Name: 流式细胞仪分析小鼠主动脉内流的免疫细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 15 s
Description: 学习使用流式细胞术分析小鼠主动脉及外膜浸润的免疫细胞组成与表型。该方法可分离动脉粥样硬化主动脉和周围外膜组织，制备单细胞悬液并进行荧光标记，为研究血管炎症和动脉粥样硬化的细胞机制提供有力工具。

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本研究工作由美国国立卫生研究院基金（PO1 HL55798，授予 K.L.）和美国心脏协会科学家发展基金（0525532U，授予 E.G.）资助。

1. 小鼠主动脉的分离
使用小鼠进行实验需获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
<ol>
<li>通过将1000单位肝素钠加入50 ml PBS中并倒置混匀，制备含肝素的PBS。为待采集的血液准备一个空收集管，为每根待采集的主动脉准备一个含PBS的收集管。所有管子均置于冰上保存。</li>
<li>准备用于采血的肝素化注射器（0.1 ml浓度为1000 U/ml的肝素钠），并准备好手术器械（两把弯镊、一把解剖剪和一把显微剪）以及解剖用解剖板。</li>
<li>按照美国国立卫生研究院（NIH）及机构IACUC委员会关于啮齿类动物安乐死的政策，使用经批准的二氧化碳安乐死装置对小鼠实施安乐死。在将小鼠转移至解剖板前，确认安乐死效果。</li>
<li>用70%乙醇短暂浸泡小鼠，并将其固定在解剖板上。通过心脏穿刺法从小鼠体内采集血液。</li>
<li>打开腹腔和胸腔。使用装有25号针头的10 ml注射器，经心脏穿刺以含2%肝素的PBS彻底灌注血管系统，完全清除血管内的血液。确保主动脉组织内无残留血液。灌注过程应缓慢进行，压力宜低，以保证血管壁上的所有斑块保持完整。</li>
<li>解剖并移除内脏器官、泌尿生殖器官、膈肌和脾脏，保留肾脏、心脏和主动脉完整。</li>
<li>小心剥离主动脉周围的脂肪组织和主动脉旁淋巴结，保持主动脉及其外膜完整。采集整段主动脉，包括主动脉弓、升主动脉、降主动脉、胸主动脉和腹主动脉部分。将分离出的主动脉放入含PBS的收集管中。在分离过程中，应尽量保持血管湿润。</li>
</ol>
2. 单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>制备1X主动脉解离酶储存液（ADES）（在2.5 ml PBS中加入125 U/ml XI型胶原酶、60 U/ml I-s型透明质酸酶、60 U/ml I型DNase和450 U/ml I型胶原酶，改良自Galkina et al.7）。所有酶均来自Sigma-Aldrich。将储存酶溶液置于冰上。</li>
	<li>移除含有主动脉的收集管中的PBS。向每根主动脉中加入2.5 ml 1X ADES。将主动脉切成小块以促进酶消化，或保持主动脉完整。将主动脉与1X酶溶液在37°C孵育1小时（可选缓慢振荡）。</li>
	<li>孵育1小时后，通过机械剪切将消化后的主动脉分散，并经70 μm细胞筛滤入5 ml聚丙烯FACS管（BD Falcon），制备单细胞悬液。离心收集细胞（400×g，5分钟，4°C）。</li>
	<li>将细胞重悬于1 ml FACS缓冲液（含1% BSA和0.05% NaN3的PBS）中，使用台盼蓝染色、血细胞计数板和光学显微镜测定主动脉细胞悬液中的细胞数量。消化后获得的总细胞数取决于小鼠年龄、饮食或动脉粥样硬化严重程度。</li>	
</ol>
3. 流式细胞术染色
<ol>
<li>标记适量的新FACS管。通常，流式细胞术实验应包括未染色对照管、单色染色管组、适当的荧光减一对照（FMO）8、适当的同型对照以及实验组管。由于可分离的主动脉白细胞数量有限，可使用脾脏白细胞进行单色对照染色。</li>
<li>我们采用标准的流式细胞术方案对主动脉细胞悬液进行染色。简言之，将主动脉细胞悬液中的0.5–1×106个细胞分装至FACS管中。加入1 ml FACS缓冲液，通过离心沉淀细胞。倾倒去除沉淀细胞的上清液。</li>
<li>为实验管、荧光减一对照管和同型对照管配制Fc阻断液和抗体混合液。向所有管中加入100 μl Fc阻断液（FACS缓冲液中含14.2 μg/ml，克隆号2.4G2），轻弹管壁或轻微涡旋以重悬细胞。室温孵育15–20分钟。</li>
<li>配制抗体染色、同型对照染色或FMO对照染色混合液。根据预实验中的滴定结果确定抗体的最佳浓度。在存在Fc阻断的条件下，向样品管中加入抗体混合液（100 μl/0.5–1.0×106个细胞）。4°C避光孵育20–30分钟。</li>
<li>向每管中加入1 ml FACS缓冲液，涡旋混匀后离心沉淀细胞。重复该步骤一次。</li>
<li>倾倒上清液，将沉淀细胞重悬于300 μl 2%多聚甲醛（PFA）中。将样品上机进行流式细胞术检测。
<ul>
<li>注意：通常向所有样品中加入抗CD45抗体（常见的白细胞抗原标记），以便后续设门圈选CD45+白细胞7。此外，应初始使用CD45的FMO和同型对照来设定CD45+白细胞门，因为不同白细胞间的CD45表达水平可能存在差异。</li>
<li>注意：为检测低密度表达的表面抗原或稀有事件抗原，建议使用“高亮度荧光染料”，如R-藻红蛋白（PE）或别藻蓝蛋白（APC）。此外，可通过合并多个匹配的主动脉样本以提高稀有事件的检出率；但若使用超过一百万个细胞，应按比例增加每次检测所用的抗体用量。</li>
<li>注意：为确保分离的主动脉样本及其细胞悬液中血液污染最少，在部分实验中额外进行了TER-1197染色，该抗原由红细胞（RBC）表达。血液中红细胞与白细胞（WBC）的数量比约为10×106个细胞/μl 对 8×103个细胞/μl。根据主动脉样本中TER-119的表达情况，可计算出样本中来源于血液的白细胞百分比。通常我们在主动脉样本中检测到的血液来源WBC比例低于0.02%。（图1）</li>
<li>注意：由于酶处理可能影响表面抗原的表达，应对目标抗原的酶消化耐受性进行评估。简言之，将外周淋巴结（pLN）或脾脏小块组织在37°C下与或不与酶混合液共同孵育1小时。1小时后，通过流式细胞术检测抗原表达水平。酶混合液对多种表面抗原无影响（图2）7。但在其他情况下，酶处理可能导致抗原表达显著下降。此问题可通过选用替代性细胞标记物来规避。</li>
<li>注意：如需，可在第4步后进行活/死细胞活力染色。通常使用Live/Dead可固定死细胞染色试剂盒（Invitrogen, Molecular Probes）。为进行活/死染色，将1 μl重新溶解的活/死染料加入1 ml PBS中配制成1×染色液，涡旋混匀。向活/死单染、混合抗体、FMO及同型对照样品中各加入100–200 μl 1×活/死染料。室温避光孵育10分钟。活/死单染对照管应在56°C避光孵育10分钟，以热激方式杀死细胞。用1 ml PBS洗涤细胞并离心沉淀。随后从第5步继续实验流程。</li>
<li>注意：本方案适用于细胞内抗原和细胞因子的胞内染色。简言之，可使用BD Pharmingen、eBioscience或Caltag实验室的细胞固定/通透试剂进行胞内染色——具体选择取决于目标抗原。为进行固定和通透处理，在完成胞外染色步骤（第3节第5步）后，按照制造商说明书执行固定/通透步骤。完成胞内洗涤步骤后，从第6步（第3节第6步）继续本方案。</li>
</ul>
</li>
</ol>
4. 分离的外膜及血管壁的流式细胞术分析
由于白细胞可迁移至主动脉外膜以及主动脉壁内的动脉粥样硬化斑块，为了通过流式细胞术检测外膜和主动脉中的白细胞，已建立了一种分离并针对这两个解剖部位进行流式细胞术分析的方案9。简言之，在整段主动脉用ADES消化（第2节，步骤2）之前，先对外膜进行部分消化，并将其从血管其余部分剥离。一旦外膜被剥离并单独保存，其余主动脉组织则用ADES进行消化，以从血管壁中释放白细胞。
<ul>
<li>主动脉外膜分离方案</li>
</ul>
<ol>
<li>在制备1X ADES（第2节步骤1）后，为每根主动脉准备2.5 ml的1X主动脉外膜消化酶溶液（AADES）（在2.5 ml PBS中含781.25 U胶原酶II和14.0625 U弹性蛋白酶（Worthington Biochemical Corp.，Lakewood, NJ））。9 将该储备液置于冰上待用。</li>
<li>从含有主动脉的收集管中移除PBS。向每根主动脉中加入2.5 ml的1X AADES。不要将主动脉切成小段。在37°C下，用1X外膜消化酶溶液孵育主动脉10–20分钟。</li>
<li>经过10–20分钟的消化后，将部分消化的主动脉从1X AADES中转移至含有新鲜PBS的培养皿中。使用两对弯头镊子非常小心地将外膜层作为一个整体从主动脉上剥离。
	<ul>
 <li>注意：较长的消化时间有助于更易去除外膜；然而，若外膜消化过度，则容易撕裂。</li>
 </ul>
</li>
<li>当外膜完全去除后，将外膜和主动脉分别转移至不同的FACS管中。向盛有外膜的FACS管中加入1 ml PBS，并将该管置于冰上。向盛有主动脉的FACS管中加入2.5 ml的1X主动脉解离酶溶液，并在37°C下孵育40分钟。
<ul><li>注意：为促进酶消化，此时可将主动脉切成更小的片段。</li></ul>
</li>
<li>经过40分钟的消化后，将主动脉FACS管置于冰上，通过机械剪切主动脉和外膜组织，并使其通过70 μm细胞筛滤器，分别制备主动脉和外膜的单细胞悬液，收集至5 ml聚丙烯FACS管（BD Falcon）中。离心收集细胞（400×g，5分钟，4°C）。返回第2节步骤4，继续后续实验流程。</li>
</ol>
5. 代表性结果
本文展示了一系列图示，用于说明通过流式细胞术染色分析整个主动脉、主动脉血管壁及其周围主动脉外膜的免疫细胞组成。首先，我们展示了一个典型的FACS图，显示了全血和分离的主动脉细胞悬液中TER-119的染色情况（图1）。在主动脉细胞悬液中，TER-119阳性的红细胞占细胞总数的18%，这表明从主动脉细胞悬液中分离出的细胞中仅有0.014%来源于血液。这是一个重要的对照实验，明确证明所分析的主动脉细胞悬液中的大多数白细胞来源于消化后的血管组织，而非循环的外周血。此外，为了验证该方法的可靠性，我们评估了主动脉解离用酶混合液对脾细胞表面抗原的影响（图2）。结果显示，该酶混合液对多种表面抗原的表达无影响，包括CD45、CD19、CD3、TCRαβ、TCRγδ以及其他多个表面抗原7。
通过结合使用CD45染色、活/死细胞活力染料以及适当的同型对照，可在分析过程中检测并亚群门控主要目标细胞群体，并排除细胞碎片。在图3中，对活的主动脉CD45+白细胞进行门控，以确定两只年轻的Apoe-/-小鼠合并主动脉样本中IFNΥ+ T细胞所占的比例。为突出本方法的通用性，我们采用图3所示的门控策略，在图4中展示了两隻饲喂西方饮食12周的Apoe-/-小鼠主动脉中CD68+CD11b+巨噬细胞和IFNγ+TCRαβ+细胞的代表性胞内染色结果。如预期所示，在饲喂西方饮食的Apoe-/-小鼠主动脉中，主动脉内的大多数白细胞为巨噬细胞（40% CD68+CD11b+）或其他髓系细胞（CD11b+CD68low 和 CD11b+CD68-）。此外，Th1细胞构成了主动脉浸润性TCRαβ T细胞的主要部分（图4）。由于主动脉白细胞及其亚群的整体比例会因小鼠年龄和动脉粥样硬化严重程度而异，因此针对主要目标细胞群体的最佳门控策略应通过实验确定。
为了证明从主动脉外膜分离细胞并进行流式细胞术染色的可行性，我们展示了主动脉和外膜细胞悬液中白细胞标志物CD45+的代表性染色结果（图5）。简言之，将三只老龄Apoe-/-小鼠的主动脉按前述方法（第2和第4节）进行消化并合并处理。在外膜（占细胞悬液的18%）和剩余主动脉组织（占细胞悬液的11%）中均检测到浸润的CD45+白细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="流式细胞术等高线图比较主动脉和血液样本中 TER-119 与 IgG2a 染色情况。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1.消化后主动脉细胞悬液中的 TER-119 染色。 通过心脏穿刺以含 2% 肝素的 PBS 灌注主动脉，随后在 37°C 下使用酶混合液消化 1 小时。将主动脉细胞悬液和血液样本（作为阳性对照）用抗 TER-119-PE 抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。TER-119 阳性的红细胞占主动脉细胞悬液中所有细胞的 18%，表明从主动脉分离的所有白细胞中仅有约 0.014% 可能为血液来源的白细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="分析CD45和CD19表达及细胞群鉴定的流式细胞术散点图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2.酶混合液处理对淋巴细胞上CD45（上图）或CD19（下图）的表达无影响。 分别从未经处理（A、B）和经酶混合液处理（C、D）的淋巴结（LN）中获得细胞悬液，并使用APC-Cy7标记的抗CD45抗体和APC标记的抗CD19单克隆抗体进行染色。（A，C）数字表示R1门中CD45+白细胞所占的百分比。（B，D）数字表示CD45+/CD19+淋巴细胞所占的百分比。图谱均基于CD45+白细胞设门。
<img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="流式细胞术分选策略示意图，SSC 对 FSC，CD45，TCRαβ，IFNγ 分析，细胞分选。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 主动脉白细胞分析的分选策略。 从易发生动脉粥样硬化的 Apoe-/- 小鼠中分离并合并两根主动脉，并按上述方法制备主动脉单细胞悬液。细胞悬液使用 CD45（PerCP）、TCRαβ（FITC）、IFNγ（eFluor 450）和活/死细胞染料 Aqua 进行染色，并采用经升级的 Cytek DXP 8 色 BD FACS Calibur 流式细胞仪进行分析。简言之，首先圈选 CD45+ 白细胞（B），并进一步分析（C–F）。根据活/死细胞染料 Aqua 的染色结果（D）和 FSC 图谱（E）排除死细胞。随后分析活细胞中主动脉白细胞的 TCRαβ 和 IFNγ 表达情况（F）。
<img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="免疫标志物 CD68、CD11b、IgG2b、IFNγ、TCRαβ、IgG1 分布的流式细胞术点图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 细胞内抗原和细胞因子的胞内染色。
根据前述方法，从完整的 Apoe-/- 小鼠主动脉和脾脏制备单细胞悬液。主动脉（A）和脾脏（B，C）细胞悬液使用 BD Cytofix/Cytoperm™ 试剂盒（BD Biosciences）进行 CD45、CD11b 和 CD68 染色，或同型对照染色。细胞设门基于前向散射和侧向散射排除碎片，并选择 CD45+ 白细胞。对于胞内 IFNγ 染色，主动脉和脾脏细胞悬液在 RPMI 1640 培养基中培养 5 小时，培养基中添加 Golgi Stop、PMA 和 Ionomycin C，具体如前所述。9 刺激后的主动脉单细胞悬液（D）和脾脏单细胞悬液（E，F）随后使用 CD45（PerCP）、TCRαβ（FITC）、CD3（APC-Cy7）、Live Dead Aqua 和 IFNγ（eFluor 450；E）或同型对照（IgG1-eF450，F）进行染色。T 细胞（D–F）从活的 CD45+CD3+ 白细胞（CD45+Live/Dead Aqua-）中设门，并分析 TCRαβ 和 IFNγ 表达情况。
<img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="流式细胞术分析；外膜和主动脉中CD45表达的等高线图；SSC 对 CD45。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 分离的小鼠主动脉外膜及主动脉管壁的代表性图像。 代表性流式细胞术等高线图显示，在老年Apoe-/-小鼠的外膜和主动脉壁中存在CD45+ T细胞。SSC—侧向散射。为消除碎片和坏死组织的自发荧光，设门时选择FSC&gt;750。为避免双联体产生的额外自发荧光，设门范围同时设定为FSC&lt;3500，SSC&lt;3500。图中百分比表示门内CD45+细胞的比例。

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li>
<li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+in+atherosclerosis%3A+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li>
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<li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+%22mock%22+FL3+channel+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li>
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<li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究小鼠主动脉中的免疫细胞组成。该方法的主要优势在于能够在单细胞水平上分析主动脉免疫细胞，并表征主动脉白细胞的活化状态。此方法不仅限于小鼠主动脉，我们（未发表数据）及其他研究者10已采用该方法分析人类样本，如内乳动脉、主动脉瓣和冠状动脉。该方法的一个局限性是从小鼠单根主动脉中回收的白细胞数量相对较少。尽管从单根动脉粥样硬化主动脉中获得的白细胞数量足以进行流式细胞术实验，但在单个主动脉细胞悬液中，丰度较低的细胞可能难以检测。如有必要，可通过合并2-4根主动脉的样本进行流式细胞术染色，以克服这一问题。此外，由于酶处理可能影响表面抗原的表达，因此应对所有目标抗原的耐酶处理能力进行测定。我们此前已验证了多个不受酶消化影响的抗原标记物7。然而，在用于流式细胞术实验前，未验证的抗体克隆应由研究者自行验证其适用性7。
竞争性过继转移归巢实验是一种用于分析白细胞向炎症部位募集的动力学和机制的强有力方法。我们成功应用了对受体小鼠主动脉进行流式细胞术分析的方法，以研究白细胞向主动脉迁移的机制。<s...

<table><tbody><tr><td>胶原酶 XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，II 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>弹性蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002292</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠主动脉内免疫细胞的流式细胞术分析

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

动脉粥样硬化是一种累及中等和大血管的慢性炎症过程，其特征是形成斑块，斑块由泡沫细胞、免疫细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞、血小板、细胞外基质以及富含脂质的核心组成，并伴有周围组织的广泛坏死和纤维化1。固有免疫和适应性免疫在动脉粥样硬化的起始、发展和持续过程中均发挥重要作用2,3。大量证据表明，在健康小鼠和易发动脉粥样硬化小鼠的主动脉中均存在不同亚群的免疫细胞，例如巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞4。此外，在主动脉外膜周围也发现有免疫细胞存在，提示该组织在动脉粥样形成过程中具有重要作用2。
长期以来，针对不同类型免疫细胞的定量检测、其活化状态以及主动脉壁内的细胞组成的研究，在动脉粥样硬化领域主要受限于RT-PCR和免疫组织化学方法。尽管已有少数研究尝试在人主动脉样本中进行流式细胞术分析，但存在诸多问题，例如较高的自发荧光现象，已有文献对此进行了报道5,6。既往研究中，采用胶原酶1消化人动脉粥样硬化斑块，收集游离细胞后通过CD14+/CD11c+染色以识别巨噬细胞来源的泡沫细胞。在该研究中，使用了一个“虚拟”通道以避免假阳性染色6。然而，在消化过程中积累的坏死物质会产生大量碎片，导致主动脉样本中出现强烈的自发荧光。为解决这一问题，曾提出采用一系列阳性和阴性对照，但在这些样本中仅能实现双重染色。我们已开发出一种基于流式细胞术的新方法7，可用于分析健康及易发动脉粥样硬化主动脉中免疫细胞的组成，并表征免疫细胞的活化、增殖与分化状态。该方法使得对主动脉壁免疫细胞组成的深入研究成为可能，并为应用广泛的免疫学技术探讨该疾病的免疫学特征开辟了新途径。

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究主动脉的免疫细胞组成。同时，本文还展示了一种额外的技术，可分别检测周围外膜和血管壁。该方法为开展主动脉白细胞的表型分析以及在动脉粥样硬化研究中应用多种免疫学检测手段提供了可能。

动脉粥样硬化是一种累及中等和大血管的慢性炎症过程，其特征是形成由泡沫细胞等成分构成的斑块……

以下实验的总体目标是通过流式细胞术表征主动脉及外膜浸润性白细胞的组成和表型。首先分离出动脉粥样硬化的主动脉，作为第二步。随后将周围的外膜从主动脉分离，并分别从这两种组织制备单细胞悬液。接下来，通过荧光标记的单细胞悬液，可区分来自主动脉外膜组织和主动脉壁的白细胞特定亚群，获得的结果展示了动脉粥样硬化发生过程中浸润主动脉的白细胞多样性，并证实了基于单细胞悬液的流式细胞术分析来分离主动脉外膜组织白细胞的可行性。与免疫组织化学等现有方法相比，该技术的主要优势在于可利用单一主动脉样本，通过多种标记物对白细胞进行检测和表型分析。该方法有助于回答有关动脉粥样硬化及其他血管炎症性疾病发病机制中炎症细胞介质的关键科学问题。鉴定主动脉中的白细胞以及对已知和新型炎症介质进行表型表征，将有助于阐明动脉粥样硬化的发生机制。准备一个用于采集血液的空收集管，以及一个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的收集管，并置于冰上。每采集一条主动脉时，先用70%乙醇短暂浸泡已处死的小鼠，然后使用实验室胶带将小鼠固定在解剖台上。然后使用肝素化注射器通过心脏穿刺从小鼠采血。用解剖剪刀打开腹腔和胸腔，使用带有25号针头的10毫升注射器，以含2%肝素的磷酸盐缓冲液（PBS）完全灌注血管系统。接着，解剖并移除内脏器官、生殖泌尿器官、膈肌和脾脏，保留肾脏、心脏和主动脉完整。确保主动脉组织中无血液残留。仔细分离主动脉周围的脂肪组织和主动脉旁淋巴结，保留主动脉及其外膜完整。随后采集整段主动脉，包括主动脉弓、降主动脉、胸主动脉和腹主动脉部分。将分离的主动脉放入含有 PBS 的收集管中。移除含有主动脉的收集管中的 PBS。向主动脉中加入 2.5 毫升一倍浓度的主动脉外膜消化酶溶液。然后将主动脉与酶溶液在37摄氏度下孵育10至20分钟。孵育期间向培养皿中加入PBS。孵育结束后，将部分消化的主动脉从酶溶液中极为小心地转移至含有 PBS 的培养皿中。使用两把弯头镊子，将主动脉外膜组织层作为一个整体从主动脉上剥离下来。当外膜被完全去除后，将外膜和主动脉分别转移至不同的离心管中。然后向主动脉和外膜中各加入2.5毫升1倍浓度的主动脉解离酶溶液。可将主动脉剪成更小的片段。为了促进酶消化，将主动脉和外膜在37摄氏度下再孵育30分钟。孵育结束后，将主动脉和外膜组织管置于冰上。使用70微米细胞筛和注射器推杆剪切残留组织，从主动脉和外膜制备单细胞悬液。将细胞悬液转移至5 mL聚丙烯Fax管中。在4°C下以400 × g离心5分钟，使细胞沉淀。用1 mL Fax缓冲液重悬细胞沉淀，并使用台盼蓝和血细胞计数仪进行细胞计数。由于酶处理可能影响表面抗原的表达，将脾脏小块在37摄氏度下分别与或不与酶混合液孵育一小时。之后通过流式细胞术确认酶处理对实验性表面抗原表达无影响。标记适量新的实验组和对照组离心管。在另一组已标记的离心管中加入针对目标细胞外抗原的实验组和对照组抗体混合液。将抗体混合液管置于冰上，并遮盖以避免荧光染料暴露于光照。接下来，将五到八乘以十的五次方个主动脉和外膜细胞分装至相应预标记的流式管中。每管加入一毫升流式缓冲液，通过离心沉淀细胞。倾去沉淀细胞的上清液，以区分活细胞与死细胞。可首先使用活细胞/死细胞可固定染色试剂盒，通过将一微升重溶解的活死染料加入一毫升 PBS 中配制一倍浓度的活死染色液，并涡旋混匀。接着，向实验组和对照组样本管中各加入 100 至 200 微升一倍浓度的活死染料。然后将样本在室温下避光孵育 10 分钟。将活/死染色的单个对照管在56摄氏度避光孵育10分钟，通过热激杀死细胞。孵育结束后，用1毫升PBS洗涤所有细胞，并通过离心收集细胞。接着，向每管中加入1毫升fax缓冲液洗涤细胞。涡旋混匀各管，然后通过离心沉淀细胞。倾倒去除细胞上清液。加入100 µL的FC阻断液。将Fax缓冲液加入所有试管中，轻轻涡旋混匀以重悬细胞。将样品在室温避光条件下孵育10至15分钟。接着，按前述方法洗涤细胞。倾倒去除细胞中的 SUP natum。向各对应试管中加入 100 微升适当的抗体混合液。轻轻涡旋振荡以重悬。重悬沉淀，并在避光条件下于室温孵育所有试管20至30分钟，此步骤在20至30分钟的胞外染色之后进行。按前述方法将细胞洗涤两次，倾去上清液，再将沉淀的细胞重悬于300 µL的2%多聚甲醛中，随后在流式细胞仪上进行染色分析。TER one 19结果表明，消化后的血管组织而非循环外周血，是主动脉细胞悬液中所分析的大多数白细胞的来源。TER-1-19 阳性的红细胞占该代表性主动脉细胞悬液中细胞的 18%。这表明，从主动脉细胞悬液中分离得到的细胞中，来源于血液的细胞少于 0.02%。同时评估了主动脉解离酶混合物对细胞表面抗原的影响。如图所示，该酶混合物对 CD45 或 CD19 的表达无影响，同样也对 CD3、TCR αβ、TCR γδ 以及其他未在本图中展示的多种表面抗原无影响。在接下来的几幅图中，对活体主动脉中CD45阳性白细胞进行设门，以确定两只年轻的载脂蛋白E缺陷型小鼠主动脉池中干扰素γ阳性T细胞所占的比例。此处展示了代表性APOE小鼠主动脉的前向散射和侧向散射图谱，仅针对白细胞进行分析，使用共同白细胞抗原CD45对主动脉白细胞进行设门，如图所示。在本图所示的主动脉白细胞前向散射与侧向散射图谱中，沿侧向散射轴出现的小颗粒群体提示存在坏死细胞；为排除这些细胞，使用活/死染料Aqua对存活的白细胞进行设门，该群细胞约占本图所示代表性群体的30%。在 CD45 阳性、活/死染料阴性、前向与侧向散射图谱中出现的小型无颗粒细胞提示，在 CD45 阳性、活/死染料阴性门控中仍存在细胞碎片。因此绘制了一个多边形的前向-侧向散射门控，仅纳入较大活细胞进行分析，如图所示。对 CD45 阳性、活/死染料阴性、前向-侧向散射群体进行 TCR αβ 和干扰素 γ 检测，结果显示，使用与前述系列图相似的设门策略，6% 的活主动脉白细胞为 TCR αβ 阳性、干扰素 γ 阳性的 Th1 辅助性 T 细胞。如本图所示，预期可在下图中观察到两例经西方饮食喂养 12 周的 ApoE 基因敲除小鼠中 CD68 阳性、CD11b 阳性巨噬细胞以及干扰素 γ 阳性、TCR αβ 阳性细胞的代表性胞内染色数据。饲喂西方饮食的APOE基因敲除小鼠的主动脉。主动脉内大部分白细胞为巨噬细胞，其中40%呈CD68和CD11B双阳性。在同样饲喂西方饮食的APOE基因敲除小鼠脾脏中，其他CD11B阳性的髓系细胞占主动脉白细胞群体的15%。有7%的可存活SP细胞为CD11b阳性CD68阳性巨噬细胞，另有10%为其他CD11b阳性髓系细胞。相比之下，在本图所示的一个具有代表性的、经相同染色的同型对照样本中，仅有0.01%的可存活APOE基因敲除细胞对同型抗体呈假阳性。此外，在喂食西方饮食的APOE基因敲除小鼠中，12周内，TCRαβ阳性而干扰素γ阴性的辅助性T细胞以及产生干扰素γ的Th1细胞，构成了主动脉浸润性和脾脏定居性T细胞群体的主要部分。如本图所示，通过检查aov发现，使用同型对照染色的细胞中仅有0.5%的TCR alpha beta阳性且干扰素γ阳性的细胞被错误地判定为干扰素γ阳性。为证明从主动脉外膜分离细胞并进行流式细胞术染色的可行性，此处展示了主动脉和外膜组织细胞悬液中CD45阳性白细胞染色的代表性结果。浸润的CD45阳性白细胞约占外膜细胞悬液的18%，占主动脉细胞悬液的11%。在进行该操作时，需注意除非另有说明，应始终将试剂和细胞置于冰上并避光保存。观看本视频后，您应能够充分理解如何从主动脉及主动脉外膜中分离并制备可用于流式细胞术实验的单细胞悬液。

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