使用扩散性抑制建模发作性与慢性偏头痛的神经免疫信号传导 体外

本视频旨在说明如何利用海马脑片培养来解析调控扩散性抑制易感性的神经免疫信号通路，扩散性抑制极可能是偏头痛先兆以及可能的偏头痛头痛的根本原因。在海马脑片培养中可轻易诱发扩散性抑制。由于这些培养脑片可在体外维持数周，因此可对各类细胞的行为进行长期测量、模拟和调控。

这对于神经免疫信号传导的研究尤为重要。由于成熟的海马脑片能够达到静息的免疫状态，因此可以利用现代分子生物学技术，在无需麻醉的情况下评估扩散性抑制的免疫反应，从而避免麻醉可能带来的干扰因素。相应地，可灵敏地检测到脑片中从少至50个细胞到约90,000个细胞所发出的细胞因子信号。

海马脑片培养物非常适合用于开发新型神经免疫疗法以缓解偏头痛。我是Yian Berg，这位是Aya Puss和Heidi Mitchell，我们来自芝加哥大学医学中心Richard Craig实验室及神经病学系。今天我们将演示如何利用大鼠海马脑片培养物来研究扩布性抑制中的低水平免疫信号。

扩散性抑制是一种阵发性神经事件，由突触活动增强的短暂爆发触发，随后迅速出现所有活动的暂时性丧失。越来越多的证据表明，低水平的免疫信号可影响脑内突触活动，同时也会受到突触活动的影响。我们假设，细胞因子可调节机体对扩散性抑制的易感性，从而影响偏头痛先兆，甚至可能影响偏头痛本身。

本文所述的实验步骤旨在尽量减少可能干扰的免疫细胞活化，提高我们检测低水平免疫信号的能力。这使我们能够检测最广泛的神经免疫信号及其与扩散性抑制之间的相互作用。开始此实验前，先将玻璃管切割成4.5毫米长的段，以制备接地电极。

然后将切割后的两端迅速进行火焰抛光。接着，将100毫升1摩尔的氯化钾加热至沸腾，加入3.5克琼脂和0.5克EDTA。持续搅拌混合物，直至形成澄清的黄色溶液。

将一段短的柔性软管套在每根玻璃管上。然后用吸力将温热的氯化钾琼脂溶液吸入玻璃管，并进入柔性软管一小段距离。松开吸力，使氯化钾琼脂溶液从玻璃管的开口端缓慢滴出。

当琼脂流出时，用打开的玻璃管尖端接触一块冰，这将促使琼脂在电极尖端处凝胶，而不会在回流进入玻璃管内部后凝胶。琼脂凝固后，轻轻移除软管，同时不改变琼脂的位置。在玻璃管中，向1.5毫升离心管架的每个孔中加入0.5毫升的1摩尔氯化钾溶液。

然后将每根氯化钾细玻璃管的尖端放入单独的孔中，以保持尖端湿润。接着，用止血钳夹住一段80厘米长的15号银丝。通过将银丝在固定于台面上的砂板上刮擦，清洁其四个侧面。

随后，将导线剪成四厘米长的段。将其放入盛有次氯酸钠溶液的闪烁瓶中浸泡20至30分钟。为了在清洁后的银表面形成牢固的氯化银涂层，将导线对折后插入装有氯化钾琼脂的玻璃管中，使约四至六毫米的导线暴露在外。

然后用一种防水且柔韧的胶水（goop）涂覆含有银丝的玻璃管尖端以及部分银丝，以防止氯化钾琼脂干燥，对所有电极重复此步骤，并让胶水过夜干燥。拉制完成后，将电极储存于闪烁小瓶中，每瓶加入5毫升1摩尔的氯化钾溶液和25毫克EDTA。每瓶存放约5至6根电极，于4摄氏度保存。

使用带细丝的硼硅酸盐玻璃管制作记录电极。接着，通过截取一段约20厘米长的特氟龙涂层铂铱合金丝制作刺激电极。然后将该金属丝对折弯曲，将松散的两端打成一个松散的方结，使结到金属丝末端的距离约为2厘米。

将打结的一端固定在放置于桌面上的电动手电钻夹头中，同时用止血钳夹住金属丝的另一端。短暂地开启和关闭电钻，直至金属丝被紧密绞紧。为将铂铱合金绞线连接至导线，首先用胶带将铂铱合金绞线固定在工作台表面，并在一端裸露的绞线上滴加一滴浓盐酸。

然后将剥去绝缘层的一端放在靠近绞合线末端的导线上，用细头电烙铁加热，直至两根导线牢固焊接在一起。取一段短的热缩管套在裸露的导线连接处，用热源加热使其收缩。打磨一根15厘米长的巴斯特管的尖端，并将绞合的铂金丝沿巴斯特管引导而下。

使用防水环氧树脂密封电极的两端。最后，在导线末端连接香蕉插头，以便在体视显微镜观察下与刺激隔离器连接。将电极尖端置于 PBS 中，检查是否仅有电极尖端切割处产生电解产生的气泡；若气泡从绞合导线的侧面逸出，则说明密封不严。

使用单刃剃须刀片横向切割电极，以重新建立对导线长轴的完整绝缘。当排查异常刺激效应问题时，尝试制备一个新切割的电极尖端。另一个重要步骤是准备记录用培养皿，该装置由一个脑片培养插件和一个直径35毫米的培养皿组成，培养皿置于两根长约1.0 × 12毫米、相距约1.0厘米的玻璃棒上。

使用镊子将玻璃管加热后按压到培养皿底部，从而将玻璃棒固定在培养皿底面上。在静态记录条件下，向培养皿中加入 1.5 毫升培养基。随后，浸湿一块无菌棉条，其宽度为 10 毫米，长度为 3 至 4 厘米。

在 1.0 毫升培养基中，沿长轴将棉条对折，并将其放置在插入物的内壁上。使用无菌镊子操作，湿润的棉条有助于维持培养皿内的湿度。在插入物周围等距放置三段可压缩的 4 毫米长管路。

用聚氯乙烯膜紧密封盖培养皿，以允许气体交换。然后使用单刃剃须刀片沿其垂直壁中部周围切割，以去除多余的聚氯乙烯膜。通过持续约 100 微秒、频率为 0.2 赫兹的脉冲刺激，从约 1 至 5 微安的电流开始（足以引发反应），诱发场电位。

沿顶叶神经元长轴以逐步移动记录电极，直至场电位达到最大。接着，在此位置增加电流，并记录约10至20微安的最大电流反应。最后，在实验中使用半最大刺激强度，以确定跨突触诱发的扩散性抑制的阈值。

将刺激模式切换为手动触发单次脉冲串刺激，每脉冲持续100微秒，频率为10赫兹。逐步增加每次刺激串的电流强度，直至诱发扩散性抑制。以诱发出扩散性抑制的阈值电流进行报告，并在一小时内每九分钟触发一次扩散性抑制。

通过独立的数字信号处理系统分别记录三个区域的快电位和慢电位变化。在最后一次扩散性去极化后，将培养插件恢复至正常培养条件，并标记培养皿盖。记录经历扩散性去极化的培养样本，并每三至四天更换一次培养基，直至收获培养物。

开始本实验前，先将ISO选择素用培养基稀释至20微克/毫升。随后，在成像前4至10小时将脑片培养物置于正常的培养条件下孵育，并在成像前至少1小时开启显微镜、相机、紫外光、温度控制系统及气体供应。接下来，按照以下步骤设置Metamorph成像软件：将插入物放入一个35毫米的培养皿中，皿底放置两根直径1毫米的玻璃棒。

然后在插件与培养皿壁之间安装三段直径为两毫米的橡胶管。为进一步固定插件，将一段宽10毫米、用额外1毫升培养基浸润的棉条置于插件内部。为维持湿润环境，需用聚氯乙烯薄膜紧密封住培养皿顶部。

为防止液体流失，务必使成像焦点位于CA3区锥体细胞层。通过在精细调焦窗口中以5倍、10倍和20倍放大倍数拍摄相差图像来记录切片的方向，设定电流范围为8，精度为1，点击“查找焦点”以确保在采集延时成像窗口中获得清晰对焦的图像。将时间间隔设为1分钟，持续时间为6小时，以准确捕捉小胶质细胞的运动。

在视频结束时，成像频率不应低于每分钟一次。通过 CY talk 筛查 PCR 实验以检测细胞损伤。将脑片培养插件浸入 2 至 3 毫升的 RNA later 中，并在 4°C 下保存，最长可保存三天，直至后续处理。

收获时，使用玻璃刀去除多余组织，将切片放入含有0.5毫升无菌磷酸盐缓冲液的无RNA、DNA污染的1.5毫升离心管中。用细头画笔轻轻搅动样品，在立体定向方式下以10,000 RPM离心一分钟，使所有切片贴附于各管的同一侧。

移除 PBS 上清液，并将样品重悬于 500 微升的裂解液中。将样品储存在 -80 摄氏度或置于冰上直至进行 RNA 提取。通过银增强法增强传统的 DAB 免疫染色，并随后进行密度计量定量，可灵敏地检测 siRNA 沉默引起的蛋白表达变化。图中显示的是脑片培养物的电生理记录范式，其中记录微电极置于 CA3 区锥体神经元层，双极刺激电极置于齿状回。

此处为通过刺激齿状回诱发的CA3区场电位示例，用于建立半最大反应；左图显示了CA3区场电位对10 Hz脉冲刺激的响应，刺激强度逐步增加，最终触发了扩布性抑制。右下图显示了一个典型的活化免疫细胞。

该成像首次证明，部分小胶质细胞以最优搜索模式进行长距离移动，如红色所示，称为莱维飞行，其运动模式与突触活动呈负相关。通过cDNA预扩增，可在海马脑片培养物中检测到干扰素-γ。最初，参考基因RPL13A的CT值为20.5，而干扰素-γ在左侧无法检测到。

然而，在右侧所示的预扩增后，IFN gamma 在 29.0 处可轻松检测到。RPL13A 的检测值为 14.1，表明信号扩增了 12 倍，其扩增效率的免疫组织化学验证结果如图所示。采用分化银增强的过氧化物酶二氨基联苯胺免疫染色法，对经 siRNA 处理的海马脑片培养物中亲环素 B 产生的显著减少进行定量分析，此方法一旦掌握即可应用。

本视频中概述的技术可在数天内完成。我们需要强调的是，我们的海马脑片培养物能够很好地模拟其体内对应环境，是研究免疫信号传导和扩布性抑制的理想模型。然而，必须在对照和假处理条件下维持免疫环境的静息状态。

为最大限度减少干扰性免疫激活，培养物必须在无菌条件下维持。应避免使其暴露于过度的化学、机械或热扰动中。由于生理性的细胞因子信号在飞摩尔水平发生，因此必须采用高灵敏度且可重复的测量技术。

我们采用PCRA技术以及高灵敏度的蛋白质组学技术。此外，细胞因子具有多效性和冗余性。因此，随时间多重检测细胞因子靶标有助于研究免疫信号如何调节对扩散性抑制的易感性，进而揭示偏头痛的机制。