高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

本实验的总体目标是可视化小鼠胎儿下泌尿生殖道组织发育过程中 mRNA 的表达模式。首先，通过从 PCR 扩增的模板合成地高辛标记的核糖探针来实现这一目标。实验的第二步是使用振动切片机制备较厚的组织切片。

第三步是在定制篮子中盛放的下泌尿生殖道切片上进行原位杂交。通过使用BM紫紫色沉淀性碱性磷酸酶底物对结合的核糖探针进行免疫组织化学检测，从而可视化mRNA。最终，显微镜可显示小鼠胎儿下泌尿生殖道中低丰度和高丰度mRNA转录本的空间和时间定位。

与现有的免疫组织化学等方法相比，该技术的主要优势在于，核糖探针易于制备，且可针对小鼠全基因组中绝大多数mRNA进行识别。尽管该方法可用于研究小鼠胎儿泌尿生殖系统发育过程中的mRNA表达模式，但同样适用于其他器官系统、物种以及发育阶段。对该方法进行可视化演示至关重要，因为将组织包埋于钻孔器中操作较难掌握，且方向上的微小偏差可能导致结果不一致。在准备组织前至少一天，从直径为12毫米的Milli细胞培养板上移除并丢弃膜，仅保留环形结构，该环将作为模具使用；将这些环在RNA酶抑制剂溶液中浸泡过夜。

在实验当天，取经梯度甲醇再水化的雄性小鼠下泌尿生殖道组织进行解剖。用 PBS-Tween 洗涤后，弃去约三分之二的膀胱组织，将剩余的下泌尿生殖道组织保存在 PBS-Tween 中。随后，将一个经处理的环形模具置于玻璃载玻片上，注入62摄氏度的4%低熔点琼脂糖溶液并填满模具，静置冷却约两分钟。

现在，将下泌尿生殖道组织进行封闭干燥，并浸入已配制的凝胶溶液中。使用镊子调整组织方向，使其悬浮于环状容器的顶部与底部之间的中点位置。在4°C条件下孵育，直至凝胶完全凝固。

在切片组织之前，先用溶剂冲洗定制的威尔金森刀片，随后用水冲洗。将双刃刀片沿长度方向分离成两个单刃刀片。接着，用显微切片机刀片支撑威尔金森刀片。

首先，将切片刀片裁剪至与威尔金森刀片相同的长度。然后使用乐泰（Loctite）粘合剂将切片刀片粘附在威尔金森刀片上，使其与切割刃偏移约三到四毫米。接着，将加固后的刀片安装到振动切片机上，并将刀片角度设置为35度。

通过向浴槽中加入 PBS 并在周围填充湿冰来准备豪华型标本浴。在将包埋在凝胶塞中的组织进行固定之前，先将其从环形模具中取出，并将底面吸干。然后使用乐泰胶水将干燥的表面粘附到固定盘上。

将切片插入振动切片机中，并将切片厚度调整为 50 微米，速度调整为 2，刀片振幅调整为 4。在切割组织切片时，使用钝头镊子将每一片切片转移至含有 0.5 毫升冰冻 PBS Tween 的 24 孔培养板中。切片完成后，在开始 INI 杂交前，使用弹簧剪刀去除每片组织切片周围的大部分琼脂糖。这些切片可在含有 2 毫摩尔叠氮化钠的 PBS Tween 中于 4 摄氏度保存最多 48 小时。

首先，在微量离心管的 100 微升刻度处剪去管底，制作定制样品篮。将剪下的管段在火焰上加热，直至塑料变软。然后将软化的塑料紧紧压在金属网片上。

静置使其硬化，并修剪多余的网状材料。使用加热的18号针头在每个管盖上穿刺两个孔，以完成篮子的制作。通过在24孔板的盖子上钻出24个等距分布的12毫米孔，制备用于放置样品篮的托盘。

每个孔在开始前应准确定位于24孔培养板的每孔上方，同时开始预热一个杂交室，其中加入半英寸自来水并加热至60.5摄氏度。通过向24孔培养板的每孔加入两毫升PBS吐温溶液，开始原位杂交反应。用已装好篮子的准备好的盖子盖住该培养板。

现在将组织切片在室温下转移至篮中，置于含吐温的 PBS 中加入 6% 过氧化氢，于摇床上孵育，随后用含吐温的 PBS 进行一系列洗涤，接着用蛋白酶 K 孵育，再进行一次固定，并进行更多次洗涤。为完成样本的制备，向每个孔中加入 2 毫升预热的预杂交缓冲液，并将培养板置于加热的杂交室中孵育至少 1 小时。通过向每个孔中加入 0.5 微克标记的 RIBA 探针，启动杂交反应。

然后将杂交盒置于加热杂交炉中过夜孵育。次日，用溶液一清洗组织，逐步更换为溶液二，然后用RNAs处理。接着用溶液三清洗，再依次用TBS吐温和组织封闭缓冲液洗涤，期间组织在组织封闭缓冲液中孵育。

在孵育结束后，将抗地高辛抗体加入抗体吸收缓冲液中，于4°C条件下至少孵育两小时。将抗体溶液在10,000 RPM下离心一分钟。为去除不溶物，向两毫升抗体溶液缓冲液中加入Senna。

现在将组织从封闭缓冲液中取出，放入已配制好的抗体溶液中孵育。在操作的第三天，于4°C条件下在杂交箱中孵育过夜。用TBST缓冲液多次洗涤组织。

然后使用玻璃巴斯德吸管，将组织小心转移至干净的微量离心管中。用一毫升 NTM 缓冲液清洗组织，振荡洗涤 10 分钟。

然后用含有火山岩底 MBM 紫色染料的 TMT 溶液替换原有溶液。将试管置于避光环境中，在接下来的数天内观察颜色发育情况，并根据需要更换溶液。待颜色完全发育后，用含有火山岩底的 TMT 溶液短暂清洗组织，随后在含对甲醛的 PBS 中于 4°C 下过夜孵育。

第二天用漂白剂漂白并清洗组织。切片现在可用于成像。下泌尿生殖道组织被包埋在琼脂中，使得尿道中线与琼脂塞的平面平行。

这种取向产生了矢状切面。定制的样品篮可保护精细的组织切片免受灰尘和颗粒物的污染。在为期多天的酵母双杂交实验过程中。

他们还防止了任何切片的丢失。在检测低丰度 mRNA 所需的长时间孵育过程中，限制背景染色具有挑战性。然而，添加叠氮化钠并随后进行过滤似乎有效降低了背景染色。

此外，当样本在显色液中孵育较长时间时，背景染色未出现明显差异。若操作得当，掌握该技术后可在六天内完成。在完成本实验步骤后，可进一步采用免疫组织化学等其他方法，以确定mRNA的表达模式是否与蛋白质的表达模式相关。

观看本视频后，您应能充分理解如何对 mRNA 表达模式以及小鼠下生殖道的发育过程进行可视化观察。