Name: 盲肠结扎穿刺过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学习盲肠结扎穿刺法建立小鼠脓毒症模型，使用C57BL/6小鼠模拟人类多菌性脓毒症。该方法通过释放盲肠内容物引发免疫反应和器官损伤，为研究脓毒症机制及治疗方案提供重要实验基础。

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本研究得到了宾夕法尼亚州卫生部资助项目的支持。 
Miguel Garcia Toscano 博士在本研究期间由 Alfonso Martin Escudero 基金会资助，在天普大学担任博士后研究员。 
我们感谢 Iliya Yordanov 和 Kevin Kotredes 为制作本视频所做出的贡献。

1. 盲肠结扎穿刺作为人类脓毒症的小鼠模型
本实验采用 C57BL/6 小鼠（7-9 周龄）。
<ol>
 <li>通过腹腔注射1:1混合的氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（15 mg/kg）溶液对小鼠进行麻醉。作为参考，对一只体重为20克的小鼠注射30 μl的1:1混合溶液。或者，可使用麻醉蒸发器通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
 <li>剃除小鼠腹部毛发，并先用聚维酮碘溶液消毒，再用70%酒精棉片擦拭（见下图序列中的编号1）。氯己定可作为替代的抗菌剂。可选：可使用无菌手术巾以保持术区清洁。</li>
 <li>在无菌条件下，行1至2厘米长的腹正中切口，暴露盲肠及其相邻肠段（图2和图3）。</li>
 <li>在回盲瓣下方的盲肠根部，使用6.0丝线（6-0 PROLENE, 8680G; Ethicon）进行牢固结扎，并在同一侧盲肠壁上用19号针头穿刺一次或两次（图4和图5）。请注意，结扎盲肠的长度（定义为从盲肠远端至结扎点的距离）将决定脓毒症的严重程度。结扎长度＞1 cm可导致重度脓毒症，而≤1 cm则产生中至轻度脓毒症。另需注意，本实验所采用的盲肠穿孔方法不同于标准的贯穿穿刺技术（即针头完全穿透盲肠壁）。两种方法均可稳定诱导相同的脓毒症表型。然而，贯穿穿刺技术的一个缺点是当挤压盲肠时，无法控制排出粪便的量。</li>
 <li>随后轻轻挤压盲肠，使少量粪便从穿孔处溢出（图6）。将盲肠放回腹腔，用6.0丝线缝合腹膜（图7）。</li>
 <li>使用Reflex 7 mm夹（RS-9258, Roboz Surgical Instruments）或Michel伤口夹（7 mm, RS-9270）关闭皮肤（图8）。</li>
 <li>通过皮下注射预热的0.9%生理盐水溶液1 ml（使用25G针头）对小鼠进行复苏。该液体复苏措施将诱导脓毒症的高动力相。此关键步骤在讨论部分有进一步说明。</li>
 <li>可选：皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg体重）或曲马多（20 mg/kg体重）以提供术后镇痛。需注意，这些阿片类药物可能抑制呼吸和运动功能，这些效应可能被误判为脓毒症体征。</li>
 <li>将动物暂时置于加热垫上，或立即放回笼中，并暴露于150 W红外加热灯下，直至其从麻醉中恢复。恢复时间通常为30分钟至1小时。</li>
 <li>在笼底提供自由取用的食物和水（水凝胶）。</li>
 <li>每12小时监测一次动物存活情况，持续一至两周；或在不同时间点处死动物，用于分析不同参数。</li>
</ol>
作为实验设计的对照，假手术动物将接受剖腹手术，但不进行结扎和穿刺。 
 手术后6至12小时，小鼠将出现精神萎靡、发热、竖毛、腹泻、蜷缩和全身不适等症状，这些均为脓毒症的表现。病情极为严重的小鼠在死亡前几乎无法移动，并表现出体温显著下降。在此阶段，应实施安乐死以避免小鼠遭受 prolonged 疼痛与痛苦。
<img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig0.jpg" alt="小鼠伤口愈合过程，手术操作步骤，生物医学研究实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 0">
2. 最常分析的参数
为了评估手术结果，可在器官、细胞提取物或体液中分析不同的参数。样本可在手术后3小时至一周内的不同时间点采集。
<ol>
 <li>小鼠存活率。</li>
 <li>血清、腹腔及器官提取物中的细胞因子和趋化因子。
 <ol>
 <li>白细胞介素-6：由单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、粒细胞、肥大细胞及其他多种细胞类型产生并释放。在急性期反应和炎症过程中发挥重要作用。</li>
 <li>肿瘤坏死因子-α：一种多效性细胞因子，在炎症和细胞凋亡中起核心作用。由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和成纤维细胞产生。</li>
 <li>白细胞介素-1β：由单核细胞、NK细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞产生。可诱导发热及急性期蛋白的合成。</li>
 <li>白细胞介素-10：促进吞噬细胞的摄取作用和Th2型免疫应答，但抑制抗原呈递及Th1型促炎性免疫应答。</li>
 <li>白细胞介素-10：促进吞噬细胞的摄取作用和Th2型免疫应答，但抑制抗原呈递及Th1型促炎性免疫应答。</li>
 <li>单核细胞趋化蛋白-1（又称CCL2）：将单核细胞、记忆T细胞和树突状细胞募集至组织损伤和感染部位。</li>
 <li>KC（CXCL1）：由巨噬细胞和内皮细胞产生。小鼠KC是一种强效的中性粒细胞趋化因子和激活剂。</li>
 <li>RANTES：一种单核细胞趋化因子。可趋化未受刺激的CD4+/CD45RO+记忆T细胞，以及具有初始和记忆表型的受刺激CD4+和CD8+ T细胞。</li>
 <li>干扰素-γ：由Th1细胞、细胞毒性T细胞、树突状细胞和自然杀伤（NK）细胞分泌。可增强巨噬细胞的抗原呈递能力和杀伤活性，抑制Th2细胞活性，促进白细胞迁移所需的黏附和结合，并增强NK细胞的活性。</li>
 <li>高迁移率族蛋白B-1：在单核细胞中，通过与晚期糖基化终产物受体（RAGE）结合，激活核因子κB，从而在脓毒症晚期促进促炎介质的释放。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>器官中髓过氧化物酶（MPO）的测定，用于评估中性粒细胞浸润程度。髓过氧化物酶是一种过氧化物酶，主要存在于中性粒细胞中。它是一种溶酶体蛋白，储存于中性粒细胞的嗜天青颗粒内。MPO含有血红素色素，使其在富含中性粒细胞的分泌物（如脓液和某些类型的黏液）中呈现绿色。</li>
 <li>器官和血液中的细菌负荷量，以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）的数量来衡量。</li>
</ol>
3. 代表性结果
CLP 手术最初在 C57BL/6 小鼠品系中进行。我们测试了多个参数，通过改变结扎长度和针头粗细来调节脓毒症的严重程度，如图1和图2所示。在这两个因素中，结扎长度对改变存活率的影响似乎比针头粗细更为显著。如图1所示，当结扎长度超过 1 cm 时，与结扎长度 ≤1 cm 的小鼠相比，死亡率升高至 100%。增加针头粗细也会降低存活率，使用 22G 针头时存活率为 100%，而使用 19G 针头进行两次穿刺后存活率降至 55%。我们还比较了 CLP 对 C57BL/6 和 129SvJ 小鼠的影响，以确定不同小鼠品系对 CLP 诱导的脓毒症是否具有相似或不同的易感性。图3 显示，在相同条件下，129SvJ 小鼠比 C57BL/6 小鼠更易感染，表现为更高的死亡率。
<img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig1.jpg" alt="结扎长度生存曲线图，C57BL/6小鼠，比较穿刺尺寸19G，年龄7-8周。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 盲肠结扎长度对动物生存率的影响。 在C57BL/6小鼠中采用两种不同长度的盲肠结扎进行盲肠穿刺结扎（CLP）模型操作。该单一参数显著影响动物生存率，结扎区域超过1 cm的组别中所有动物在3天内全部死亡，而结扎区域约为1 cm的组别动物存活情况较好（n=8）。
<img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig2.jpg" alt="小鼠生存分析图；针头粗细影响，19G 与 22G，持续 10 天，两次穿刺。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
 图 2. 针头粗细对生存率的影响。 在 C57BL/6 小鼠中使用两种不同规格的针头（19G 和 22G）进行 CLP 手术。使用 19G 针头穿刺盲肠的小鼠生存率为 55–60%。相比之下，使用 22G 针头穿刺盲肠的小鼠生存率为 100%，尽管它们在最初 3–4 天内表现出典型的炎症症状，但这些症状在 4 天后消失（n=8）。
<img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig3.jpg" alt="小鼠品系存活率比较图；Kaplan-Meier 曲线；C57BL/6 与 129SvJ 在 10 天内的比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
 图 3. 两种不同小鼠品系对脓毒症易感性的比较。在相同条件下，对 129SvJ 和 C57BL/6 小鼠进行盲肠结扎穿刺（CLP）模型实验。在评估期结束时，129SvJ 品系的存活率比 C57BL/6 品系低 25%，表明其对多微生物感染引发的炎症具有更高的易感性。（n=6）

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</ol>

动物实验遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经天普大学动物护理与使用委员会批准。

本文详细展示了如何在小鼠中实施CLP模型并调节其严重程度。
与其他脓毒症动物模型相比，盲肠结扎穿刺术（CLP）可在不同年龄和性别的任何小鼠品系中进行。该手术操作相对简单且成本较低。在此模型中，病情严重程度直接影响存活率。结扎长度、针头粗细以及穿刺次数是可调控的参数，可用于调节CLP模型的严重程度或死亡率。因此，若需显著改变CLP的严重程度，操作者可调整结扎长度；而若需轻微调整严重程度，则可通过改变针头粗细来实现。
可能对盲肠结扎穿刺（CLP）实验结果引入显著变异性的其他重要参数包括小鼠品系6,7、性别8以及动物的年龄9。在这方面，我们发现，在相同实验条件下，不同品系的小鼠对该操作表现出不同的易感性。事实上，已在不同小鼠品系之间检测到血浆细胞因子水平和组织损伤程度的差异10-12。液体复苏和镇痛药物的使用也是可能在CLP模型中引入显著变异性的因素。例如，液体复苏可能通过减少早期促炎性细胞因子的产生而提高存活率11, 13, 14</...

<table><tbody><tr><td>氯胺酮</td><td>Ketaset</td><td>0856-2013-01</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>AnaSed</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器 29G</td><td>Excel Scientific</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线，6-0 PROLENE</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8680G</td><td></td></tr><tr><td>19G 和 25G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305186</td><td></td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>General Supply</td><td>General supply</td><td></td></tr><tr><td>红外加热灯</td><td>General Supply</td><td>General supply</td><td></td></tr><tr><td>Michel 伤口夹 7mm</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-9270</td><td></td></tr><tr><td>耳挂式口罩</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-4181</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>VWR international</td><td>63410-992</td><td></td></tr><tr><td>外科镊子</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇消毒垫</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-350</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Bedford Laboratories</td><td>55390-100-10</td><td></td></tr><tr><td>曲马多</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42965</td><td></td></tr></tbody></table>

盲肠结扎穿刺术

Cecal Ligation Puncture Procedure

人类脓毒症的特征是宿主无法将严重而广泛的感染局限在局部，从而引发一系列全身性反应。目前，脓毒症在美国重症监护病房的死亡原因中位列前十1。在脓毒症过程中，存在两个明确但可能重叠的血流动力学阶段。初始阶段（高动力期）表现为巨噬细胞和中性粒细胞大量产生促炎性细胞因子和活性氧物质，影响血管通透性（导致低血压）、心脏功能，并引发代谢改变，最终导致组织坏死和器官衰竭。因此，最常见的死亡原因是急性肾损伤。第二阶段（低动力期）是一种抗炎过程，涉及单核细胞抗原呈递功能改变、淋巴细胞增殖和功能下降以及细胞凋亡增加。这种被称为免疫抑制或免疫功能低下的状态，显著增加了院内感染的风险，并最终导致死亡。这些病理生理过程的机制尚未被充分阐明。由于脓毒症的两个阶段均可能造成不可逆且无法修复的损伤，因此确定患者的免疫学和生理状态至关重要。这也是许多治疗药物失败的主要原因。同一药物在脓毒症的不同阶段使用，可能具有治疗作用，也可能有害或无效2,3。为了从多个层面理解脓毒症，必须建立一种合适且全面的动物模型，以重现该疾病的临床病程。明确脓毒症期间发生的病理生理机制，并对模型条件进行严格控制以用于潜在治疗药物的测试，具有重要意义。
为了研究人类脓毒症的病因，研究人员已开发出多种动物模型。其中应用最广泛的临床模型是盲肠结扎穿刺术（CLP）。CLP模型通过穿刺盲肠，使其内容物释放到腹腔内，从而引发由多微生物感染所导致的强烈免疫反应。该模型能够很好地模拟临床上具有相关性的人类疾病状态。与人类患者类似，接受CLP处理并进行液体复苏的小鼠会表现出第一阶段（早期）的高动力状态，随后逐渐进展为第二阶段（晚期）的低动力状态。此外，其细胞因子谱也与人类脓毒症相似，均表现为淋巴细胞凋亡增加（详见文献4,5）。由于脓毒症涉及多种且相互重叠的发病机制，研究人员需要一个病情严重程度可控的合适脓毒症模型，以获得一致且可重复的实验结果。

盲肠结扎穿刺小鼠模型作为研究人类脓毒症的重要工具。

人类脓毒症的特征是一系列针对严重且大规模感染的全身性反应，这些感染未能被局部控制……

大家好，我是来自天普大学微生物学与血液学系Dena博士实验室的Miguel Toscano。今天我们将向您展示如何在C57黑鼠品系小鼠中建立iCal感染及穿刺模型。我们实验室使用该模型来模拟人类脓毒症。该模型的基本原理是穿刺盲肠，使粪便物质释放到腹腔内，从而引发多微生物性脓毒症，导致免疫反应过度激活。在此模型中，多个器官和不同类型的细胞会遭受不可逆损伤，最终可能导致动物死亡。那么让我们开始吧。对小鼠进行麻醉。第一步是通过腹腔注射对动物进行麻醉。酮咪静与赛拉嗪按1:1比例混合。为避免被小鼠咬伤以及防止伤害小鼠，我们必须用一只手抓住小鼠的尾巴，另一只手将其背部按压在地面上。然后，抓住小鼠头部后方，将小鼠翻转至仰卧位，以暴露腹部。使用29号胰岛素注射器，向腹腔内注射20至30 µL麻醉剂。准备小鼠进行操作时，抓住小鼠背部，并通过按压小鼠尾部和/或腿部固定，剃除其腹部毛发。我们检查小鼠是否对疼痛无反应，然后对腹部进行消毒。先用碘伏溶液擦拭，再用异丙醇酒精片擦拭至少一分钟。练习剖腹手术时，用镊子在腹部中线提起皮肤，并做一个长约一厘米的小切口。然后抬起会阴部，再做一个小切口以暴露腹膜腔。使用弯头镊子夹住腹膜。通过腹膜将盲肠识别并暴露出来。将其放置在腹部。现在进行结扎操作。这是一个重要因素。为了确定模型的严重程度，我们可以通过调整手术操作的严重性来实现。结扎位置越靠近盲肠远端，小鼠产生的脓毒症越轻；若结扎部位位于盲肠中段，则产生中度脓毒症；若结扎部位靠近回盲瓣，则导致重度脓毒症。手术操作的严重程度将通过死亡率的百分比体现出来。切勿结扎回盲瓣。现在使用丝线缝合并打双结以确保结扎紧密。固定盲肠，然后在结扎部位附近小心地进行穿刺，再在盲肠末端附近进行第二次穿刺。盲肠壁膜较软，很容易穿孔。通过使用不同粗细的针头并制造一个或两个穿刺孔，我们还可以调节模型严重程度。此处展示的单穿刺或双穿刺方法是对传统贯穿式穿刺法的一种替代技术。采用单穿刺或双穿刺方法的优点在于，当挤压盲肠以获取内容物时，能够更有效地控制挤出粪便的量。用两根手指夹住盲肠，轻轻挤压盲肠以获取极少量粪便。关闭腹腔切口时，先提起腹膜，然后小心地将盲肠放回腹腔内。操作时需格外小心，避免镊子意外刺穿盲肠；建议使用较大的镊子。现在是关闭腹膜腔的时机。使用丝线缝合时，必须确保腹膜腔完全闭合。我们从伤口的一侧开始打结。持续进行缝合，直到另一侧，每次将丝线穿过前一个穿刺点的线环下方。关闭皮肤时，可使用米切尔伤口夹或回弹式夹，配合正确的工具来闭合夹子。放置足够数量的夹子以确保伤口闭合。通过皮下注射一毫升预温的生理盐水溶液来对小鼠进行复苏。使用25号针头，该液体复苏措施将诱发脓毒症的高动力相，从而完成该操作程序。将小鼠置于红外加热灯下，或 alternatively 放在加热垫上，直至小鼠从麻醉中恢复。在笼子底部提供食物和水，并每 8 到

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