高通量酵母质粒过表达屏幕
2011年7月27日
在这里，我们描述了一个质粒的过度表达屏幕酿酒酵母，使用液体处理机器人摆着质粒库和高通量酵母转化协议。
该程序的总体目标是使用血浆 DNA 阵列文库转化酵母细胞。这是通过首先培养适量的酵母细胞来实现的。然后用乙酸锂处理酵母细胞，使其能够进行 DNA 转化。
接下来，通过将感受态 e 细胞与 DNA 混合来转化感受态 e 细胞。该过程的最后一步是选择和分析转化体。最终，可以通过酵母点测定和/或显微镜检查获得显示血浆 DNA 对酵母表型影响的结果。
与现有方案（例如标准酵母转化）相比，该技术的主要优点是它允许以自动化方式将大量不同的质粒转化为酵母细胞。这种高通量酵母转化方案专为 10 个 96 孔板设计，但可以相应地放大或缩小。对于更大规模的实验，成功的关键是保持所有板和试剂井井有条。
一旦实验进行以避免混淆，该方案将使用 Biobot 快速板液体处理器 为了开始等分，将来自阵列酵母质粒文库的 5 至 10 微升血浆 DNA 放入轮的每个孔中。底部 96 孔板。将未覆盖的 96 孔板放入干净的工作台通风橱中过夜晾干。
接下来，在 500 毫升带挡板的 Lin Meyer 烧瓶中接种 200 毫升酵母肽葡萄糖或 YPD 培养基和查询菌株，在 30 摄氏度下孵育过夜，第二天早上摇动。在两升 YPD 培养基中将查询菌株稀释至 OD 600 为 0.1，以实现最佳生长。在单独的 2.8 L 挡板培养瓶中培养至 1 升。
在 30 摄氏度下摇动培养瓶 4 到 6 小时，直到培养物达到 0.8 至 1.0 的 OD 600。当酵母培养物达到 0.8 至 1.0 的 OD 600 时，通过离心收获细胞。用培养物填充四个一次性 225 mL 锥形管，并在台式离心机中以 3000 RPM 离心 5 分钟。
从每个试管中倒出 S 上清液。向相同的试管中加入更多培养物并再次离心，根据需要重复，直到收获所有细胞。在 50 毫升高压灭菌器蒸馏水中洗涤每个细胞沉淀，然后涡旋 Resus 花费。
将细胞混合在一个 225 mL 锥形管中，并以 3000 RPM 离心 5 分钟。去除 S 上清液后，用 100 毫升醋酸锂溶液洗涤细胞。再次以 3000 RPM 的速度旋转 5 分钟。
去除 SNA，将细胞沉淀重悬于 70 毫升乙酸锂溶液中。高速涡旋约 30 秒，直到沉淀完全重悬。在 30 摄氏度下振荡孵育 30 分钟。
接下来，将 β me capto 乙醇加入 0.1 摩尔中，在 30 摄氏度下振荡孵育 30 分钟。孵育 30 分钟后，向细胞混合物中加入 2 毫升煮熟和冷藏的鲑鱼精子 DNA。将细胞混合物倒入可高压灭菌的单孔板中，然后去除形成的任何沉淀物，因为这可能会干扰下游移液。
使用 biobot 快速板，将 50 μL 细胞混合物分装到先前制备的四个孔中的每个孔中。含有血浆 DNA 的 96 孔板不混合。在室温下孵育板 30 分钟，不要在细胞孵育时摇晃。
制备 200 毫升 PEG DMSO 醋酸锂溶液。将 160 毫升 50% PEG 33、50 20 毫升 DMSO 和 20 毫升 1 摩尔乙酸锂混合。重要的是在使用前准备好这种溶液。
向每个溶液中加入 125 微升 PEG 醋酸锂 DMSO 溶液。通过吸出和分配细胞悬液 8 次充分混合。在室温下孵育 30 分钟，不要摇晃。
接下来，在 42 摄氏度下对细胞进行热休克 15 分钟在干燥的培养箱中，热休克后不要堆叠板，使用离心机适配器旋转板以容纳 96 孔板。离心后，将板倒置在废液桶上，去除 PEG 溶液。然后在纸巾上吸干倒置的板子。
为了去除残留液体，细胞将保留在孔的底部。通过向每个细胞中加入 200 微升最低培养基来冲洗细胞。再次旋转板。
通过在废液桶上倒置并在纸巾上吸干来去除上清液。用快速板向每个孔中加入 200 微升最低培养基，在 30 摄氏度下孵育两天，不要摇晃。两天后，小细胞集落应开始在每个成功转化的细胞底部形成。
为了准备 Spatting 测定，首先将 200 微升基于 OSE 的最小培养基分配到新公寓的每个孔中。底部 96 孔板。下一个。通过吸出并用快速板分配细胞悬液八次来混合转化板的每个孔。
用来自转化板的 5 微升细胞混合物接种棉子糖板的每个孔，在 30 摄氏度下孵育一天。第二天。每个细胞的底部都应该有小菌落。
在引擎盖中进行点样测定，通过燃烧对 96 螺栓、复制器或青蛙进行消毒。将菌落与青蛙混合，然后在选择性培养基板上发现菌落。点样后，让板在通风橱中干燥 5 到 10 分钟。
将板在 30 摄氏度下孵育 2 到 3 天。此处显示了酵母质粒在表达筛选中鉴定 TDP 43.毒性的抑制因子和增强因子的代表性结果。TDP 43 是一种人类蛋白，与肌萎缩侧索硬化症或 Lou Gehrig 病的发病机制有关，在酵母细胞中表达 TDP 43 会导致聚集和细胞毒性。
这些板显示具有整合的半乳糖诱导型 T DP 43 质粒的菌落，这些质粒也已用来自弯曲基因 ORF 表达文库的质粒转化。这里的菌落呈红色，因为该菌株恰好发生了导致红色素积累的突变。左侧的板含有葡萄糖，可抑制 T DP 43 或屈曲基因质粒的表达。
右侧的板含有半乳糖，可诱导 Flex 基因质粒中 TDP 43 和 O Fs 的表达。绿色箭头表示用抑制 TDP 43 毒性的质粒转化的菌落，如生长更快和菌落更密集所示。红色箭头表示用质粒转化的菌落，该质粒增强了 TDP 43 的毒性，如生长较慢和密度较低的菌落所示。
观看此视频后，您应该对如何转化避免血浆 DNA de 细胞文库有很好的了解。
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概述
本文描述了利用高通量酵母转化协议在酿酒酵母中进行质粒过表达筛选。该过程涉及用质粒DNA阵列库转化酵母细胞，以分析对酵母表型的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 遗传学
- 细胞生物学
背景
- 质粒过表达筛选对于研究基因功能至关重要。
- 酿酒酵母是遗传学研究的模式生物。
- 高通量方法提高了遗传转化的效率。
- 了解酵母表型可以为更广泛的生物过程提供见解。
研究目的
- 用质粒DNA转化酵母细胞以评估基因功能。
- 利用液体处理机器人进行高通量转化。
- 分析转化子的表型变化。
使用的方法
- 将酵母细胞培养至适当密度。
- 用锂醋酸处理细胞以诱导转化能力。
- 将能胜细胞与质粒DNA混合进行转化。
- 通过酵母点滴试验和显微镜分析选择并分析转化子。
主要结果
- 成功用质粒DNA转化酵母细胞。
- 识别转化子的表型变化。
- 展示高通量方法的有效性。
- 洞察酵母中特定基因的功能角色。
结论
- 质粒过表达筛选是遗传分析的有价值工具。
- 高通量技术可以显著加速酵母遗传学研究。
- 结果有助于理解基因功能和调控。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput yeast plasmid overexpression screens enable systematic identification of genetic modifiers impacting cellular phenotypes relevant to human disease. This scalable approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by leveraging a well-characterized eukaryotic model. Integration of automated liquid handling accelerates discovery inflection points and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and pathway involvement in disease-relevant phenotypes.
- Supports identification of genetic suppressors and enhancers for mechanistic de-risking.
- Facilitates functional target validation through systematic gain-of-function screening.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets in complex biological systems.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes assay conditions using automated liquid handling for reproducibility.
- Generates quantitative phenotypic outputs for reliable compound or genetic evaluation.
- Enables scalable screening of thousands of plasmids in parallel for robust data generation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast phenotypes with human disease mechanisms for translational continuity.
- Supports identification of genetic modifiers relevant to neurodegenerative disease models.
- Provides a platform for risk-adjusted advancement of targets into preclinical validation.
- Offers predictive de-risking value by modeling aggregation-prone protein toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput yeast transformation protocol bridges early discovery and lead identification by enabling systematic genetic screens with direct translational relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for disease mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible yeast models for high-throughput evaluation.
- Analytics: Provides quantitative colony growth and density measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects yeast-based findings to preclinical disease models when aligned with human protein toxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable screening capability for diverse phenotypic endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage screens.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and high-throughput screening protocols.
- Depends on access to liquid handling robotics and 96-well plate infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay setup and data analysis.
- Adaptable to various phenotypes but may require optimization for specific readouts.
- Scalability and reproducibility depend on rigorous plate and reagent management.
