小鼠卵母细胞显微注射、成熟及倍性评估

本实验的总体目标是评估经过实验干预后，处于第二次减数分裂中期的卵母细胞的极体排放情况。首先，从性成熟雌性小鼠体内获取完全发育的卵母细胞。随后，将所选材料显微注射至卵母细胞中，以干扰目标蛋白，接着将卵母细胞体外培养至减数分裂第二次分裂的中期。接下来，通过使用mantro处理，诱导卵母细胞发生染色体铺展，从而形成单极纺锤体。

最终，这些结果可以通过免疫荧光和共聚焦显微镜描绘卵子的多倍体状态。该方法有助于回答生殖生物学和染色体分离领域中的关键问题，例如理解导致卵子异常的分子机制。该方法的可视化演示至关重要，因为显微注射技术难以掌握，其多个操作步骤仅通过文字难以准确传达。对性成熟雌性小鼠腹腔注射 5 IU 的孕马血清促性腺激素，以最大化每只小鼠所分离的窦状卵泡数量。

在PMSG预处理后约48小时，将每只小鼠3毫升收集培养基于37摄氏度预热并平衡。将1毫升培养基放置至少1小时。在培养皿中分别制备微滴，并用矿物油覆盖。

现在将培养基培养皿放入培养箱，将收集液培养皿置于载片加热器上。处死小鼠，解剖取出卵巢并放入含有预热收集液的表面皿中。

使用1毫升胰岛素注射器，用固定在一起的27号针头多次穿刺，将卵巢固定在培养皿上并释放窦状卵泡。在解剖显微镜下，用口控玻璃移液器收集卵丘细胞复合体。仅收集大的窦状卵泡，而不收集较小的前窦状卵泡或裸卵母细胞。

用略大于卵母细胞直径的小移液管，将复合体转移至预先准备好的收集液微滴中。将卵丘细胞从复合体上分离。用较大的移液管将去卵丘的卵母细胞转移至培养液微滴中。

在操作前，将卵母细胞置于培养箱中至少恢复一小时。通过机械拉针仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管来制备注射针。从单孔腔载玻片上取下培养基腔室。

为构建显微注射平台，将5 µL收集培养基液滴尽可能靠近0.5 µL SIR N-A-C-R-N-A或用于寡核苷酸注射的morpholino液滴，并用矿物油覆盖后置于显微镜载物台上。将注射针和持卵针插入相应的针夹中，并移至收集培养基液滴内。打开连接至皮升注射仪和防震台的氮气罐。

在向注射移液管中加入培养基的同时，轻轻将其尖端与持卵移液管轻触以打开尖端。从培养箱中取出5到10个卵母细胞，转移至平台上的收集培养基液滴中。现在，在按压“清除”键的同时，设置皮升注射仪的注射参数为5至10皮升的注射体积。

将注射针移至材料液滴处吸取，然后返回培养基液滴中。使用持卵移液管捕获一枚卵母细胞，并沿x轴方向将注射针、卵母细胞与持卵移液管对齐。

在更高倍镜下，将注射移液管推进穿过卵母细胞，注意避免触碰细胞核。一旦刺穿质膜，在注射后按“注射”键，然后撤出针头，释放卵母细胞并重复操作。待所有卵母细胞注射完成后，将其放回培养箱中，在培养液中孵育所需时间，通常为12至24小时。

然后将细胞通过数滴CZB洗涤，并转移至覆盖于油层下的微滴CZB中，孵育16小时，以完成减数第二次分裂中期的成熟过程。取750微升含有100微摩尔Mastri的CZB加入组织培养皿的孔中，该培养皿的外圈需加有水。接着将卵母细胞通过数滴含Mastri的CZB洗涤，然后转移至组织培养皿中，孵育1小时。

将卵置于含有2%多聚甲醛PBS溶液的表面皿中，在室温下固定20分钟。接着，将卵转移至封闭液中，于4°C保存，直至对卵进行通透处理。在室温下通透15分钟，然后用大量封闭液反复漂洗。

在避光且保持湿润的96孔板盖中进行后续操作。室温下，将卵转移至25 µL封闭液液滴中，孵育15分钟。随后，为标记着丝粒，将卵转移至含有Crest抗血清（1:40稀释）的封闭液液滴中，孵育至少1小时。

然后用三滴封闭液洗涤，每次孵育15分钟。将卵转移至含有荧光四标记抗体的封闭液滴中，孵育1小时。用封闭液洗涤两次，以检测染色体。

将样品置于细胞毒素绿色染料与封闭液按1:5,000比例稀释的溶液中孵育，随后将样品用5微升Vector Shield封片剂封片。在盖玻片四个角预期位置各放置一小滴凡士林，以防止压碎卵细胞。盖上盖玻片后，用指甲油密封，并将载玻片置于4摄氏度的玻片盒中保存，直至进行共聚焦显微镜观察。使用100倍物镜成像时，在Z轴方向以0.4微米的步长进行采集，利用如美国国立卫生研究院（NIH）提供的Image J等成像软件，对中期II卵细胞的着丝粒完整区域进行成像。正常二倍体小鼠卵细胞含有20对动粒，因此在此Z轴投影图中可见共40个信号点。DNA显示为绿色，K-动粒蛋白显示为红色。

箭头指向两条不同的染色体臂，表明在动粒编号 17 和编号 18 处存在重叠，这是在显微注射操作之后的观察结果。还可以采用其他方法，如蛋白质印迹、实时 PCR、纺锤体构型分析、染色体排列评估以及体外受精，以回答更多科学问题，例如：目标蛋白的扰动如何影响减数分裂成熟过程及发育潜能。观看本视频后，您应能充分掌握如何操控所有位点，并评估减数分裂中期 II 卵母细胞的 PLO。