Name: 准备在鼠害外伤性癫痫的底切模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习在鼠类中制备底切模型用于创伤后癫痫发生研究的方法。该视频演示如何使用定制手术器械在大鼠大脑皮层创建精确扇形损伤，并通过场电位记录评估癫痫样活动，为神经科学研究提供可靠的动物模型。

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本研究得到了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）资助项目4R00 NS 057940，以及印第安纳州卫生部脊髓与脑损伤研究基金（SCBI 200-12）的资助。

1. 制作一种用于 undercut 手术的简易装置
<ol>
<li>我们设计的 undercut 装置由三个部分组成（图 1）：（1）由不锈钢或塑料制成的支撑板，用于固定导管和针头，在手术过程中横跨颅窗；（2）导管，用于固定针头位置并允许针头旋转；（3）针头，在距离尖端约 3 mm 处呈 90 度弯曲，可通过旋转和插入进行移动。</li>
<li>取一块 1-1.5 mm 厚、7~10 × 30 mm 的矩形不锈钢或透明塑料（1），用于制作支撑板。准备一支 1.5 英寸 22 号（BD 公司，#305156）和一支 1.5 英寸 25 号（BD 公司，#305127）的注射针头。制作导管时，将 22 号注射针头的塑料端和下部针尖切除，使其总长度约为 31-32 mm（2）。打磨金属端，使其平整光滑。该导管的最终长度应比 25 号注射针头短约 5-6 mm。</li>
<li>使用氰基丙烯酸盐胶水将导管固定在支撑板上，确保针头与金属边缘垂直。</li>
<li>将 25 号注射针头插入导管中，并在距离尖端 2.5-3 mm 处将针头弯曲 90 度（图 1）。</li>
<li>通过在针头上端粘接一段小塑料管来调节针头的垂直移动范围（图 1，针头限位器）。针头的最终移动范围决定了其可插入皮层的深度，P21 大鼠应为 1.6-1.8 mm，P21 小鼠应为 1.3-1.5 mm。此长度需根据动物的不同种类和年龄进行调整。</li>
<li>在针头上端沿弯曲尖端方向粘接一段细铜丝或一小段胶带（图 1，针头指示器）。该铜丝或胶带用于指示 undercut 手术过程中针头的旋转角度（图 1）。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
<li>所有手术器械均需经过高压灭菌、玻璃珠灭菌器灭菌，或使用70%乙醇消毒。</li>
<li>我们使用出生后20至22天（P20-22）的Sprague/Dawley大鼠或同龄CD1小鼠。根据不同研究项目的需要，也可选用其他品系的小鼠或大鼠。</li>
<li>通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg的氯胺酮和8 mg/kg的赛拉嗪进行麻醉。当动物对尾部夹捏无反应时，开始手术操作。在手术过程中，如必要，可追加原麻醉混合剂剂量的三分之一作为补充剂量，以恢复原有的麻醉状态。</li>
<li>使用电动理发器剪除动物头皮上的毛发。在动物眼睛上涂抹少量眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。先用10%聚维酮碘溶液对头皮进行消毒，再用70%乙醇擦拭。</li>
<li>将动物固定于立体定位仪上，以保持头部稳定不动。在整个手术过程中，将动物置于加热垫上，以防低体温。</li>
<li>使用手术刀沿中线从前向后做一纵行切口，切口范围从人字缝延伸至两眼之间。用止血钳将皮肤拉开，充分暴露左侧颅骨。</li>
<li>在左侧颅骨上做一矩形切口，并用手术刀刮除骨膜。此步骤可减少出血，并有利于后续颅骨钻孔操作。</li>
</ol>
3. 制作倒凹
<ol>
<li>在暴露的颅骨区域滴加少量无菌生理盐水，然后使用若干棉签清除血液并擦干该区域。</li>
<li>在手术显微镜下，于左侧颅骨中央（大约位于左侧感觉运动皮层上方）钻出一个矩形沟槽（大鼠约为 5 × 7 mm，小鼠为 4 × 5 mm）。在颅骨上滴加一滴生理盐水有助于钻孔并散热。当钻至骨层深度约 2/3 时，吸除多余生理盐水，并用棉签清洁钻孔区域。随后缓慢而小心地继续加深钻孔，直至中央骨片在镊子轻触下可移动。</li>
<li>将镊子尖端插入骨片边缘，缓慢抬起镊子，小心移除中央骨片，以暴露左侧大脑半球。</li>
<li>在手术显微镜下，手持 undercut 装置，使针头朝向旁矢状方向，支撑板垂直于中线，并将装置轻微向尾侧倾斜，以便持续观察针尖及目标皮层区域。将针尖对准冠状窗中部、上矢状窦外侧 1–2 mm 的区域，避免直接穿透大血管。</li>
<li>将针头水平方向穿过硬脑膜并在软脑膜下推进，以避开血管。将 undercut 装置底部置于颅骨窗两侧边缘，使针头垂直于皮层表面（图 1）。用手将装置稳定地置于颅骨窗边缘，可显著减少或消除后续操作中的手部抖动。将针头抬升至软脑膜下方，然后缓慢下放，进行横穿皮层的切割，直至针头无法继续深入。随后将针头朝远离中线方向旋转约 135°，形成一个半圆形的白质/深层 VI 层 undercut。再次将针头抬升至软脑膜下方，向后倾斜装置并撤出针头。</li>
<li>可选步骤：可重复上述操作（步骤 2.5），但在过程中不旋转针头，以在颅骨窗的外侧边缘额外制作一条横穿皮层的切口，从而实现更完全的皮层隔离。</li>
<li>将一片塑料薄膜（6 × 6 mm）覆盖在颅骨窗上以作保护，缝合头皮。将动物置于加热垫上，直至其从麻醉中完全恢复。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
冠状皮层切片可用于验证减压切开手术的成功。在制备的切片中可进行确认 &gt;术后2周，在显微镜低倍镜下可辨认出经皮质切口和潜切切口（图2）。部分分离的皮质通常会略微变薄，且在大多数皮质脑片中可通过场电位记录检测到癫痫样活动（图3）。 
相比之下，白质或深层皮质层中形成较大的孔洞、病变皮质显著变薄，或切片位置偏离白质上方或下方，均会导致脑组织无法用于后续实验。 
<img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig1.jpg" alt="立体定位手术示意图，用于精确注射或病灶定位的脑部针具装置设置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 潜切装置的结构与应用。 一根导管（2）被粘附在由不锈钢或透明塑料制成的支撑板（1）上。一根注射器针头（3）穿过导管，并在其尖端前约3 mm处弯曲。在针头上端粘附一个由塑料管制成的针止位器，使针头的垂直移动范围分别限制在约1.2 mm（用于P21小鼠）和约1.5 mm（用于大鼠）。一段细铜丝固定在手柄下方，作为弯针方向的指示标志。请注意，该装置呈倾斜状态，并与颅窗边缘两侧接触，以便制作与软脑膜表面平行的切口。
<img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig2.jpg" alt="结晶过程、显微镜图像，突出显示晶体生长模式和结构形成。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 深层切片的代表性图像。A. 对P48大鼠在造模后两周制备的脑片进行荧光成像。切割损伤部位用荧光染料DiI标记。右侧白色箭头指示穿过皮层的切口，底部箭头指示穿过第四层与白质边界处的深层切口。
<img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig3.jpg" alt="神经信号记录，电生理图，显示随时间变化的电压，突触活动。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 来自切开式脑片的场电位记录。 来自切开式脑片的场电位记录显示出癫痫样活动，提示受损皮层组织存在过度兴奋性。

<ol><li>Hoffman, S. N., Salin, P. A., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+neocortical+epileptogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chronic neocortical epileptogenesis in vitro.</a> J Neurophysiol. 71, 1762-1773 (1994).</li>
<li>Topolnik, L., Steriade, M., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperexcitability+of+intact+neurons+underlies+acute+development+of+trauma-related+electrographic+seizures+in+cats+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperexcitability of intact neurons underlies acute development of trauma-related electrographic seizures in cats in vivo.</a> Eur J Neurosci. 18, 486-496 (2003).</li>
<li>Graber, K., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraber%2C+K+%22Models+of+Seizures+and+Epilepsy%22">Models of Seizures and Epilepsy</a>. , Elsevier. 477-493 (2005).</li>
<li>Nita, D. A., Cisse, Y., Timofeev, I., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+propensity+to+seizures+after+chronic+cortical+deafferentation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Increased propensity to seizures after chronic cortical deafferentation in vivo.</a> J Neurophysiol. 95, 902-913 (2006).</li>
<li>Sharpless, S. K., Halpern, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrical+excitability+of+chronically+isolated+cortex+studied+by+means+of+permanently+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The electrical excitability of chronically isolated cortex studied by means of permanently implanted electrodes.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 244-255 (1962).</li>
<li>Echlin, F. A., Battista, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+Seizures+from+Chronic+Isolated+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epileptiform Seizures from Chronic Isolated Cortex.</a> Arch Neurol. 9, 154-170 (1963).</li>
<li>Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptogenic+neurons+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epileptogenic neurons and circuits.</a> Adv Neurol. 79, 665-684 (1999).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neuropathology+and+impact+of+perinatal+brain+damage.+II%3A+white+matter+lesions+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental neuropathology and impact of perinatal brain damage. II: white matter lesions of the neocortex.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56, 219-235 (1997).</li>
<li>Jin, X., Prince, D. A., Huguenard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitatory+synaptic+connectivity+in+layer+v+pyramidal+neurons+of+chronically+injured+epileptogenic+neocortex+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitatory synaptic connectivity in layer v pyramidal neurons of chronically injured epileptogenic neocortex in rats.</a> J Neurosci. 26, 4891-4900 (2006).</li>
<li>Li, H., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+in+chronically+injured%2C+epileptogenic+sensory-motor+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex.</a> J Neurophysiol. 88, 2-12 (2002).</li>
<li>Salin, P., Tseng, G. F., Hoffman, S., Parada, I., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+sprouting+in+layer+V+pyramidal+neurons+of+chronically+injured+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal sprouting in layer V pyramidal neurons of chronically injured cerebral cortex.</a> J Neurosci. 15, 8234-8245 (1995).</li>
<li>Avramescu, S., Nita, D. A., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+post-traumatic+epileptogenesis+is+associated+with+loss+of+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Neocortical post-traumatic epileptogenesis is associated with loss of GABAergic neurons.</a> J Neurotrauma. 26, 799-812 (2009).</li>
<li>Avramescu, S., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+strength+modulation+after+cortical+trauma%3A+a+role+in+epileptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic strength modulation after cortical trauma: a role in epileptogenesis.</a> J Neurosci. 28, 6760-6772 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

潜掘模型是研究创伤后癫痫发生的一种高效系统。典型的手术仅需约20-30分钟即可完成，术后两周可在大多数动物的脑片中记录到诱发性或自发性癫痫样活动1-2。更重要的是，该模型模拟了创伤性脑损伤后的一些变化特征，如出血、炎症、水肿、轴突切断和神经元死亡7。不仅在啮齿类及其他动物中观察到癫痫样活动，而且在具有类似皮层损伤的人类患者中也已记录到癫痫发作8。近年来，在阐明其潜在机制方面已取得显著进展。在损伤后&gt;2周的脑片中已记录到自发性和诱发性痫样间歇放电，这些活动被发现起源于大鼠皮层第五层1。已有证据表明存在神经环路重组、GABA能中间神经元丢失及去抑制现象、神经元膜兴奋性增强以及兴奋性突触连接增强，这些变化尤其明显地出现在皮层第五层2,9-13。
本文介绍了一种用于制作潜行性损伤（undercut lesions）的新型仪器。当徒手进行潜行手术时，手部震颤常导致难以稳定且精确地制作皮层损伤。尽管通过练习和经验积累可提高手术质量，但损伤的深度和质量仍存在显著差异。本文所介绍的装...

<table><tbody><tr><td>福多姆微型电机套装</td><td>设备</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>1.5 英寸 22 号注射器针头</td><td>材料</td><td>BD Biosciences</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>1.5 英寸 25 号注射器针头</td><td>材料</td><td>BD Biosciences</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>材料</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>14450</td><td></td></tr></tbody></table>

制备啮齿类动物创伤后癫痫发生的潜伏期模型

Preparing Undercut Model of Posttraumatic Epileptogenesis in Rodents

部分分离皮层（“下切”）是一种创伤后癫痫发生的动物模型。该手术操作包括切开感觉运动皮层及其下方的白质（下切），从而使大脑皮层的特定区域在很大程度上与邻近皮层及皮层下区域隔离开来1-3。术后经过两周或更长时间的潜伏期后，可在啮齿类动物的脑片中记录到癫痫样放电1；而在其他物种（如猫和猴）中则可观察到体内（in vivo）的电生理发作或行为性癫痫发作4-6。这一成熟的动物模型能够有效模拟创伤性脑损伤的多个重要特征。然而，在小型啮齿类动物脑组织中徒手进行精确的皮层损伤在技术上具有挑战性。基于斯坦福大学David Prince博士实验室最初建立的手术方法1，本文介绍了一种改进的技术，用于在小鼠和大鼠中制备该动物模型。我们展示了如何制作一种简易的手术装置，并利用该装置更好地控制切割深度和角度，从而获得更精确且可重复性更高的结果。该装置制作简便，操作方法易于掌握。该动物模型的建立为研究创伤后癫痫发生的机制提供了一个高效的实验体系。

部分分离的皮层（“下切”）是一种研究创伤后癫痫发生的有效动物模型。本文将演示如何制作一种新型外科手术装置，并利用该装置制造更精确且可重复的病灶，以建立此模型。

部分分离的皮层（“ undercut ”）是一种创伤后癫痫发生的动物模型。手术过程包括切穿……

本实验方案将演示如何制备大鼠创伤后癫痫发生的 undercut 模型。第一步是制作一种简易装置，以提高 undercut 手术的精确性和一致性。随后对动物进行手术准备，并在颅骨表面切开颅窗，以暴露脑组织。最后，将减压装置的针头插入大脑皮层的白质，并旋转以在目标区域形成扇形减压切口。最终，可通过场电位记录获得显示脑片中癫痫样活动的结果。该技术的主要优势在于，使用一种简易的自制手术装置即可实现更精确且一致的切口操作。该动物模型可用于回答与创伤性脑损伤后癫痫发生相关的关键问题。尽管这种方法常用于大鼠，但也同样适用于小鼠。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，因为徒手在啮齿类动物皮层上制造如此精确的损伤灶具有较高难度。手术装置由三部分组成：支撑板、导向管以及在尖端附近呈90度弯曲的针头。为了准备用于三至四周龄大鼠手术的 undercut 装置，首先切割一块厚度为1至1.5毫米、尺寸为7至10毫米×30毫米的矩形不锈钢或透明塑料材料以制作支撑板。取一支25号和一支22号注射针头，测量25号针头的长度。接下来，剪去22号针头的塑料末端，测量针头标记的总长度，并在适当位置剪断22号针头，使其导管最终长度比25号注射器针头短约5至6毫米。将末端打磨平整光滑。使用氰基丙烯酸酯胶水将导管固定在支撑板上，确保针头与支撑板边缘垂直且对齐。将25号注射器针头插入导引管中，并在距针尖2.5至3毫米处将针头弯曲90度。最后，在针头上端沿弯曲尖端的方向固定一根细铜线或一小段胶带。金属丝或胶带用于指示在潜行手术期间针头的旋转角度。在开始此操作之前，请咨询所在机构的动物护理和使用委员会，以获得以下操作的必要批准。首先，确保所有手术器械均使用经批准的方法进行了灭菌，并且手术区域具备无菌环境。根据批准的方案对动物进行麻醉，并通过尾部夹捏测试确保动物已完全麻醉。使用电推剪剃除动物头部将要切口区域周围的毛发。然后用10%聚维酮碘溶液对头皮进行消毒，再用70%乙醇冲洗。用眼药膏涂抹动物的眼睛，以防止其干燥。手术过程中，将动物固定在立体定位仪上，以保持头部处于稳定、固定的位置。建议将动物置于加热垫上，以防止低体温。使用手术刀，在头皮上从人字缝（Lambda）至两眼之间做一条正中前后方向的切口。然后使用止血钳将皮肤拉开，充分暴露颅骨左侧。使用手术刀在颅骨左侧切出一个矩形切口，并刮除骨膜。此步骤将减少出血并便于在颅骨上钻孔。首先，使用无菌生理盐水和若干棉签清洁颅骨，以清除血液并干燥该区域。然后在颅骨左侧中央滴加一滴无菌生理盐水。然后开始钻孔，在颅骨左侧中央制作一个 4 × 5 毫米的矩形凹槽。当钻至大约三分之二骨深度时，清除多余的生理盐水，并用棉签清洁钻孔区域。缓慢而小心地继续加深钻孔，直至中央骨片可通过镊子轻触而活动。用镊子轻轻夹住中央骨片，同时握住减压装置，缓慢抬起骨窗以暴露左侧大脑半球，小心移除中央骨片。将针头朝向矢状旁方向，支撑板垂直于中线。将针头尖端对准颅窗中部、上矢状缝外侧1至2毫米处，注意避开较大的血管。接下来，将针头水平穿过硬脑膜并从桥状结构下方插入。为避免损伤血管，将 undercut 装置的底部置于颅窗的两侧边缘，使针头垂直于皮层表面。通过轻微抬高针头，确认其位于桥状结构下方。然后缓慢降低针头，进行贯穿皮层的切口，直至针头无法继续深入。接着，将针头朝远离中线的方向旋转180度，形成一个半圆形的白质深层六级下切。最后，再次抬起针头，直至其位于穿刺点下方。然后将 undercut 装置向后倾斜并拔出针头。将一片塑料薄膜覆盖在颅窗上以进行保护。随后松开止血钳，如有需要，用无菌生理盐水润湿头皮，并将其复位。用缝线闭合切口。然后将动物从立体定位仪中取出，并置于加热垫上，直至动物从麻醉状态恢复。将动物放回饲养笼后，务必根据相应的机构动物护理与使用委员会（IACUC）协议给予镇痛处理。在此，于手术后两周制备冠状皮层切片，以评估下切手术的成功情况。在显微镜低倍物镜下可辨识跨皮层切口和下切切口。该场电位记录显示了来自部分隔离皮层的诱发性皮层活动。如果操作得当，掌握此技术后，整个过程大约需要30分钟。在尝试该操作时，重要的是要记住在手术前练习使用外科器械。观看本视频后，您应能够充分理解如何在啮齿类动物中建立创伤后癫痫发生的未切开模型。

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准备在鼠害外伤性癫痫的底切模型

本视频展示了在诱发癫痫的大鼠中进行癫痫发作的脑电图（EEG）记录。一只在腹侧海马区植入电极的大鼠连接至脑电图记录系统，并置于一个有机玻璃容器中。在记录脑部活动以监测癫痫发作发生情况的同时，允许大鼠自由活动。...

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来源：Jang, S., et al，大鼠电休克惊厥及其海马组织的分离以检测惊厥诱导的突触后密度蛋白变化。J. Vis. Exp.

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急性癫痫发作模型对于研究癫痫样事件的潜在机制具有重要意义。此外，能够按需诱导癫痫样事件的能力为研究其发生过程中事件的精确序列提供了一种高效的方法。本文中，我们描述了在小鼠和人类组织中建立的急性4-氨基吡啶皮层癫痫发作模型。...

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本系统性实验方案描述了一种新的重复性轻度创伤性脑损伤后创伤后癫痫的动物模型。第一部分详细介绍了使用改良的重物坠落模型诱导创伤性脑损伤的操作步骤。第二部分提供了用于单通道和多通道脑电图数据采集系统的外科手术方法指导。...

诱导重复性弥散性创伤性脑损伤小鼠模型中的创伤后癫痫

本文描述了鼻周皮层-海马体脑片的制备方法。在逐步且受控的血清剥夺条件下，这些脑片会表现出逐渐发展的类似癫痫样活动，可被视为一种癫痫发生的离体模型。该系统是监测自发性活动动态变化的优良工具，也可用于评估癫痫发生过程中神经炎症特征的进展。...

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制备并植入电极以电点燃VGAT-Cre小鼠，建立颞叶癫痫模型

在C57BL/6小鼠中通过脑内感染鼠脑心肌炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus,...

使用Theiler's小鼠脑脊髓炎病毒建立感染性病因癫痫模型

杏仁核在颞叶癫痫的发生和传播中起着关键作用，该癫痫起源于此结构并由此扩散。本文详细描述了兼具记录和刺激功能的深部脑电极的制备方法，并介绍了一种起源于杏仁核的内侧颞叶癫痫模型。...

利用双极电极通过杏仁核电点燃建立颞叶癫痫小鼠模型

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