该实验的人员包括：来自米兰大学传染病与热带医学科的传染病专科医师 Camilla ti、博士研究生 Esther me 以及博士后研究员 ju MariaI。本实验的目标是鉴定 HIV 感染患者外周血样本中的细菌种类。

我们将使用来自 HIV 感染者和健康受试者的全血，因为健康个体具有正常的肠道稳态，预计在这些患者中不会观察到易位的微生物群。将从患者体内采集全血，随后进行血浆分离。

随后将提取DNA，以针对PCIC 16S核糖体基因进行广谱PCR反应。在PCR产物获得后，将进行纯化、克隆及测序分析。本实验的第一步是通过静脉穿刺采集血液，随后进行血浆分离。

采集约九毫升全血至含EDTA的试管中。将试管置于离心机中，以2000转/分钟离心10分钟。在室温下离心可实现血浆的分离。

现在将从我们的血浆样本中提取 DNA。充分消毒超净台、移液器及实验所需材料，以确保无菌环境，并将所有物品置于紫外灯下照射至少 30 分钟。关闭紫外灯后，用消毒剂擦拭手套，将几张纸巾浸入乙醇中并放置在超净台内，每次丢弃枪头时都应更换。在 DNA 提取过程中，每次使用移液器后均需在湿润的纸巾上擦拭移液器。

现在可以进行DNA提取。使用商业试剂盒提取DNA，并遵循制造商的说明。简而言之，将350微升血浆加入一个2毫升的离心管中。

使用超纯水作为阴性对照。向样品中加入10微升溶酶体，终浓度为每毫升1毫克。样品随后孵育30分钟。

在37摄氏度下，根据离心后的说明，将溶液A、氯仿和溶液B加入样品中。此时会出现三个 distinct 相。收集上清液并加入乙醇沉淀，以实现DNA沉淀，随后使用分光光度计测定DNA浓度。

下一步是针对PRIC 16S核糖体基因进行广泛范围的PCR扩增反应，该PCR在专用房间内进行。使用以下试剂配制PCR反应混合液。为避免细菌Taq DNA聚合酶可能造成的污染，PCR混合液需在4°C条件下以500 ×g离心过滤30分钟。

然后将PCR反应液分装成若干份，具体份数根据需要扩增的样本数量而定。注意需预留用于阴性对照和阳性对照反应的分装量。

程序化设置热循环条件如下：94°C 预变性5分钟；随后进行40个循环，每个循环包括94°C 变性1分钟、55°C 退火1分钟、72°C 延伸1分钟；最后72°C 终延伸10分钟。平均总时长为3小时。

PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行可视化。此图显示的是PCR产物在2%琼脂糖凝胶上的结果。第一泳道含有100 bp DNA标记物。

第二泳道为 PCR 阳性对照。第三泳道包含 PCR 阴性对照。第四泳道显示来自 HIV 阳性患者的样本，第五泳道为水对照泳道。

第六泳道显示来自健康个体的样本和阴性PCR反应。第七泳道含有水。下一步是PCR扩增。

使用商业试剂盒纯化PCR产物，具体操作遵循生产商说明书。此步骤中使用多种带有滤膜的离心柱。PCR结果记录在工作记录表上。

接下来，我们将使用蓝白斑筛选法进行克隆。这是一种分子生物学技术，可用于检测DNA是否成功插入载体中。随后将载体转化至感受态细胞中的细菌内。

将感受态细胞在含有xal的培养基中培养。如果转化成功，细菌菌落将呈现白色；如果未成功，菌落则呈现蓝色。

Xal 用于指示细胞是否表达β-半乳糖苷酶，并用于可视化大肠杆菌菌落的转化情况，IPTG 可诱导β-半乳糖苷酶的表达。将 Xal 和 IPTG 涂布于含氨苄青霉素的平板上。按照生产商说明书，制备包含 PCR 产物、SALT 和克隆载体的克隆混合液。

将大肠杆菌细胞置于冰上。然后将连接反应混合物加入细胞中，经过热激处理后，将平板在37摄氏度下过夜培养。培养后，平板上会形成白色和蓝色的菌落。

白色菌落表示PCR产物阳性。有插入片段的菌落为蓝色，表示PCR产物插入阴性。选取10个白色菌落和1个蓝色菌落。

每个菌落接种于2 mL液体LB培养基中，加入氨苄青霉素后，菌落在37摄氏度下过夜培养。培养过夜后，取菌落用于质粒提取，采用商业化的小量提取试剂盒进行操作。

含有滤膜的小型柱子用于质粒提取后的步骤。提取的质粒在0.7% AROS凝胶上进行可视化。此图显示的是0.7% AROS凝胶上的小量制备产物。第一泳道含有1 kb DNA ladder。

第二泳道包含蓝色对照菌落，第三至第十二泳道包含白色菌落。结果记录于工作表中，随后进行测序步骤，质粒被扩增。

使用这些试剂制备混合液。根据需要扩增的样本数量，将PCR混合液分装成若干等份。热循环程序设置如下：96°C 预变性1分钟，随后进行循环反应：96°C 变性10秒，50°C 退火5秒，60°C 延伸4分钟。

共25个循环。平均持续时间约为一小时。扩增完成后，使用含过滤柱的试剂盒纯化PCR产物。

将纯化后的产物加入到一块板中，然后将该板放入测序仪。获得测序结果后，将其提交至BLAST进行比对，从而鉴定各菌落的细菌种类。若菌落的序列同源性达到98%至100%，则视为阳性。

这是一例来自一名HIV阳性个体血浆的细菌测序结果。我们的研究结果表明，HIV疾病中的微生物易位涉及多种微生物菌群。我们已证实，HIV感染患者在全身循环中存在高度多样的微生物菌群。

对于HIV阴性的健康个体，外周血中的细菌DNA低于检测限，这可能反映了胃肠道屏障的完整性。目前我们的研究重点是探讨和分析外周血中微生物群可能在条件化、HIV免疫病理发生过程以及可能的治疗反应中所起的作用。