Name: 腔内中东大脑中动脉闭塞（MCAO）缺血性中风模型在小鼠体内的激光多普勒血流指导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: 学习使用激光多普勒血流监测技术在小鼠体内建立大脑中动脉闭塞缺血性中风模型。该方法通过腔内线栓技术实现可重复的脑缺血研究，为神经科学和卒中治疗研究提供可靠的实验基础。

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本方案已获得佛罗里达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合《实验动物照护原则》（NIH 出版物第 86-23 号，1985 年修订版）。
 1. 材料
 <ol>
 <li>动物：雄性 C57BL/6 小鼠（Harlan Laboratories，Indianapolis，IN，USA），手术时体重为 20–26 克。</li>
 <li>麻醉：
 <ol>
 <li>麻醉机：VetEquip 吸入式麻醉系统（VetEquip Inc.，Pleasanton，CA，USA）。</li>
 <li>吸入麻醉剂：异氟烷（Isoflurane，Baxter Pharmaceutics，Deerfield，IL）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>手术器械：SuperCut 虹膜剪刀，直型（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）；Vannas 显微剪刀，直型（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）；Dumont 镊子（细尖，45° 弯头，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）；双极电凝装置（高频电凝器 900，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）；微血管夹（World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）。</li>
 <li>手术耗材：无菌棉签；擦拭巾；纱布块；缝线（7-0 丝线，Ethicon, Inc.，Somerville，NJ，USA）；组织粘合剂（Vetbond，3M 公司，St Paul，MN，USA）；外科消毒剂：贝塔碘、70% 乙醇和无菌 0.9% 生理盐水；眼药膏（Puralube Vet Ointment，Pharmaderm，Melville，NY，USA）。</li>
 <li>大脑中动脉阻塞（MCAO）用阻塞缝线制备：
 <ol>
 <li>用于大脑中动脉阻塞的缝线：7-0 外科尼龙单丝缝线（Ethicon, Inc.，Somerville，NJ，USA）。</li>
 <li>缝线尖端钝化用热源（热灼仪，Thermal Cautery Unit，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL）。</li>
 <li>液态硅橡胶（Silicone RTV 粘合剂，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL，USA）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>手术/解剖显微镜（Leica Stereo Microscope MZ6）。
 <ol>
 <li>光纤照明器（Fiber Optic illuminator FO1–150，TechniQuip Corp.，Livermore，CA，USA）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>激光多普勒血流仪（PeriFlux System 5000，Perimed，Stockholm，Sweden）。
 <ol>
 <li>柔性微探头（MT B500-0 直型微探头，Perimed，Stockholm，Sweden）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>温度参数：
 <ol>
 <li>直肠温度监测仪（BAT-12，World Precision Instruments, Inc.，Sarasota，FL）。</li>
 <li>加热毯（T/PUMP，TP600，Gaymar，NY，USA）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>梗死体积染色与定量测量：
 <ol>
 <li>2% 氯化三苯基四氮唑溶液（2% TTC，Sigma-Aldrich Co.，St Louis，MO，USA）。</li>
 <li>小鼠脑组织切片模具（Zivic-Miller Lab., Inc.，Allison Park，PA，USA）。</li>
 <li>数码相机（V1253，Kodak Co.，Rochester，NY，USA）。</li>
 <li>图像分析软件（ImageJ 1.42q 软件，美国国立卫生研究院，Bethesda，MA，USA）。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. 术前准备步骤
<ol>
 <li>手术前，将小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，自由饮水并摄取啮齿类动物饲料。</li>
 <li>制备MCAO用缝合线时，先用加热法将缝合线尖端1-2 mm处钝化，再用液态硅橡胶涂覆其尖端以下3-4 mm的杆部，并使其干燥（7-0规格；尖端直径0.20-0.25 mm；涂层长度3-4 mm；缝合线总长11-13 mm）。上述所有步骤均应保持无菌。</li>
 <li>称量小鼠体重后，在诱导舱中以4%异氟烷诱导麻醉，并通过面罩给予1.5-2%异氟烷与30% O2 和70% N2O混合气体以维持术中麻醉。</li>
 <li>将小鼠俯卧位置于铺有纱布的温控手术台（加热毯）上，剃除头部毛发。</li>
 <li>双眼涂抹眼用润滑软膏，并闭合眼睑，以防止手术过程中角膜干燥。</li>
 <li>在颅骨表面从枕外隆凸至鼻根上方的皮肤做一条中线切口（长约1 cm），将皮肤向两侧牵拉，固定一个柔性微探头（MT B500-0 Straight Microtip；直径0.5 mm）。将微探头垂直置于右侧顶骨表面（位于前囟后方1 mm、外侧5 mm处），用于通过激光多普勒血流仪监测大脑中动脉供血区域的血流变化。</li>
 <li>在将动物转为仰卧位前，需确保柔性微探头已牢固固定于颅骨上。将动物颈部置于软垫上，鼻部插入麻醉装置的鼻罩中，以便为柔性微探头留出足够空间。</li>
 <li>插入直肠温度探头，以维持动物核心体温恒定在37±0.5°C。</li>
 <li>用胶带将双前肢和双后肢固定于手术平台表面，尾巴固定于直肠探头导管上。</li>
</ol>
3. 大脑中动脉闭塞手术：
<ol>
 <li>在手术显微镜下，用剪刀在胸骨柄与下颌之间轻轻提起疏松皮肤，做一正中颈部切口。</li>
 <li>钝性分离下方成对的下颌下腺，左侧下颌下腺保持原位；将右侧下颌下腺向头侧牵拉，并连同胸锁乳突肌一起固定。</li>
 <li>用镊子仔细分离覆盖颈动脉鞘的肩胛舌骨肌肌腹部分。</li>
 <li>仔细分离并游离右侧颈总动脉（CCA），使其与迷走神经及其鞘膜（位于 CCA 外侧）分开。</li>
 <li>此后，常用于实施大脑中动脉阻塞的两种手术方法开始分异：</li>
</ol>
小泉法4
<ol class="lroman" type="i">
 <li>在右侧颈总动脉（CCA）上预先放置三根松散的套管缝线（7-0 丝线）。</li>
 <li>辨认、游离颈外动脉（ECA），并在距分叉处远端 2–3 mm 处进行电凝烧灼（所有电凝操作均应将功率旋钮调至 1 档，以避免烧灼部位意外损伤周围组织）。随后可用显微剪刀将其切断。</li>
 <li>对最靠近近端的 CCA 套管缝线施加足够张力，以完全阻断血流（永久性结扎）。通过观察皮层灌注基线值下降约 50% 来确认血流阻断效果。</li>
 <li>在 CCA 分叉前紧邻处放置血管夹，以防止动脉切开时出现逆向血流。</li>
 <li>使用显微剪刀在 CCA 上靠近结扎缝线近端与血管夹之间的区域行动脉切开（更靠近结扎处）。</li>
 <li>通过动脉切口插入经加热钝化处理的硅胶包被 7-0 尼龙缝线，并向前推进直至触及血管夹。随后，轻柔收紧剩余的两根松散套管缝线，缝线位置位于动脉切口与血管夹之间的 CCA 上，以防止血液经 CCA 逆流渗漏，操作中需注意避免损伤动脉管壁；然后撤除血管夹。</li>
</ol>
Longa的方法3
<ol class="lalpha" type="a">
 <li>识别出颈外动脉（ECA），尽可能进行分离（接近其分叉为舌动脉和上颌动脉处），使用功率设为1的电凝设备烧灼，并用显微剪刀切断。</li>
 <li>在颈总动脉（CCA）分叉上方的近端颈内动脉（ICA）周围预先放置两根松绕结扎线（7-0 丝线）。</li>
 <li>使用血管夹暂时闭合颈总动脉（CCA）。通过观察皮层灌注值较基线水平下降约50%来确认血流阻断效果。</li>
 <li>在两根松绕结扎线近端上方，用血管夹暂时夹闭颈内动脉（ICA），以防止动脉切开时发生逆行血流。</li>
 <li>在颈外动脉残端附近，使用显微剪刀于返折的ECA处行动脉切开术。</li>
 <li>通过ECA上的动脉切口插入经加热钝化并涂有硅胶的7-0尼龙缝线，将其向前推进直至接触ICA内的血管夹。轻轻收紧位于近端ICA的两根松绕结扎线，以防止血液经ICA反流，操作时需注意避免损伤动脉壁；随后撤去血管夹。</li>
</ol>
其余步骤基本相同：
<ol>
 <li>将阻塞缝线缓慢经由颈内动脉（ICA）向颅底方向推进，直至遇到轻微阻力。同时通过激光多普勒血流仪确认脑血流量下降至基础值的80%。随后收紧两条套圈缝线，固定插入的缝线。</li>
 <li>对于短暂性脑缺血实验，在45分钟后轻柔撤出阻塞缝线。此时间点可根据不同实验目的进行调整。</li>
 <li>撤出缝线后，需闭合动脉切口以防止术后出血。在Koizumi法中，通过牢固收紧围绕颈总动脉（CCA）的套圈缝线实现闭合；在Longa法中，则对颈外动脉（ECA）根部的动脉切口进行电凝闭合，随后松开并移除位于颈内动脉近端的套圈缝线，以恢复颈动脉血流。</li>
 <li>为关闭切口，将下颌下腺和胸锁乳突肌（SCM）覆盖于手术区域之上，然后使用组织粘合剂对颈部和头皮部位的伤口边缘进行对合。也可选用可吸收缝线或金属钉合器关闭伤口，尤其是在需要动物长期存活的情况下。</li>
 <li>切口闭合后，皮下注射1 ml温热生理盐水以补充血容量。恢复期间应给予适当镇痛药物（如布托啡诺，剂量为0.05–0.1 mg/kg），以最大程度减轻动物疼痛与不适。手术结束后将动物移出手术室，置于温暖的恢复区或笼具中，防止低体温，并确保其可自由、方便地获取软质食物和饮水。</li>
</ol>
4. 术后神经功能评估
动物完全恢复意识后，可通过一个简单的五分制评分标准来评估神经功能缺损情况3：
<ol start="0">
 <li>无可见功能缺损</li>
 <li>对侧前肢伸展不能（轻度局灶性神经功能缺损）</li>
 <li>向梗死灶对侧方向转圈（中度局灶性神经功能缺损）</li>
 <li>向梗死灶对侧方向倾倒（重度局灶性神经功能缺损）</li>
 <li>意识水平下降，无自发运动</li>
</ol>
5. 脑梗死体积的染色与定量测量
<ol>
 <li>在大脑中动脉（MCA）再灌注 24 小时后，对存活的小鼠进行称重，使用 4% 异氟烷深度麻醉，并根据批准的方案实施安乐死。</li>
 <li>小心取出小鼠脑组织，置于小鼠脑切片模具中，将整个大脑以冠状面方向每 2 mm 进行切片。</li>
 <li>将脑片浸入含 2% TTC 的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在 37 °C 下孵育 20 分钟。TTC 染色后，梗死区域呈现为白色（未染色）组织，邻近呈砖红色（存活）组织（图 1）。</li>
 <li>使用数码相机拍摄连续切片图像，并利用 ImageJ 软件测量梗死面积。</li>
 <li>测量每张切片的梗死区（白色，未染色）、同侧半球（白色与砖红色，已染色）以及对侧半球（砖红色，已染色）的面积。通过将所有切片中代表性区域的面积相加，再乘以切片厚度，计算总体积。校正水肿后，梗死体积按以下公式计算9： 
 校正梗死体积（CIV），% = [对侧半球体积 - (同侧半球体积 - 梗死体积)] / 对侧半球体积 × 100</li>
</ol>
6. 代表性结果
通过左侧颈总动脉阻断和再灌注大脑中动脉以建立短暂性脑缺血后，处死动物并将其脑组织进行冠状切片，用TTC染色以评估梗死体积（图1）。
<img src="/files/ftp_upload/2879/2879fig1.jpg" alt="种子横截面示意图，突出显示农业研究中的生理差异。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 经MCA闭塞处理的小鼠脑部连续冠状切片（2 mm）的TTC染色结果。

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).</li>
<li>Lloyd-Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2009+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 119, e21-e181 (2009).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema.+I.+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurol Res. 19, 641-648 (1997).</li>
<li>Fujii, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-related+differences+in+susceptibility+to+transient+forebrain+ischemia+in+SV-129+and+C57black%2F6+mice.+%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. </a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).</li>
<li>Bederson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+as+a+stain+for+detection+and+quantification+of+experimental+cerebral+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).</li>
<li>Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+4-phenylbutyrate+protects+against+cerebral+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury.</a> Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).</li>
<li>Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+susceptibility+to+cerebral+ischemia+are+related+to+cerebral+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ideal+suture+diameter+is+critical+for+consistent+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).</li>
<li>Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+model+of+focal+ischemia+in+the+mouse%3A+a+study+with+histopathological+and+behavioral+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).</li>
<li>Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+induced+prolonged+protection+against+cerebral+ischemia+in+mice%3A+a+redox+sensitive+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?</a> Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

大脑中动脉阻塞（MCAO）模型是一种已建立的、用于在小鼠中复制脑缺血的模型。该模型最初在大鼠中使用，随后被改进并应用于小鼠。该技术的一个优势是避免开颅手术，从而消除手术操作对血脑屏障通透性和颅内压的影响。然而，许多变量，如品系差异10、缝线尖端大小11、阻塞持续时间6、体温12、麻醉方式13以及其他因素，可能导致该模型中梗死体积的不一致。 以下是一些需要特别指出的技术细节：
<ol>
	<li>对缝线末端进行包被处理，可获得更光滑且易于操作的缝线，用于闭塞大脑中动脉（MCA），从而降低穿孔风险。</li>
	<li>精细分离并固定迷走神经，使其远离邻近动脉，避免在套扎缝合时意外受压。务必使用两道套扎缝线，以防止在推送闭塞缝线过程中经切口发生逆行出血；结扎时应轻柔操作，避免损伤动脉管壁。</li>
	<li>翼腭动脉在颈总动脉（CCA）分叉后从颈内动脉（ICA）分出。为避免上升中的缝线尖端误入翼腭动脉而非进入ICA，应调整手术平台，使小鼠头部与颈部保持直线方向。此类偏差在Koizumi法和Longa法中均较常见，因此...

<table><tbody><tr><td>雄性 C57BL/6 小鼠</td><td>动物</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td>20–26 克</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>6.3:1 变焦</td></tr><tr><td>光纤照明器</td><td>照明器</td><td>TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA</td><td>FO1&amp;#8211;-150</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>麻醉剂</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>SuperCut 直头虹膜剪</td><td>手术工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 微型直头剪</td><td>手术工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 精细尖镊子</td><td>手术工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>503290</td><td></td></tr><tr><td>血管夹</td><td>手术工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>高频电凝器 900</td><td>手术工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500397</td><td></td></tr><tr><td>7-0 外科尼龙单丝缝线</td><td>缝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1647G</td><td>用于闭塞的缝线</td></tr><tr><td>7-0 外科丝线缝线</td><td>缝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>7733G</td><td>用于结扎的缝线</td></tr><tr><td>硅酮 RTV 粘合剂</td><td>硅橡胶</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1571</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>组织粘合剂</td><td>3M</td><td>70200746587</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 软膏</td><td>眼膏</td><td>Pharmaderm Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡</td><td>镇痛药</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2012-32</td><td></td></tr><tr><td>热凝装置</td><td></td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501292</td><td></td></tr><tr><td>PeriFlux System 5000</td><td>经颅多普勒血流测量仪</td><td>Perimed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAT-12</td><td>直肠温度计</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>BAT-12R</td><td></td></tr><tr><td>T/PUMP, TP600</td><td>加热毯</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基四氮唑氯化物</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>小鼠脑组织切片模具</td><td>脑切片器</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠缺血性卒中激光多普勒血流仪引导下经腔内大脑中动脉阻塞（mcao）模型

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

脑卒中是全球第三大死因，也是致残的首要原因，仅2009年在美国的估计费用就接近700亿美元1,2。1986年，Koizumi4建立了大脑中动脉栓塞（MCAO）的血管内模型，以在大鼠中模拟这种具有重大影响的人类疾病。随后，Longa3对该MCAO方法进行了改良。这两种技术已被广泛用于研究缺血性脑卒中导致的脑损伤分子机制以及潜在的治疗手段5。这种在大鼠中相对非侵入性的方法后来被扩展应用于小鼠，以便利用转基因和基因敲除品系6,7。为了模拟局灶性脑缺血，通过颈内动脉插入血管内缝线，以阻塞大脑中动脉（MCA）的起始部。在设定的时间后撤回缝线可模拟自发再灌注，但缝线也可永久保留。本视频将逐步演示在小鼠中实施血管内MCAO手术的两种主要方法，并提供有关潜在缺陷和注意事项的见解。随后将采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）对缺血脑组织进行染色，以评估脑梗死的范围8。

大脑中动脉闭塞（MCAO）的管腔内模型是实验性缺血性卒中模型中最常用的模型。本文将结合激光多普勒血流仪的引导，详细演示该模型的全部操作步骤及其典型结果。

小鼠缺血性卒中激光多普勒血流仪引导下经腔内大脑中动脉阻塞（MCAO）模型

中风是全球第三大死因，也是致残的首要原因，仅美国每年的相关费用估计接近700亿美元。

在本视频文章中，我们介绍一种已知的缺血性脑卒中动物模型，称为大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。在最初的线栓法大脑中动脉闭塞方法中，将一根钝头缝合线经由颈总动脉推进，以阻塞大脑中动脉。该方法会导致颈总动脉永久性闭塞。Longa 提出的一种方法学改良可通过颈外动脉进入大脑中动脉。该方法在实验性缺血性卒中模型中保留了颈总动脉及其远端循环的功能。大鼠和小鼠的血管内线栓大脑中动脉阻塞模型自首次在大鼠中描述以来，已成为最常用的模型之一；此后已发表多种对该初始模型的改良方法，其中以 Longa 的改良最为突出。该模型侵入性较小，且能够以受控方式方便地实施永久性和短暂性缺血。血管内线栓大脑中动脉阻塞模型是将单丝线栓插入颈内动脉，并向前推进直至阻断大脑中动脉的血流。该模型可产生可重复的大脑中动脉供血区域梗死，并可在撤出线栓后实现再灌注。梗死灶的大小似乎受到该技术中多种特定因素的影响，例如缝合线直径、缝合线是否涂覆硅胶或聚赖氨酸，以及探丝插入长度本身。在本视频中，我们将逐步演示如何实施该模型，同时介绍如何避免使用该方法时可能遇到的诸多潜在问题和缺陷。将使用7.0单丝尼龙缝合线进行大脑中动脉阻塞。应将尼龙缝合线末端靠近热源以使其变钝。钝化后的末端应平直、光滑，长度约为一到两毫米。钝化末端后，应将缝合线剪至总长度约11至13毫米。将缝合线的钝端浸入硅胶中，直至末端3至4毫米被覆盖，然后使其干燥。缝合线制备的所有步骤均应在无菌条件下进行。称量小鼠体重后，使用4%异氟烷在诱导室中进行麻醉诱导。将小鼠俯卧于置于加热毯上的纱布垫上。通过面罩维持麻醉，以保持37摄氏度的核心体温。剃毛后的头部用酒精、碘伏和酒精再次清洁。在皮肤上做一个一厘米的切口，暴露位于bgma后方一毫米、外侧五毫米处的颅骨。将一个带有柔性微探针的探头垂直固定在右侧顶骨表面，通过激光多普勒血流成像监测大脑中动脉供血区域的血流情况。将动物恢复至仰卧位，在胸骨柄与下颌之间用剪刀沿颈部正中线做一切口。钝性分离成对的下颌下腺，以暴露其下方的结构，包括二腹肌、胸锁乳突肌和气管。通过牵开这些结构并进一步解剖，可显露颈总动脉、迷走神经以及位于颈总动脉外侧的颈内静脉。颈总动脉在此处分叉为颈外动脉和颈内动脉。枕动脉也可见起源于分叉区域。在COE法中，需仔细分离并游离颈总动脉近端，使其与迷走神经分开。在颈总动脉周围预先放置三根松解用套圈缝线。需特别注意，避免迷走神经被缝入缝线中。找到并分离出颈外动脉，然后在其分叉远端2至3毫米处进行电凝灼烧。收紧颈总动脉上最靠近近端的结扎线，以永久阻断血流。通过观察皮层灌注值从基线水平下降约50%来确认血流阻断效果。剪除结扎线的游离端。在颈总动脉分叉前方放置一个血管夹，以防止血液逆流。接下来，使用显微剪刀在血管夹与结扎线之间进行动脉切开。由此可将经热钝化的缝线插入颈总动脉，并向前推进直至到达血管夹处。随后轻轻收紧剩余的两根松动的套圈缝线，以防止颈总动脉发生逆流渗漏。撤出血管夹，将钝化的缝合线轻轻推进至颈内动脉内，直至多普勒读数显示轻微阻力，此时血流速度较基线下降约80%。牢固收紧两条荷包缝线，以防止逆行性出血。现在可将小鼠维持在缺血状态一段时间。为模拟再灌注，在适当的时间间隔后撤出阻断缝线。多普勒读数的升高表明侧支血流已恢复。完全撤出缝合线，并使用长法彻底收紧并修剪两条环形缝合线。可采用不同的路径闭塞大脑中动脉。首先，必须识别并分离颈外动脉，尽可能向远端烧灼，保留足够长度以供缝合线插入。随后离断颈外动脉，并对其分支进行电凝并切断。将颈外动脉残端牵开。在颈总动脉分叉上方的近端颈内动脉周围，预先置入两根松绕的套圈缝线。使用血管夹暂时闭合颈总动脉，导致分叉远端灌注值下降约50%。用血管夹同样夹闭颈内动脉，并使用显微剪刀在颈外动脉回缩残端末端附近进行动脉切开。将加热钝化的缝合线经动脉和外颈动脉导入，并向前推进，直至到达颈内动脉上的血管夹处。轻轻收紧环绕近端颈内动脉的两根松动结扎线，以防止血液反流，但收紧程度应以不损伤动脉壁为限。随后移除颈内动脉上的血管夹，此时三腭动脉自颈内动脉分出。当轻柔推进缝线时，必须格外小心，避免其发生偏转。多普勒读数显示出现第二次下降。当钝性缝线到达大脑中动脉时，需再次收紧套管缝线，以防止逆行性出血。现在可将小鼠维持在缺血状态一段适当的时间。回撤钝性缝线可恢复血流，多普勒监测仪上显示信号升高即表明血流恢复。待缝线完全移除后，对颈外动脉残端进行电灼处理。为防止术后出血，必须注意保持颈总动脉的通畅。随后松开并剪除位于近端颈内动脉处的结扎缝线，并移除颈总动脉上的夹子以恢复血流。多普勒读数上出现第二次跳跃即提示血流恢复。小鼠恢复意识后，可根据五分制在不同时间点评估其神经功能缺损。评分为0表示无可见神经功能缺损；评分为1表示轻度脑卒中，表现为无法伸展脑卒中半球对侧的前肢；评分为2表示中度脑卒中，表现为向脑卒中半球对侧相反方向转圈。评分为3分，对应于严重中风，表现为向与中风半球相反的方向倾倒。评分为4分的小鼠将表现出无自发运动活动。为了获得脑卒中体积的测量值，需在适当的时间点将脑组织从颅骨中取出。再灌注后，将脑组织置于切片矩阵中，并对整个大脑进行冠状面切片。每2毫米间隔切取一片，弃去小脑和嗅球部分。每片2毫米厚的脑组织切片置于2% TTC溶液中，于37°C避光孵育20分钟。脑切片的数字图像显示，TTC 将存活组织染成红色，而梗死组织则呈现苍白的白色。图中标记为“1”的区域为梗死面积，标记为“2”的区域为同侧半球总面积，标记为“3”的区域为对侧半球面积，所有区域均使用 Image J 程序进行测量。在测得所有切片的面积后，可通过将各面积数值相加并乘以切片厚度，计算出相应体积。为计算经水肿校正后的梗死体积，需使用以下公式。该体积以同侧半球体积的百分比表示。MCO 模型可提供可重复的结果。然而，一些操作因素可能会影响该技术的实施。缝线末端的硅酮涂层非常重要，因为它可以平滑缝线表面，降低内皮擦伤或血管穿孔的风险。此外，可根据不同的实验目的对缝线涂层进行相应 modifications。距离尖端超过三到四毫米处的包被将堵塞大脑中动脉近端的动脉，从而增加总体卒中体积。缝合线应小心使用，避免压迫迷走神经，并轻柔结扎，以免损伤AAL壁。小鼠体温可能影响梗死范围，因此在整个操作过程中应保持体温稳定。我们希望观看本视频能帮助您了解手术操作流程，并为您的实验提供一个扎实的起点。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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