高通量酵母质粒过表达筛选

本实验的总体目标是利用质粒DNA文库对酵母细胞进行转化。首先培养适量的酵母细胞，随后用乙酸锂处理酵母细胞，使其具备DNA转化能力。

接下来，通过将感受态e细胞与DNA混合来转化它们。该实验流程的最后一步是筛选并分析转化子。最终，可通过酵母点板实验和/或显微镜观察获得结果，以显示质粒DNA对酵母表型的影响。

与现有的标准酵母转化等方法相比，该技术的主要优势在于能够以自动化方式将大量不同的质粒转入酵母细胞中。这一高通量酵母转化方案设计适用于10块96孔板，但可根据需要相应扩大或缩小规模。对于更大规模的实验，成功的关键在于保持所有培养板和试剂的有序管理。

实验开始后，为避免混淆，本方案将使用 Biobot 快速平板液体处理仪。首先，从酵母质粒文库中将 5 至 10 微升的血浆 DNA 分装至 96 孔圆底板的每个孔中。将未加盖的 96 孔板置于洁净工作台的通风橱内过夜干燥。

接下来，在500毫升带挡板的Lin Meyer烧瓶中，将待测菌株接种于200毫升酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中，于30°C振荡培养过夜。次日上午，将待测菌株用2升YPD培养基稀释至OD600为0.1，以获得最佳生长状态。在多个2.8升带挡板的烧瓶中分别培养至每瓶1升的培养物体积。

将锥形瓶在30摄氏度下振荡培养4至6小时，直至菌液的OD 600达到0.8至1.0。当酵母培养物的OD 600达到0.8至1.0时，通过离心收集细胞。将培养物分装至四个一次性225毫升锥形管中，在台式离心机中以3000 RPM离心5分钟。

从每支试管中倒出上清液 S。向同一试管中加入更多培养物，再次离心，必要时重复操作，直至收集全部细胞。用 50 毫升高压灭菌蒸馏水洗涤每个细胞沉淀，并通过涡旋振荡重新悬浮。

将细胞合并至一个225毫升的锥形管中，在3000 RPM下离心5分钟。去除上清液S后，用100毫升乙酸锂溶液重悬细胞。再次在3000 RPM下离心5分钟。

去除SNA，将细胞沉淀重悬于70毫升醋酸锂溶液中。高速涡旋约30秒，直至沉淀完全重悬。在30摄氏度下振荡孵育30分钟。

接下来，加入β-巯基乙醇至终浓度为0.1摩尔，于30摄氏度振荡孵育30分钟。30分钟孵育结束后，向细胞混合物中加入2毫升煮沸后冷却的鲑鱼精子DNA。将细胞混合物倒入可高压灭菌的单孔板中，然后去除形成的任何沉淀物，因为这些沉淀物可能干扰后续的移液操作。

使用生物机器人快速分液仪，将50 µL细胞混合物加入至先前准备好的四块96孔板的每孔中。含有质粒DNA的孔不要混匀。在细胞孵育期间，将这些板在室温下孵育30分钟，期间不进行振荡。

配制 200 毫升 PEG DMSO 醋酸锂溶液。将 160 毫升 50% PEG 3350、20 毫升 DMSO 和 20 毫升 1 摩尔醋酸锂混合。该溶液必须在使用前现配。

向每个样品中加入 125 微升 PEG 乙酸锂 DMSO 溶液。通过反复吸打细胞悬液八次充分混匀。在室温下静置孵育 30 分钟，不振荡。

接下来，在干式培养箱中于 42 摄氏度对细胞进行 15 分钟的热激处理。热激后不要叠放培养板，使用离心机适配器对 96 孔板进行离心。离心后，将培养板倒置在废液桶上方，去除 PEG 溶液。然后将倒置的培养板在纸巾上轻轻吸干。

为去除残留液体，细胞将留在孔底部。通过向每个孔中加入 200 µL 最低培养基来清洗细胞。再次离心培养板。

将上清液倒掉，置于废液桶上方，用纸巾吸干。每孔加入 200 µL 最小培养基，迅速将培养板置于 30 °C 条件下孵育两天，期间不进行振荡。两天后，成功转化的各孔底部应开始出现微小的细胞菌落。

为准备喷洒实验，首先向新的平底96孔板的每个孔中加入200微升OSE基础的最低培养基。接下来，使用移液器通过快速吸取和释放细胞悬液八次，混匀转化板的每个孔。

从转化平板中取五微升细胞混合物，接种至棉子糖平板的每个孔中，在30摄氏度下培养一天。次日，每个孔底部应出现微小菌落。

在超净工作台中进行点板实验，通过火焰灭菌对96孔接种针、复制器或点样器进行消毒。使用点样器混匀菌落，然后将菌落点在选择性培养基平板上。点板完成后，将平板置于超净工作台中干燥5至10分钟。

将平板在30摄氏度下孵育两到三天。图中展示的是利用酵母质粒过表达筛选来鉴定TDP-43毒性抑制因子和增强因子的代表性结果。TDP-43是一种人类蛋白，已被证实与肌萎缩侧索硬化症（即卢·格里克病）的发病机制相关。在酵母细胞中表达TDP-43会导致蛋白聚集和细胞毒性。

这些平板上含有整合了半乳糖诱导型 TDP43 质粒的菌落，且这些菌落还被转化了 Flex 基因 ORF 表达文库中的质粒。此处菌落呈红色，是因为该菌株恰好携带一种导致红色色素积累的突变。左侧平板中含有葡萄糖，可抑制 TDP43 或 Flex 基因质粒的表达。

右侧的培养皿含有半乳糖，可诱导 flex 基因质粒中 TDP-43 及其阅读框（O Fs）的表达。绿色箭头指示的菌落是转化了能够抑制 TDP-43 毒性的质粒的菌株，表现为生长更快、菌落更密集。红色箭头指示的菌落是转化了增强 TDP-43 毒性质粒的菌株，表现为生长较慢、菌落较稀疏。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何转化细胞游离DNA的文库。