Name: 高通量酵母质粒过表达屏幕 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习利用液体处理机器人对酿酒酵母进行高通量质粒转化，实现系统性过表达筛选以鉴定神经退行性疾病相关表型的遗传修饰因子。该方法可扩展且适用于多种细胞表型研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由约翰斯·霍普金斯大学ALS研究帕卡德中心资助项目（A.D.G.）、NIH主任新创新者奖1DP2OD004417-01（A.D.G.）、NIH R01 NS065317（A.D.G.）以及丽塔·艾伦基金会学者奖资助。A.D.G. 是由佩韦慈善信托基金支持的生物医学科学佩韦学者。

1. 酵母转化的准备工作
本方案适用于十块96孔板，但可根据需要相应扩大或缩小规模。我们发现，每轮转化操作中，若超过二十块96孔板，本方案的效果不佳。整个转化过程（从步骤I.3开始）大约需要八小时。
<ol>
<li>使用Biorobot RapidPlate液体处理仪，将酵母FLEXGene ORF文库中的质粒DNA（100 ng/μL）各5–10 μL分装至圆底96孔板的每个孔中。将未加盖的96孔板置于洁净台通风橱中过夜干燥。我们发现CEN和2μ酵母质粒的转化效率相似。</li>
<li>在500 mL带挡板的三角烧瓶中，向200 mL酵母胰蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L胰蛋白胨、20 g/L葡萄糖）接种待测菌株。在30°C条件下振荡培养过夜（200 rpm）。如有需要，起始培养也可使用选择性培养基。</li>
<li>次日早晨，将待测菌株在2 L YPD培养基中稀释至OD600=0.1。在30°C下振荡培养4–6小时（200 rpm），直至菌液OD600达到0.8–1.0。为获得最佳生长状态，建议在两个独立的2.8 L带挡板烧瓶中分别培养1 L菌液。如有需要，可使用选择性培养基替代YPD。</li>
</ol>
2. 酵母转化
<ol>
<li>通过离心收集细胞。将酵母培养物分装至四个一次性225 mL锥形管中，在台式离心机（Eppendorf 5810R）中以3000 rpm（约1800 × g）离心5分钟。倒去上清液，重复此步骤直至所有细胞均被收集。</li>
<li>用200 mL灭菌蒸馏H2O洗涤细胞。通过振荡或涡旋重悬细胞沉淀。将所有细胞合并至一个225 mL锥形管中，以3000 rpm离心5分钟，弃去上清液。</li>
<li>配制0.1 M LiOAc/1×TE溶液（含0.1 M LiOAc、10 mM Tris、1 mM EDTA，pH 8，溶于灭菌蒸馏水中）。用100 mL 0.1 M LiOAc/1×TE溶液洗涤细胞，3000 rpm离心5分钟，弃去上清液。</li>
<li>将细胞沉淀重悬于70 mL 0.1 M LiOAc/1×TE溶液中。通过振荡和/或涡旋确保沉淀完全重悬。</li>
<li>在30°C下振荡孵育30分钟（200 rpm）。</li>
<li>加入β-巯基乙醇至终浓度0.1 M，在30°C下振荡孵育30分钟（200 rpm）。注意：若使用对β-巯基乙醇敏感的酵母菌株，可省略此步骤。我们发现该步骤对转化成功并非必需，但可提高转化效率。</li>
<li>将2 mL超声处理的鲑鱼精子DNA（10 mg/mL）煮沸15分钟，随后置于冰上冷却。</li>
<li>向细胞混合物中加入2 mL煮沸后的鲑鱼精子DNA。注意：加入鲑鱼精子DNA后可能形成沉淀。使用移液器和200 μL吸头小心去除任何形成的沉淀，因其可能干扰后续移液操作。</li>
<li>使用BioRobot RapidPlate将50 μL细胞混合物分装至96孔板的每个孔中（也可使用多通道移液器）。不要混匀。</li>
<li>在室温下静置孵育30分钟，不振荡。</li>
<li>立即使用前配制200 mL 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1 M LiOAc溶液（160 mL 50% PEG-3350、20 mL DMSO、20 mL 1 M LiOAc）。</li>
<li>向每孔加入125 μL PEG/LiOAc/DMSO溶液，使用RapidPlate通过吸取和排液操作混悬细胞悬液共8次。</li>
<li>在室温下静置孵育30分钟，不振荡。</li>
<li>在干式培养箱中42°C热激15分钟。切勿叠放培养板。注意：我们发现该热激步骤对成功转化并非必需。对于某些酵母菌株（例如温度敏感型突变株），热激反而有害。我们此前已将热激时间缩短至1分钟，并成功利用本方案转化了携带ypt1温度敏感突变的酵母菌株。</li>
<li>使用适配96孔板的离心转子，在2500 rpm（约1100 × g）下离心5分钟。将培养板倒置于废液桶上以去除PEG溶液，然后将倒置的培养板轻压于纸巾上以吸除残留液体（细胞将保留在孔底）。</li>
<li>使用RapidPlate向每孔加入200 μL基本培养基（如SD/-Ura），对细胞进行冲洗。</li>
<li>以2500 rpm离心5分钟，将培养板倒置于废液桶上并用纸巾吸除上清液。</li>
<li>使用RapidPlate向每孔加入200 μL基本培养基（如SD/-Ura）。</li>
<li>在30°C下静置孵育2天，不振荡。2天后，成功转化的孔底部应开始出现微小菌落。</li>
</ol>
3. 点板实验
<ol>
<li>将200μL基于棉子糖的最小培养基（例如SRaf/-Ura）加入到新的平底96孔板的每个孔中。</li>
<li>使用Rapidplate通过吸取和加入细胞悬液各八次，混匀转化板的每个孔。</li>
<li>从转化板中取5μL细胞混合物接种至SRaf平板上。</li>
<li>在30°C下培养一天。一天后，每个孔底部应出现微小菌落。</li>
<li>在超净台中将菌落点种至SD/-Ura和SGal/-Ura平板上。通过火焰灭菌96孔复制器（frogger）。使用frogger混匀菌落后，再点种至选择性培养基平板上。点种后，在超净台中静置平板5–10分钟使其干燥。</li>
<li>在30°C下培养2–3天。</li>
</ol>

使用数码相机拍摄平板照片，并通过肉眼比较SGal/-Ura平板上菌落的生长情况，以寻找查询菌株毒性增强（生长较慢/菌落较稀疏）或受到抑制（生长较快/菌落较密集）的菌落。
4. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="微孔板实验比较葡萄糖和半乳糖中TDP-43的表达，突出基因调控。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 酵母质粒过表达筛选用于鉴定TDP-43毒性的抑制因子和增强因子。TDP-43是一种人类蛋白，已被证实与肌萎缩侧索硬化症（ALS，即卢·格里克病）的发病机制相关。在ALS患者的大脑和脊髓神经元中可观察到TDP-43的胞质聚集17。在酵母细胞中表达TDP-43会导致蛋白聚集和细胞毒性18。我们已利用该模型系统来阐明TDP-43毒性的分子机制19,20。图中展示了我们进行酵母TDP-43毒性修饰因子筛选时具有代表性的平板示例。这些平板上的菌落含有整合的半乳糖诱导型TDP-43质粒，并同时转化了FLEXGene ORF表达文库中的质粒。左侧平板含有葡萄糖，可抑制TDP-43或FLEXGene质粒的表达；右侧平板含有半乳糖，可诱导TDP-43及FLEXGene质粒中ORF的表达。绿色箭头指示的是转化了能够抑制TDP-43毒性的质粒的菌落；红色箭头指示的是转化了能够增强TDP-43毒性作用的质粒的菌落。

<ol><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nobel+Prize+and+beyond%3A+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li>
<li>Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Lecture.+Yeast+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nobel Lecture. Yeast and cancer.</a> Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).</li>
<li>Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+in+the+yeast+secretory+pathway+are+required+for+transport+of+carboxypeptidase+Y+to+the+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole.</a> Cell. 30, 439-448 (1982).</li>
<li>Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+of+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order of events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 25, 461-469 (1981).</li>
<li>Novick, P., Field, C., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+23+complementation+groups+required+for+post-translational+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 21, 205-215 (1980).</li>
<li>Sopko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%28%28R%29%29+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24, 913-919 (2007).</li>
<li>Gelperin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17, 536-543 (2007).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Mnaimneh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li>
<li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone%2C+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li>
<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了一种在酵母中进行高通量质粒过表达筛选的实验方案。该方法能够快速、无偏倚地筛选出多种不同细胞表型的遗传修饰因子。利用该方法，研究人员可在数周内对酵母基因组的相当一部分进行筛选。这种无偏倚的方法还可鉴定出基于以往研究结果难以预测的修饰因子。我们已应用该方法鉴定了与人类神经退行性疾病蛋白聚集相关毒性的修饰因子19,21-23。然而，由于本方案可灵活用于研究其他细胞过程，因此对于致力于解决广泛重要生物学问题的研究人员而言，该方案具有广泛应用价值。例如，我们还发现该筛选方法在鉴定参与应对环境应激（包括重金属和氧化应激）的基因和通路方面同样有效。本文重点介绍一种质粒文库，即酵母FLEXGene文库9。但目前已有其他多种酵母质粒文库可供选择，也可用于此类筛选6,8。

<table><tbody><tr><td>BioRobot RapidPlate</td><td>Qiagen</td><td>9000490</td><td></td></tr><tr><td>96针复制器（frogger）</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP404</td><td></td></tr><tr><td>FLEXGene ORF文库</td><td>哈佛医学院蛋白质组学研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 带挡板锥形瓶</td><td>Bellco Glass</td><td>2543-00500</td><td></td></tr><tr><td>2.8 L 三挡板Fernbach锥形瓶</td><td>Bellco Glass</td><td>2551-02800</td><td></td></tr><tr><td>100&amp;mu;L Rapidplate移液器吸头</td><td>Axygen Scientific</td><td>ZT-100-R-S</td><td></td></tr><tr><td>200&amp;mu;L Rapidplate移液器吸头</td><td>Axygen Scientific</td><td>ZT-200-R-S</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量酵母质粒过表达筛选

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae 是研究多种重要细胞过程基本机制的强大模式体系，其中许多过程与人类疾病直接相关。由于其世代时间短且基因组特征明确，酵母模式体系的一个主要实验优势在于能够开展遗传筛选，以鉴定参与特定生物学过程的基因和信号通路。在过去三十年中，此类遗传筛选已被用于阐明细胞周期、分泌途径以及更多在真核细胞生物学中高度保守的机制1-5。近年来，已构建出多个覆盖全基因组的酵母菌株和质粒文库6-10。这些资源使得研究人员能够系统地通过基因功能获得和功能缺失策略来探究基因功能11-16。本文提供了一种详细的实验方案，介绍如何结合液体处理机器人使用高通量酵母转化方法，利用包含5,500个酵母质粒的阵列文库开展质粒过表达筛选。我们已将此类筛选用于鉴定与聚集倾向性人类神经退行性疾病相关蛋白积累所引发的毒性作用相关的遗传修饰因子。本文所述方法可便捷地适用于其他感兴趣细胞表型的研究。

本文介绍了一种在Saccharomyces cerevisiae中进行质粒过表达筛选的方法，该方法采用阵列式质粒文库，并结合液体处理机器人进行高通量酵母转化实验。

芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）是研究多种重要细胞过程基本机制的强有力模型系统，……

本实验的总体目标是利用质粒DNA文库对酵母细胞进行转化。首先培养适量的酵母细胞，随后用乙酸锂处理酵母细胞，使其具备DNA转化能力。接下来，通过将感受态e细胞与DNA混合来转化它们。该实验流程的最后一步是筛选并分析转化子。最终，可通过酵母点板实验和/或显微镜观察获得结果，以显示质粒DNA对酵母表型的影响。与现有的标准酵母转化等方法相比，该技术的主要优势在于能够以自动化方式将大量不同的质粒转入酵母细胞中。这一高通量酵母转化方案设计适用于10块96孔板，但可根据需要相应扩大或缩小规模。对于更大规模的实验，成功的关键在于保持所有培养板和试剂的有序管理。实验开始后，为避免混淆，本方案将使用 Biobot 快速平板液体处理仪。首先，从酵母质粒文库中将 5 至 10 微升的血浆 DNA 分装至 96 孔圆底板的每个孔中。将未加盖的 96 孔板置于洁净工作台的通风橱内过夜干燥。接下来，在500毫升带挡板的Lin Meyer烧瓶中，将待测菌株接种于200毫升酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中，于30°C振荡培养过夜。次日上午，将待测菌株用2升YPD培养基稀释至OD600为0.1，以获得最佳生长状态。在多个2.8升带挡板的烧瓶中分别培养至每瓶1升的培养物体积。将锥形瓶在30摄氏度下振荡培养4至6小时，直至菌液的OD 600达到0.8至1.0。当酵母培养物的OD 600达到0.8至1.0时，通过离心收集细胞。将培养物分装至四个一次性225毫升锥形管中，在台式离心机中以3000 RPM离心5分钟。从每支试管中倒出上清液 S。向同一试管中加入更多培养物，再次离心，必要时重复操作，直至收集全部细胞。用 50 毫升高压灭菌蒸馏水洗涤每个细胞沉淀，并通过涡旋振荡重新悬浮。将细胞合并至一个225毫升的锥形管中，在3000 RPM下离心5分钟。去除上清液S后，用100毫升乙酸锂溶液重悬细胞。再次在3000 RPM下离心5分钟。去除SNA，将细胞沉淀重悬于70毫升醋酸锂溶液中。高速涡旋约30秒，直至沉淀完全重悬。在30摄氏度下振荡孵育30分钟。接下来，加入β-巯基乙醇至终浓度为0.1摩尔，于30摄氏度振荡孵育30分钟。30分钟孵育结束后，向细胞混合物中加入2毫升煮沸后冷却的鲑鱼精子DNA。将细胞混合物倒入可高压灭菌的单孔板中，然后去除形成的任何沉淀物，因为这些沉淀物可能干扰后续的移液操作。使用生物机器人快速分液仪，将50 µL细胞混合物加入至先前准备好的四块96孔板的每孔中。含有质粒DNA的孔不要混匀。在细胞孵育期间，将这些板在室温下孵育30分钟，期间不进行振荡。配制 200 毫升 PEG DMSO 醋酸锂溶液。将 160 毫升 50% PEG 3350、20 毫升 DMSO 和 20 毫升 1 摩尔醋酸锂混合。该溶液必须在使用前现配。向每个样品中加入 125 微升 PEG 乙酸锂 DMSO 溶液。通过反复吸打细胞悬液八次充分混匀。在室温下静置孵育 30 分钟，不振荡。接下来，在干式培养箱中于 42 摄氏度对细胞进行 15 分钟的热激处理。热激后不要叠放培养板，使用离心机适配器对 96 孔板进行离心。离心后，将培养板倒置在废液桶上方，去除 PEG 溶液。然后将倒置的培养板在纸巾上轻轻吸干。为去除残留液体，细胞将留在孔底部。通过向每个孔中加入 200 µL 最低培养基来清洗细胞。再次离心培养板。将上清液倒掉，置于废液桶上方，用纸巾吸干。每孔加入 200 µL 最小培养基，迅速将培养板置于 30 °C 条件下孵育两天，期间不进行振荡。两天后，成功转化的各孔底部应开始出现微小的细胞菌落。为准备喷洒实验，首先向新的平底96孔板的每个孔中加入200微升OSE基础的最低培养基。接下来，使用移液器通过快速吸取和释放细胞悬液八次，混匀转化板的每个孔。从转化平板中取五微升细胞混合物，接种至棉子糖平板的每个孔中，在30摄氏度下培养一天。次日，每个孔底部应出现微小菌落。在超净工作台中进行点板实验，通过火焰灭菌对96孔接种针、复制器或点样器进行消毒。使用点样器混匀菌落，然后将菌落点在选择性培养基平板上。点板完成后，将平板置于超净工作台中干燥5至10分钟。将平板在30摄氏度下孵育两到三天。图中展示的是利用酵母质粒过表达筛选来鉴定TDP-43毒性抑制因子和增强因子的代表性结果。TDP-43是一种人类蛋白，已被证实与肌萎缩侧索硬化症（即卢·格里克病）的发病机制相关。在酵母细胞中表达TDP-43会导致蛋白聚集和细胞毒性。这些平板上含有整合了半乳糖诱导型 TDP43 质粒的菌落，且这些菌落还被转化了 Flex 基因 ORF 表达文库中的质粒。此处菌落呈红色，是因为该菌株恰好携带一种导致红色色素积累的突变。左侧平板中含有葡萄糖，可抑制 TDP43 或 Flex 基因质粒的表达。右侧的培养皿含有半乳糖，可诱导 flex 基因质粒中 TDP-43 及其阅读框（O Fs）的表达。绿色箭头指示的菌落是转化了能够抑制 TDP-43 毒性的质粒的菌株，表现为生长更快、菌落更密集。红色箭头指示的菌落是转化了增强 TDP-43 毒性质粒的菌株，表现为生长较慢、菌落较稀疏。观看本视频后，您应该能够充分理解如何转化细胞游离DNA的文库。

high-throughput-yeast-plasmid-overexpression-screen

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高通量酵母质粒过表达屏幕

我们已开发出全面且无偏倚的全基因组筛选方法，以研究基因-药物和基因-环境之间的相互作用。本文介绍了对这些突变体文库进行筛选的方法。...

条形码酵母文库的竞争性基因组筛选

我们提供了一种详细的方案，用于在酿酒酵母（Saccharomyces...

在Saccharomyces cerevisiae中的定向进化方法：突变文库的构建与筛选

本方案描述了一种高通量方法，用于在S.

基于蛋白质遗传的高通量筛选 S. cerevisiae

批量处理酵母双杂交筛选可实现多种诱饵蛋白与高度复杂的猎物融合蛋白集合之间相互作用谱的直接比较。本文介绍了优化的方法、新试剂及其在此类筛选中的应用方式。...

一种批量进行的酵母双杂交筛选方法用于比较蛋白质相互作用

本文介绍了一种基于交配的方法，利用阵列式质粒文库促进芽殖酵母中的过表达筛选。...

基于交配的酵母过表达文库筛选

细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以靶向关键的生物学过程。确定细菌效应蛋白所靶向的宿主通路，是阐明分子致病机制的关键。本文介绍了一种利用改良的酵母抑制和毒性筛选方法，以揭示有毒细菌效应蛋白所靶向的宿主通路。...

利用酵母毒性及抑制子筛选鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路

微生物工程“设计-构建-测试”循环中的一个瓶颈在于对菌株进行功能筛选的速度。本文介绍了一种高通量菌株筛选方法，每次实验可应用于数百至数千个酵母细胞，该方法采用基于液滴的RNA测序技术。...

基于液滴的高通量酵母菌株表型分析与RNA测序

本实验方案旨在提供一份详细的分步指南，用于基于Golden...

使用模块化Golden Gate克隆技术快速组装多基因结构

本方案描述了进行酵母表面展示筛选实验的关键步骤，以富集能够结合目标抗原的蛋白质变体。...

利用酵母表面展示技术进行蛋白质工程

本文介绍了一种利用酵母表面展示底物进行酶促修饰检测的实验方案。该平台以酪氨酸磷酸酶SHP-2对其某一底物去磷酸化活性的分析为例，展示了典型的酶促修饰检测方法。...

酵母表面展示蛋白的酶法修饰及流式细胞术分析

学习利用液体处理机器人对酿酒酵母进行高通量质粒转化，实现系统性过表达筛选以鉴定神经退行性疾病相关表型的遗传修饰因子。该方法可扩展且适用于多种细胞表型研究。

高通量酵母质粒过表达筛选

探索更多视频