Name: Microiontophoresis和显微操作的微循环活体荧光成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学习微离子电泳技术，通过微电极将乙酰胆碱等带电物质精准递送至微循环特定部位，结合活体荧光成像记录内皮细胞钙信号变化，研究血流调控的细胞信号机制。该技术可应用于神经生理学和血管生物学研究。

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作者实验室的研究工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 R37-HL041026、R01-HL086483 和 R01-HL056786（SSS），以及美国公共卫生服务局资助的 F32-HL097463 和 T32-AR048523 项目（PB）。

1. 动物护理与使用
在获得机构动物护理和使用委员会的审查与批准后，使用至少12周龄的雄性小鼠。通过腹腔（i.p.）注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）对小鼠进行麻醉。在整个手术过程和实验操作期间，根据需要（每30-60分钟一次；以脚趾或尾部夹捏时无回缩反应为指标）追加初始剂量的10-20%作为补充麻醉剂以维持麻醉状态。实验操作完成后，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠使小鼠深度麻醉，随后以颈椎脱位法实施安乐死。
2. 微量移液器与微电泳
<ol>
 <li>使用水平拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管制备微电泳移液管（内部尖端直径约 1 μm）。我们的移液管具有约 5 mm 的锥形部分以增加刚性；较长的锥形部分则更柔软。</li>
 <li>用 1 M ACh（图1A-C）溶解于 18.2 MΩ 水中，从后端填充移液管。进行后端填充时，将微毛细管连接至装有待测激动剂的注射器上的 0.2 μm 滤器（图1）。这些装置可自行制备（见下文），也可从商业供应商处购买。将微毛细管插入移液管的后端，在移液管填充过程中缓慢抽出微毛细管，从而将 ACh 溶液注入管腔。手持移液管使其尖端朝下，轻轻弹击移液管以排除气泡。</li>
 <li>将移液管固定在安装于显微操作器的持针器中（图2）。持针器内含一根银丝，连接移液管内的 ACh 溶液至外部插针，该插针再连接至微电泳程序控制器的正极端。另一根银丝固定在组织制备物边缘，连接至负极端，当移液管尖端推进至覆盖组织的生理盐水溶液中时，形成完整电路。</li>
 <li>当移液管尖端位于小动脉壁附近时，施加维持电流以防止血管舒张（或荧光反应）。维持电流的大小取决于移液管尖端尺寸（内径 = 1 μm）和激动剂浓度，但在特定参数下具有高度可重复性（对于 1 M ACh 和 1 μm 尖端，我们使用约 200 nA）。维持电流在电子触发器（补充图1）启动时停止，该触发器与图像采集的开始同步，同时启动推出电流。</li>
</ol>
3. 显微操作
<ol>
 <li>使用铁磁性不锈钢加工制作了一个用于X-Y显微镜载物台的定制平台。该平台的尺寸（1/8英寸 × 12英寸 × 13英寸）可为实验准备提供充足空间，便于按需布置显微操作器（图2A）。将显微操作器固定在磁性底座上（图2B），可根据实验准备的需要进行定位。这些装置直接放置在所制备平台的周围，用于将微电极移至感兴趣的位置（图2C）。</li>
</ol>
4. 代表性结果
<ol>
 <li>将微量移液管尖端置于小动脉旁时，乙酰胆碱（ACh）会引起荧光反应（保持电流以防止ACh泄漏）。当刺激强度低于阈值时，无明显效应。然而，随着刺激强度增加，沿小动脉的内皮细胞钙离子荧光反应在更远的距离上逐渐增强，且在刺激部位的荧光强度也随之增加（图3）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="导管装置配注射器和针头；详细说明医学实验操作步骤。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 微离子电泳移液管后填充方法。A) 将微毛细管（绿色箭头）固定在压缩接头（蓝色箭头）中，该接头连接一个0.2 μm滤器（紫色箭头），再与装有1M ACh的注射器相连。B) 从微离子电泳移液管的尾端将微毛细管插入，推动溶液以充满移液管的管腔。C) 移液管充满后，将管尖朝下，轻轻弹击锥形部位上方，以去除气泡（黑色箭头）。
<img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="光学激发显微镜装置；光谱分析组件；发射光测量。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 用于微操作器定位的定制平台。A) 将一块铁磁性不锈钢平台放置在定制的MVX10显微镜底座上，该底座包含一个X-Y平移台。B) 圆形磁性底座固定在紧凑型三轴微操作器的底部。C) 微操作器围绕实验样品布置（参见相关实验方案：JoVE ID#2874），以研究特定感兴趣区域。其紧凑的尺寸和多功能性可实现多个微移液管的同时使用。
<img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="不同电流下的荧光强度；带图表的示意图；发射分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 小动脉中的钙荧光。 随着刺激强度的增加，衬在小动脉壁上的内皮细胞的钙荧光增强。 
前3个图显示了对 A) 250 nA、B) 500 nA 和 C) 1000 nA 排出电流（均为500 ms脉冲持续时间）的荧光反应图像。A-C图中用方括号标示出内皮细胞钙荧光增强的距离（分别约为130、270和400 μm）。每个图中小动脉上的参考线表示在刺激部位记录乙酰胆碱（ACh）荧光反应（F/Fo）的位置。D) 随时间变化的F/Fo记录，对应逐渐增强的ACh刺激。随着排出电流的增加，F/Fo的幅度和持续时间均增加。注意，100 nA的刺激低于阈值，无任何效应。
<img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="电子电路图，M74HC4066开关，7805电压稳压器，输入-输出设置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="补充图1"> 
补充图1. 电子触发器的电路图。 该电路与个人计算机的并行端口相连。激活后可提供一个恒定的5V TTL脉冲。7805芯片是一个5V电压稳压器，连接至9–12V直流电源（使用适当电压的电池亦可）。7805的输出为四通道双向开关及整个电路的输出端供电。通过1K电阻的输入信号来自计算机。

<ol><li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability%3A+an+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li>
<li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree%3A+a+topographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+%28Rat+Cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li>
<li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li>
<li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp, S. egal, S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li>
<li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li>
<li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li>
<li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+importance+of+the+endothelial+K%2B+channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li>
<li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li>
<li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagated+endothelial+Ca2%2B+waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo%3A+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+Role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li>
<li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li>
</ol>

所有涉及动物的实验程序和方案均经密苏里大学动物护理与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院的规定执行 实验动物护理和使用指南 本文的制作由斯坦福光子学公司（Stanford Photonics）赞助。

本文所述方案展示了用于微离子电渗法的微移液管的制备与实施方法。通过递送乙酰胆碱（ACh）来演示麻醉小鼠微动脉中内皮依赖性血管舒张背后的钙信号机制。我们的结果表明，ACh引起内皮细胞钙荧光增加的作用距离随微离子电渗微移液管施加的推出电流强度的增加而增大（图3）。在静息条件下未观察到荧光增强，表明ACh从微移液管中的泄漏可忽略不计。在100 nA刺激强度下无反应（图3，图注）说明内皮细胞钙浓度升高需要达到一定的刺激强度阈值。这些技术可轻松适用于其他血管活性物质及组织样本的实验。
实际注意事项：在使用微离子电渗法研究小动脉反应性时，应注意以下几点。尽管确定递送激动剂的实际浓度较为困难，但在同一制备样本内及不同样本之间，刺激-反应曲线具有可重复性。可通过保持脉冲持续时间恒定（例如 500 ms）并改变推出电流（例如 250、500 和 1000 nA；图3）来完成此类实验。或者，也可保持推出电流恒定（例如 500 nA），而改变脉冲持续时间（例如 250、500 和 1000 ms）。若需参考特定激动剂浓度的作用，可通过灌流适当溶液来实现5。由于溶质推出的驱动力是电荷移动，因此待递送的物质必须带有净电荷，才能从微移液管中被置换出来。为确保目标物质为主要的电荷载体，应将其溶解于高浓度（例如乙酰胆碱为 1 M），以尽量减少电渗效应。当此过程需要调节微移液管填充液的 pH 值时，必须设置溶剂对照，以确认是否存在非特异性效应。还应进行单独电流通过的适当对照实验（例如使用充满等渗盐水的微移液管）。应确定药物从释放位点扩散的有效作用距离，最简便的方法是通过实验观察生理反应（例如推出乙酰胆碱后引起的血管舒张或细胞内钙离子升高）随微移液管与靶点之间距离增加而消失的现象。实际操作中，有效扩散距离很大程度上受微移液管尖端在组织中位置的影响；例如，若尖端压入组织导致其开口被堵塞，则推出效果将受损。过多的结缔组织尤其会造成干扰，应在手术准备过程中将其从组织表面清除。还应注意避免微移液管尖端处的目标物质耗尽。使用相对较短的脉冲（例如 ≤ 1 s）可将此问题降至最低。当持续施加电流（例如数秒）时，激动剂从尖端排出的速度可能超过其通过扩散从微移液管内主体填充液中补充的速度。
由于微离子电泳置换的体积可忽略不计，若需改变局部离子环境（例如，递送去极化的 K+ 刺激），则无法通过微离子电泳有效实现，而可通过压力喷射具有目标成分的大量液体轻松实现。对小动脉进行局部刺激时，使用尖端内径为 2–3 μm 的微移液管，配合 4–5 psi（28–35 kPa）的喷射压力，并通过电磁阀控制脉冲持续时间（例如，1 秒），效果良好10。当需要从小口径移液管对微血管持续递送试剂时，宜采用具有适当尖端内径（例如，˜10 μm）的微移液管进行压力喷射11,12。使用已知高度的静水柱并配备止流阀，可提供一种低成本、定义明确且可开关的恒定压力源。流速由移液管尖端的内径和驱动压力决定。与所有实验操作相同，必须设置溶剂对照，以排除压力喷射本身的非特异性效应。

<table><tbody><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Warner Instruments</td><td>GC120F-10</td><td></td></tr><tr><td>水平毛细管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>model P-97</td><td></td></tr><tr><td>氯化乙酰胆碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>Luer 接头适配器</td><td>Martech</td><td>AC1343</td><td>用于固定微毛细管</td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m 尼龙钛滤膜</td><td>Sun Sri</td><td>42204-NN</td><td>低滞留体积，以最小化样品损失</td></tr><tr><td>5 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>移液管支架</td><td>Warner Instruments</td><td>E45W-M12VH</td><td></td></tr><tr><td>银丝</td><td>Warner Instruments</td><td>AG10W</td><td>直径 0.25 mm</td></tr><tr><td>三轴微操纵器</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td>DT3-100, MXB, MXC, MGB/8</td><td>操纵器组件如图所示</td></tr><tr><td>微离子电渗电流编程器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Model 260</td><td></td></tr><tr><td>触发装置</td><td>定制</td><td>custom</td><td>电路设计见补充图1</td></tr><tr><td>不锈钢板</td><td>McMaster-Carr</td><td>1/8&quot; X 12&quot; X 12&quot;</td><td>根据设计要求</td></tr><tr><td>增强型数字相机</td><td>Stanford Photonics Inc</td><td>XR/Mega-10</td><td>与 Piper 控制软件集成</td></tr></tbody></table>

微离子电渗与显微操作用于活体微循环荧光成像

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

微离子电渗法通过微电极尖端施加电流，从而在实验制备的特定部位递送溶质。微离子电渗法可通过可重复地将神经递质和神经肽递送至神经元，模拟突触传递12。由于液体体积位移可忽略不计，因此可避免对实验制备造成机械干扰。将这些技术应用于微循环3后，可在活体条件下于显微水平研究血管舒张和血管收缩的机制in vivo4,5。这种局部递送的关键优势在于，可在微血管网络的特定部位研究血管运动反应，而不会引发全身性或反射性的血压和组织血流变化，从而揭示微血管的内在特性。
微离子电渗入法的一个局限性在于，难以准确确定递送到目标部位的试剂精确浓度6。然而，试剂从微电极尖端的释放量与推出电流的强度和持续时间成正比2,7，因此在既定的实验条件下，可容易地确定可重复的刺激-反应关系（如下所述）。影响微离子电渗入递送的其他因素包括溶质浓度及其在溶液中的电离状态。微电极尖端的内径应为˜ 1 μm或更小，以最大限度减少扩散性“泄漏”，这种泄漏可通过施加保留电流来抵消。因此，使用向外的（正向）电流将阳离子推出，而使用负向电流将其保留在微电极内部。
使用精密的电子拉制仪可方便地制备微电极8。微电极由含丝状结构的玻璃毛细管拉制而成，当从后端（“后向填充”）填充溶液时，该丝状结构可将溶液“虹吸”至微电极尖端。操作时，将连接有注射器的微毛细管插入微电极后端，该注射器内含有所需溶液，随后将溶液注入微电极的内腔。显微操作仪可实现微电极在实验样本中的精确定位。安装在可移动底座上的显微操作仪可根据微血管网络的拓扑结构（如下所述）灵活地布置在样本周围。
本实验方案展示了将乙酰胆碱（ACh+ Cl-）通过微离子电渗法施加于小鼠提睾肌肌瓣中的微动脉，以诱导内皮依赖性血管舒张（参见相关方案：JoVE ID#2874）。刺激信号的传递与数字化图像采集通过电子触发器实现同步。使用Cx40BAC-GCaMP2转基因小鼠9，可在活体微循环中观察微动脉内皮细胞内钙离子响应，从而揭示血管舒张的细胞内机制。

微离子电渗法是指在微移液管内外电势差的作用下，离子从微移液管中移动的过程。生物活性分子由此以与电流成正比的方式递送。我们通过乙酰胆碱微离子电渗法结合微操作技术，来研究微循环中内皮依赖性血管舒张作用。

微离子电渗法是指通过微电极尖端施加电流，以在实验制备物的特定部位递送溶质。

本实验方案的总体目标是将带电物质（例如带正电的神经递质——微量乙酰胆碱）递送至实验制备物内的特定位置。该目标通过以下步骤实现：使用水平显微拉针仪从玻璃毛细管制备显微移液管，用微量乙酰胆碱回填显微移液管，并将该移液管固定于显微操作器上。随后，将显微移液管尖端定位至目标区域附近。在设定负向维持电流以防止微量胆碱泄漏的同时，通过施加特定强度和持续时间的正向电流，可从微电极中释放微量胆碱，同时记录微循环中荧光和管径的变化。这些信号用于检测内皮依赖性动脉舒张过程中与钙离子荧光相关的机制，该过程调控组织血流。我是Steve Siegel博士。该方法可用于深入研究调控血流及动脉功能的细胞信号事件。它也可应用于神经生理学，以研究突触传递以及离子通道的激活。我是Pune Badger博士。通常，初次接触该技术的人可能会遇到困难，因为需要经过练习才能掌握如何制备有效的微电极以进行微操作，并学会调节保持电流和注射电流，从而控制药物从微电极中的释放。首先使用拉针仪从带有内嵌玻璃丝的硼硅酸盐玻璃毛细管中制备微离子电泳用的微电极。建议采用5毫米的拉制长度以提供足够的刚性，而较长的拉制长度则更易弯曲。接下来，将连接有0.2微米滤器的后充针固定到注射器上，该注射器内含有溶解于18.2兆欧·厘米水中的1摩尔氯化乙酰胆碱溶液。现在将填充针插入微移液管的后端，并推进至尖端。在微移液管充液的同时，一边注入乙酰胆碱，一边缓慢撤出填充针。为去除任何气泡，将微移液管尖端朝下握住，轻轻弹击微移液管。接下来，将微量移液器固定在微量移液器支架中，再将该支架固定于三轴显微操作器上，例如安装在磁性底座上的紧凑型型号。将正极和负极导线连接至微离子电渗仪程序控制器。使用末端带有鳄鱼夹的导线，将一根银丝固定在制备样本的边缘，作为参比电极。使用鳄鱼夹，将来自微离子电渗仪编程器的负极导线连接到参考电极。然后将微离子电渗仪编程器的正极导线连接到微移液管 holder 的外部笔状电极。当用第二个鳄鱼夹将微移液管尖端插入生理盐水中时，电路即告完成。在准备过程中，该显微镜配备了一个定制平台，以增加XY载物台的表面积。该平台由铁磁性不锈钢制成，能够提供足够的空间，以便根据需要在实验样品周围放置显微操作器。将实验样品放置于平台上。在此示例中，肌肉组织已采用相关视频中的乳膏式肌肉制备方案进行准备。现在，调整微操作器相对于组织的位置，使微移液管尖端位于目标区域上方。接下来，为避免动脉扩张，使用微电泳编程器施加维持电流。保留电流随微移液管尖端的大小和激动剂浓度而变化，但在设定参数下具有高度可重复性。接下来，在显微镜下观察，同时使用显微操作器控制装置，将微移液管尖端小心地定位至微动脉壁附近。经过练习，此操作可在不损坏尖端或损伤组织的情况下完成。为了释放微弱的胆碱刺激，需使用至少五伏特的 TTL 脉冲触发微离子电渗装置。通过商用软件，可向计算机发送电子触发信号，该信号同时输出 TTL 脉冲并启动相机数字图像的记录。刺激脉冲的持续时间由软件控制。微电泳程序控制器调节推出电流。当其接收到TTL脉冲时，维持电流被切断，同时施加推出电流。这只小鼠的动脉内皮细胞表达钙敏感型GFP，当细胞内钙离子浓度升高并超过阈值时，GFP荧光强度随之增强；随着乙酰胆碱刺激持续时间的延长，微弱的胆碱可引发荧光反应。动脉中的内皮细胞钙荧光也增加。荧光强度在刺激部位升高，并沿动脉逐渐向更远距离扩散。进行此操作时，需注意微电泳的效果取决于微电极尖端的内径、微移液管内激动剂的浓度，以及喷射电流的强度和持续时间。观看本视频后，您应能充分理解如何利用微电泳技术将带电分子从微移液管递送至指定位置。在实验准备过程中。

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

Microiontophoresis和显微操作的微循环活体荧光成像

介绍了一种用于观察微循环的新颖且多功能的方法。该方法适用于长期观察，并可与药理生理学或分子生物学干预相结合。...

活体显微镜下测量骨骼肌内微循环

采用活体显微技术追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症事件的时间与空间变化。...

使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

活体显微镜可用于动物，以观察和测量视网膜血管直径、血流速度以及总视网膜血流量。...

小鼠视网膜血流的活体视频显微测量

在伤口愈合、炎症和肿瘤发生过程中，细胞外基质会发生显著的重塑。本文介绍一种新型的活体免疫荧光显微技术，可利用落射荧光或双光子显微镜，以高空间和时间分辨率可视化纤维状以及网状基质成分的动态变化。...

长期活体免疫荧光成像技术用于观察组织基质成分：基于落射荧光与双光子显微镜的方法

落射荧光显微镜，双光子显微镜，活体成像，免疫荧光，细胞外基质，胶原蛋白，基底膜，组织重塑，肿瘤微环境，炎症，纤维化

我们介绍了一种优化的局部喷射方法，该方法结合玻璃微移液管和快速双光子超堆栈成像技术，可精确测量毛细血管直径的变化，并在三维空间中研究其调控机制。...

利用玻璃微移液管局部喷射ATP，通过活体三维双光子显微镜研究传导性血管反应

我们介绍了一种利用倒置旋转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像，以观察表达GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞（γδ...

小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像

为了从高速毛细血管血流图像序列中量化微血管血流，我们开发了STAFF（全场时空血流分析）软件。该软件可对整个图像视野内随时间变化的血流速度进行评估，并生成一系列彩色编码的空间图谱用于可视化，同时提供表格化输出以进行定量分析。...

微血管内全场流动的时空分析

本方案描述了实现实时观察所需的手术与技术操作步骤 体内...

利用实时活体多光子显微镜观察聚焦超声联合微泡治疗以增强血脑屏障通透性

白细胞和血小板的募集是动脉生成过程中侧支动脉有效生长所必需的关键组成部分。多光子显微镜是一种能够以高时空分辨率追踪细胞动态的高效工具。 体内...

多光子活体成像监测小鼠后肢模型中动脉生成过程中的白细胞募集

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

活体荧光显微镜可用于实时研究白细胞与内皮细胞的相互作用以及毛细血管灌注。本方案描述了利用真空稳定肺成像系统对肺微循环中的这些参数进行成像和定量的方法。...

采用真空稳定成像系统对实验性急性肺损伤中肺微循环进行活体宽场荧光显微观察

学习微离子电泳技术，通过微电极将乙酰胆碱等带电物质精准递送至微循环特定部位，结合活体荧光成像记录内皮细胞钙信号变化，研究血流调控的细胞信号机制。该技术可应用于神经生理学和血管生物学研究。

微离子电渗与显微操作用于活体微循环荧光成像

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