Name: 高通量原位杂交方法表征在胎鼠下泌尿生殖道的基因表达模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习高通量原位杂交技术用于可视化胎鼠下泌尿生殖道组织中的mRNA表达模式。该方法通过振动切片机和定制篮筐实现高效检测，可应用于发育生物学研究。

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作者谨此感谢新泽西癌症研究所的 Lan Yi 博士在制备组织篮过程中提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院基金 DK083425 和 DK070219 资助。

1. 从PCR生成的模板合成地高辛-11-UTP标记的核糖探针
<ol>
<li>为了合成基因特异性核糖探针，使用 Entrez Gene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）获取该基因的 cDNA 参考序列（RefSeq）。利用 Primer3 程序（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）5 针对 cDNA 序列的 3’ 区域设计基因特异性 PCR 引物。有关 PCR 引物选择的推荐参数，可参见其他文献（http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html）。</li>
<li>使用 MegaBLAST 程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090）6 评估所选 DNA 序列的特异性。当使用 0.01 的 EXPECT 阈值时，若该 DNA 序列在 RefSeq 数据库中不与其他序列比对，则认为其具有特异性。</li>
<li>通过 PCR 扩增核糖探针模板。PCR 反应组分和热循环条件应针对每对引物进行优化。一个典型的 50 μl 反应体系包含：1X 缓冲液、2 mM MgCl2、0.2 mM dNTPs、1X Q 溶液、1 μg cDNA、2.5 U Taq DNA 聚合酶、0.25 μM 引物以及无核酸酶水（nuclease-free H2O）。典型的热循环程序包括：94°C 初始变性 2 分钟，随后进行 40 个循环（94°C 变性 30 秒、57°C 退火 30 秒、72°C 延伸 1 分钟），最后在 72°C 延伸 10 分钟。PCR 反应中使用的 cDNA 是从小鼠泌尿生殖系统 mRNA 反转录合成的。</li>
<li>通过琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物，使用凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）进行纯化，并通过分光光度法测定纯化产物的浓度。预期产量为 1.2 – 3.6 μg。</li>
<li>将 PCR 产物转录为标记的核糖探针。转录反应体系（40 μl）包含：400 ng 纯化的 PCR 产物、1X 核苷酸标记混合物（含地高辛标记的 11-UTP）、1X 转录缓冲液、5 U RNase 抑制剂、80 U T7 RNA 聚合酶以及无核酸酶水（nuclease-free H2O）。在 37°C 下孵育 3–4 小时，每 30 分钟轻轻振荡样品一次。</li>
<li>使用 Qiagen RNeasy Mini 试剂盒，按照柱上 DNase 消化进行 RNA 纯化的说明纯化核糖探针。通过分光光度法定量核糖探针。预期产量为 4–20 μg。通过将部分样品在 1.5% 非变性琼脂糖凝胶上电泳分离，评估探针质量。高质量的探针应呈现清晰条带，无明显拖尾。</li>
<li>为确保核糖探针能特异性识别其靶标，在首次原位杂交（ISH）实验中应包含阳性对照组织。该阳性对照组织中，核糖探针所针对的 mRNA 表达模式应已知且明确。</li>
</ol>

2. 振动切片机刀片的制备（基于先前描述的方案）7
<ol>
<li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制4%的低熔点琼脂糖溶液。将溶液微波加热至琼脂糖完全溶解，并维持溶液温度在62°C。</li>
<li>通过从直径12 mm的Millicell培养板小室插入物上移除膜，制备一个聚苯乙烯环形模具，并保留聚苯乙烯环作为琼脂糖模具使用。每次使用前，将环状模具在RNase抑制剂溶液中浸泡过夜。</li>
<li>为确保切片表面光滑，使用以下纯溶剂依次冲洗Wilkinson刀片表面，以去除防锈剂及其他添加剂：石油醚、二甲苯、氯仿、甲醇和MilliQ水。将双刃刀片沿长度方向分离为两个单刃刀片。</li>
<li>使用Loctite胶水将Wilkinson刀片粘附于切片机刀片上。该切片机刀片不用于切割，仅用于增强Wilkinson刀片的刚性。应使用金属剪刀将切片机刀片裁剪至与Wilkinson刀片等长，粘合后使其边缘较Wilkinson刀片的切割刃错开3–4 mm。</li>
</ol>

3. 泌尿生殖组织的解剖、保存与切片制备
<ol>
<li>制备 PBSTw 溶液（含 0.1% Tween™ 20 和 0.2 mM 叠氮化钠的 PBS 溶液，经 0.22 μm Stericup® 滤器过滤）。该溶液可预先配制，并在 25°C 下保存。</li>
<li>将新鲜解剖的小鼠下泌尿道组织（膀胱、盆腔尿道以及相关的沃尔夫管和缪勒管来源结构）在含 4% 多聚甲醛固定液的 PBS 中，于 4°C 下孵育过夜。</li>
<li>通过在梯度浓度甲醇/PBSTw（1:3、1:1、3:1 v/v）溶液中于 25°C 洗涤 10 分钟进行组织脱水。将样品在 100% 甲醇中于 –20°C 至少保存过夜。存档组织可在 –20°C 保存至少 2 年。</li>
<li>通过梯度浓度甲醇/PBSTw（3:1、1:1、1:3 v/v）溶液在 25°C 下洗涤 10 分钟，对存档组织进行再水化，以备切片。</li>
<li>解剖并弃去约三分之二的膀胱组织，保留大部分三角区与尿道相连。</li>
</ol>


4. 在琼脂糖中包埋泌尿生殖组织
<ol>
<li>将聚苯乙烯环形模具平的一面朝下放置在 25°C 的普通玻璃显微镜载玻片上。</li>
<li>用 62°C 的琼脂糖溶液填充环形模具，并冷却约 2 分钟。</li>
<li>从 PBSTw 中取出 LUT 组织，并用吸水纸轻轻吸干。</li>
<li>将组织转移至琼脂糖溶液中。</li>
<li>使用镊子调整 LUT 组织在琼脂糖中的方向，使其悬浮于环形模具顶部与底部之间的中间位置，并在 4°C 下孵育，直至琼脂糖完全凝固。</li>
<li>若在琼脂糖凝固过程中组织完全下沉，可将其从琼脂糖中切出并重新包埋；在重新包埋过程中，可根据需要调整琼脂糖的冷却时间。</li>
</ol>

5. 使用振动切片机对泌尿生殖组织进行切片（基于先前描述的方案）7
<ol>
<li>将加强型Wilkinson刀片安装到振动切片机上，并将刀片角度设置为 35°将PBS加入豪华型标本浴槽中，并在浴槽周围放置湿冰。</li>
<li>从环形模具中取出凝固的琼脂糖凝胶块，并用吸水纸擦拭其底面。确认组织方向正确。若需调整组织方向，可用剃刀刀片对琼脂糖凝胶块的平直边缘进行斜切以校正方向。</li>
<li>将琼脂糖凝胶块用Loctite胶水粘附到振动切片机样品安装盘上，如图所示 图 1A.</li>
<li>将样本固定盘插入振动切片机中。</li> 
<li>调节切片机切片厚度至 50μm，将速度调至2，刀片振幅调至4，开始切片。</li>
<li>使用钝头镊子转移每一片组织切片（图 1B) 加入含有 0.5 mL 冰冷 PBSTw 的 24 孔细胞培养板孔中。</li>
<li>为准备样品 原位 杂交后，切去每个组织切片周围的大部分琼脂糖（剩余的琼脂糖将在原位杂交过程中融化），并清除所有相关碎片。切片可在48小时内储存 4°C 在 PBSTw 中。</li>
</ol>
6. 样品篮制备 原位 杂交
<ol>
<li>在微量离心管的100μL刻度处剪去管底。</li>
<li>将剪切后的管边缘置于火焰中加热，直至塑料软化，然后将微量离心管牢固地压在一块直径0.5英寸的聚酯网片中心。</li>
<li>修剪多余的网片，并使用加热的18号针头在每个管盖上穿刺两个孔，以完成篮式装置的制备（图1C）。</li>
<li>取下24孔板的盖子，并在每孔正上方中心位置钻一个直径12mm的孔。在原位杂交（ISH）实验流程的洗涤步骤之间，使用该盖子转移样品篮（图1D）。</li>
</ol>
7. 胚胎粉末制备 原位 杂交（基于先前描述的方案）8
<ol>
<li>采集与待检测组织切片相同发育阶段的小鼠胚胎组织，于 –80°C 保存。将冷冻组织放入陶瓷研钵中，浸入液氮，用研杵研磨成细粉。</li>
<li>将胚胎粉末与 4 倍体积的丙酮混合，使用玻璃匀浆器（Dounce 匀浆器）反复匀浆数次。</li>
<li>将匀浆液转移至 15 mL 玻璃螺口瓶中，于 4°C 过夜提取。</li>
<li>在 4°C 下以 5000 rpm 离心 10 分钟，沉淀胚胎粉末。移除并弃去含脂质的上清液。将组织沉淀用 4 倍体积的新鲜丙酮重悬，并于 4°C 提取 2 小时。</li>
<li>在 4°C 下以 5000 rpm 离心 10 分钟，再次沉淀胚胎粉末。移除并弃去上清液。</li>
<li>将沉淀物置于 #2 Whatman 滤纸上空气干燥。研碎沉淀物以获得细粉，置于密封良好的玻璃瓶中，4°C 保存。每克胚胎湿重可获得约 50 mg 粉末。</li>
</ol>

8. 原位 杂交第一天
<ol>
<li>将预杂交液（50% 甲酰胺、5x SSC、1% 封闭试剂、10μg/mL 酵母 tRNA、10μg/mL 肝素，储存于 -20°C）预热至 60.5°C。该溶液可预先配制并储存于 -20°C。</li>
<li>通过在小型塑料储存容器中加入约 0.5 英寸的自来水，制备加湿的杂交室。盖上容器并预热至 60.5°C。</li>
<li>向 24 孔培养板的孔中加入 2mL PBSTw。将样品篮置于 24 孔板盖的孔洞中，并将组织切片转移至篮中（每个篮中最多可放置 10 片切片）。</li>
<li>在含 6% H2O2 的溶液中，25°C 下孵育组织切片 30 分钟。此步骤及后续所有孵育步骤均应在旋转摇床上轻柔振荡进行，除非另有说明。所有孵育和洗涤均在 24 孔板中进行，每孔使用总体积为 2mL 的溶液。</li>
<li>用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。</li>
<li>在含 5μg/mL 蛋白酶 K 的 PBSTw 中，25°C 下孵育组织切片 12 分钟。</li>
<li>用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片 1 次，每次 5 分钟。</li>
<li>在含 4% 多聚甲醛和 0.2% 戊二醛的 PBS 中，25°C 下对组织切片进行后固定 20 分钟。</li>
<li>用 PBSTw 在 25°C 下洗涤组织切片 2 次，每次 5 分钟。</li>
<li>每孔加入 2mL 预热的预杂交缓冲液，并将组织切片置于加湿的杂交室中，在 60.5°C 下孵育至少 1 小时。</li>
<li>在每孔的预杂交缓冲液中加入 0.65μg 标记的核糖探针，并将组织切片在加湿的杂交室中于 60.5°C 下过夜孵育。</li>
</ol>
9. 原位 杂交第2天
<ol>
<li>准备以下用于杂交后洗涤步骤的溶液：溶液 1（50% 甲酰胺，5× SSC，1% SDS）、溶液 2（10 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5 M NaCl，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤过）和溶液 3（2× SSC，50% 甲酰胺）。这些溶液可预先配制。溶液 1 和溶液 3 储存于 -20°C，溶液 2 储存于 25°C。溶液储存寿命至少为 3 个月。</li>
<li>用预热的溶液 1 在 60.5°C 下对组织切片进行 3 次，每次 30 分钟的洗涤。洗涤过程中使用加湿孵育盒。</li>
<li>用预热的溶液 1 与溶液 2 按体积比 1:1 混合的溶液在 60.5°C 下对组织切片进行 1 次 10 分钟的洗涤。洗涤过程中使用加湿孵育盒。</li>
<li>用溶液 2 在 25°C 下对组织切片进行 4 次，每次 10 分钟的洗涤。</li>
<li>在含 0.25 μg/mL RNase 的溶液 2 中，于 37°C 孵育组织切片 15 分钟。</li>
<li>用不含 RNase 的溶液 2 在 25°C 下对组织切片进行 1 次 10 分钟的洗涤。</li>
<li>用溶液 3 在 25°C 下对组织切片进行 1 次 10 分钟的洗涤，随后在 60.5°C 下用溶液 3 进行 2 次，每次 1 小时的洗涤。60.5°C 洗涤过程中使用加湿孵育盒。</li>
<li>准备以下用于 DIG 标记的核糖探针免疫组织化学检测的溶液：组织封闭缓冲液（TB，1× TBS，10% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，0.1% Tween™ 20，0.22 μm 滤过）、抗体稀释缓冲液（AD，1× TBS，5% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤过）、抗体吸附缓冲液（AA，1× TBS，5% 羊血清，1% 封闭试剂，1% BSA，6 mg/mL 胚胎粉）和 TBSTw（1× TBS，0.1% Tween™ 20，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤过）。这些溶液可预先配制。TBSTw 储存于 25°C，其余所有溶液均储存于 -20°C。</li>
<li>用 TBSTw 在 25°C 下洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
<li>将组织切片在 TB 缓冲液中于 25°C 孵育至少 2 小时。</li>
<li>在组织切片于 TB 缓冲液中孵育的同时，每 200 μL AA 缓冲液中加入 1.1 μL 抗 DIG 抗体。将 AA 缓冲液加抗体混合物于 4°C 孵育至少 2 小时，然后以 10,000 rpm 离心 1 分钟。弃去上清液，将上清液转移至 2 mL AD 缓冲液中。</li>
<li>将组织切片从 TB 缓冲液中取出，置于含抗体的 AD 缓冲液中，在加湿孵育盒中于 4°C 过夜孵育。</li>
</ol>
10. 原位 杂交第3天
<ol>
<li>配制显色液 NTMT（100 mM Tris-HCl pH 9.5，100 mM NaCl，50 mM MgCl2，0.2 mM 叠氮化钠，0.22 μm 滤膜过滤）。该溶液可预先配制，并在 25°C 下保存。使用前立即加入 2 mM 左旋咪唑和 0.1% Tween™ 20。</li>
<li>从孔中移除抗体溶液（AD 缓冲液 + 抗体），并将溶液储存于 4°C。该溶液最多可重复使用两次。</li>
<li>在含 2 mM 左旋咪唑的 TBSTw 中，于 25°C 下洗涤组织 8 次，每次 10 分钟。</li>
<li>小心将组织从篮子中转移至含有 TBSTw 的培养皿中。用镊子去除可见杂质，再将组织转移至洁净的微量离心管中。</li>
<li>用 1 mL NTMT 在 25°C 下洗涤组织一次，持续 10 分钟。</li>
<li>吸除 NTMT，每管加入 1 mL 含 50% NTMT（含 2 mM 左旋咪唑）和 50% BM Purple 的混合液，将离心管置于避光盒中，于 25°C 孵育。显色时间从数小时至数天不等。若显色缓慢，可使用 100% BM Purple。</li>
<li>监测显色进程，若溶液中出现沉淀晶体或颜色由黄色变为紫色，则更换 NTMT/BM Purple 溶液。完全显色后（4–250 小时），用每管 1 mL 含 2 mM 左旋咪唑的 NTMT 在 25°C 下洗涤组织 2 次，每次 5 分钟。</li>
<li>在含 4% 多聚甲醛后固定液的 PBS 中，每管加入 1 mL，于 4°C 过夜孵育组织。</li>
<li>为漂白组织，将组织在含 3% H2O2 的 PBSTw 中，每管加入 1 mL，于 25°C 孵育 30 分钟。然后在含 1 mL PBSTw 的离心管中，于 25°C 洗涤组织一次，持续 10 分钟，并将组织储存在含 4% 多聚甲醛后固定液的 PBS 中，每管 1 mL，于 4°C 保存。</li>
<li>将组织切片封片于载玻片上，加盖盖玻片，使用复式显微镜成像。</li>
</ol>

11. 代表性结果：
LUT 组织在琼脂糖中的空间方向决定了组织切片的切面。对于矢状切面，需切除至少三分之二的膀胱，将剩余的 LUT 组织包埋于琼脂糖中，使尿道中线与琼脂糖块的平坦表面平行（图 1A）。可通过倾斜琼脂糖块的平坦边缘对组织切面进行微调。图 1B 展示了按此方向定位的 17.5 天胚胎期（17.5dpc）雄性 LUT 组织的一个代表性矢状切面。
在为期多天的原位杂交（ISH）实验过程中，样本篮可保护精细的组织切片，避免样本丢失以及灰尘和颗粒物的沉积。图1C 所示，通过将聚酯网膜熔接到1.5 mL 微离心管的切口端制备样本篮。每个样本篮的管盖上均穿刺一个小孔，以促进溶液流入和流出样本篮。将样本篮置于经改造的24孔板盖上所钻的12 mm 孔中，使其悬浮于ISH溶液中（图1D）。在更换溶液并转移样本篮至不同24孔板时，经改造的板盖可提供支撑。
在检测低丰度 mRNA 所需的长时间孵育过程中，限制非特异性背景染色具有挑战性。在样本缓冲液中添加 0.2 mM 叠氮化钠，并随后通过 0.22 μm 滤器过滤，似乎能够降低背景染色（图 2）。采用本文所述方法，在显色发育溶液中长时间孵育样本时，背景染色未出现明显可见的差异（图 3）。
<img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig1.jpg" alt="静态平衡；含培养皿、移液器吸头和试管架的装置；实验示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1. 小鼠下泌尿生殖道（LUT）组织切片及用于原位杂交（ISH）的微量离心管篮的制备。包含部分膀胱、盆腔尿道以及来源于沃尔夫管和缪勒管结构的LUT组织被包埋于圆柱形的4%低熔点琼脂糖凝胶中。（A）将凝胶块粘附于样品固定盘上，并（B）使用振动切片机切成50 μm厚的切片。（C）将LUT组织切片转移至微量离心管篮中，该管篮通过在管盖上打孔，并将聚酯网膜固定于管底切割端制备而成。（D）将微量离心管插入24孔板盖上钻出的12 mm孔中，以便在ISH实验过程中使组织切片悬浮于缓冲液中。箭头指示琼脂糖凝胶块中的LUT组织位置。
<img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig2.jpg" alt="组织切片的组织学比较；A：过滤的 NaAz 缓冲液，B：未过滤的，箭头指示变化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 加入0.2 mM叠氮化钠 0.22μm 过滤后的溶液可提高组织质量并减少背景染色。17.5天孕龄（dpc）雄性小鼠下泌尿生殖道（LUTs）沿矢状面切片，厚度为 50μm组织切片采用针对 twist 同源物 1 的探针通过原位杂交（ISH）进行染色。ISH 实验中使用的缓冲液为 (A) 0.22μm 过滤并添加0.2 mM叠氮化钠（NaAz），或（B）未过滤且未添加NaAz。箭头指示背景染色。图像以相同放大倍数拍摄。结果为代表性的染色模式 n = 3 只与胎次无关的小鼠
<img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig3.jpg" alt="原位杂交结果；Esrrg、Baz2a、Wnt10a 基因表达；示意图；胚胎发育" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 背景染色强度似乎不会随着显色时间的延长而增强。17.5天孕龄雄性小鼠的下泌尿生殖道（LUTs）被切成矢状面切片，厚度为 50μm. 采用原位杂交（ISH）对切片进行染色，使用识别高丰度转录本雌激素相关受体γ（estrogen-related receptor gamma）的探针，在（A）9.5小时的显色染色液孵育条件下进行染色Esrrg使用可识别中等丰度转录本溴结构域邻近锌指结构域 2A 的探针Baz2a)，或使用识别低丰度转录本wingless-type MMTV整合位点家族成员10a（Wnt10a）的探针处理236小时（C）Wnt10a）。图像在相同的放大倍数下采集。结果为代表性的染色模式 n = 3 只与胎次无关的小鼠

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
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<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

采用此处描述的方法，可以在胎鼠泌尿生殖道（LUT）的所有主要细胞类型和组织区室中检测mRNA，包括间充质垫、尿路上皮、平滑肌、前列腺芽、射精管以及阴道。本方案使用的50μm切片具有以下优势：厚度足以分辨组织结构（如血管），同时又足够薄以避免探针滞留，而探针滞留是整体原位杂交（whole-mount ISH）中常见的方法学问题。每种新合成的核糖探针都会在阳性对照组织上进行评估，这些组织的染色结果已在先前发表的研究中得到验证。我们确保在这些组织中观察到的染色模式具有特异性。本方法的另一优势在于，可对同一LUT组织的相邻切片进行多种mRNA表达模式的分析。此外，该方法可与免疫组织化学技术联用，以可视化特定细胞的蛋白标志物，并识别原位杂交（ISH）染色所标记的细胞类型。该方法不适用于传统的复染方法，例如使用Fast Red或苏木精进行细胞核复染。然而，我们已成功使用荧光细胞核染料对样本进行复染，包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和碘化丙啶（propidium iodide）。
本文所述方法相较于先前描述的方法7有多项改进。当前文稿中几乎所有缓冲液和试剂储备...

<table><tbody><tr><td>抗地高辛抗体，Fab 片段</td><td>罗氏集团</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>封闭剂</td><td>罗氏集团</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM 紫色 AP 底物，沉淀型</td><td>罗氏集团</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>地高辛-11-UTP</td><td>罗氏集团</td><td>1277073910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>罗氏集团</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>双面剃须刀片</td><td>Wilkinson Sword</td><td>经典模型</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase RNase 去除剂</td><td>Decon Laboratories</td><td>1102</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5786-1L</td><td></td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛，25% 水溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢，30% 水溶液&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 快干瞬干胶</td><td>Henkel Corp</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>马来酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375-500G</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Biologix 研究公司</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Millicell 培养板插件</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>分子研磨树脂</td><td>G-Biosciences</td><td>786-138PR</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液溶液</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，不含 Ca &amp;& Mg</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN1760420</td><td></td></tr><tr><td>聚酯网，33 微米，12&quot;&amp;#157; × 24&quot;&amp;#157;</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMY-0033-D</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K溶液，20 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E195-5ML</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder 离心柱</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Q溶液</td><td>Qiagen</td><td>提供Taq DNA聚合酶</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>罗氏集团</td><td>03335399001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 无RN酶的DNase</td><td>Promega Corp.</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque 低熔点琼脂糖</td><td>Lonza Inc.</td><td>50101</td><td></td></tr><tr><td>羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 滤器，0.22&amp;mu;米，聚醚砜，500毫升</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠，颗粒状</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227I-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S529-500</td><td></td></tr><tr><td>SSC，20倍浓度溶液</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S24022-4000.0</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 第一链合成系统</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶</td><td>罗氏集团</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>配备豪华型标本槽的振动切片机</td><td>徕卡显微系统</td><td>VT1000A</td><td></td></tr><tr><td>酵母tRNA</td><td>罗氏集团</td><td>109495</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mrna表达模式的杂交方法

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

下泌尿生殖道（LUT）的发育是一个复杂的过程。在雄性胎儿尿道形成前列腺的过程中，这种复杂性尤为明显，该过程依赖于雄激素信号以及上皮-间质间的相互作用1,2。了解调控前列腺发育的分子机制，可能揭示在生命后期被异常重新激活的生长机制，从而导致良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的发生。
发育中的泌尿生殖窦（LUT）具有复杂的解剖结构。当前列腺芽体在受孕后16.5天（dpc）开始形成时，已存在多种细胞类型。血管、神经和平滑肌位于间质性间充质中3。该间质包裹着多层上皮，并通过雄激素受体依赖的旁分泌信号诱导胎儿前列腺的形成4。目前尚不完全清楚在前列腺发育过程中，间质中哪些雄激素受体响应基因是必需的，以及前列腺导管上皮如何响应这些基因而形成。精确识别细胞类型并定位其中特定因子的表达，对于进一步理解前列腺发育至关重要。原位杂交（ISH）技术可实现mRNA在组织内的定位。因此，该方法可用于确定信号分子及其受体的表达模式与时间，从而揭示潜在的前列腺发育调控因子。
本文介绍了一种高通量原位杂交（ISH）技术，用于鉴定胎鼠下泌尿生殖道（LUT）中mRNA的表达模式，所用组织切片由振动切片机切割而成。该方法相较于其他ISH方案具有多项优势。在载玻片上进行薄切片ISH在技术上较为困难；冷冻切片常存在组织结构质量差的问题，而冷冻切片和石蜡切片均常导致信号分辨率较弱。对整体组织进行ISH则可能导致探针滞留。相比之下，我们的高通量技术采用厚切片，可清晰显示组织精细结构。经改良的微量离心管便于在ISH过程中对切片进行操作。单个17.5天胎龄（dpc）LUT样本最多可同时筛查4种mRNA转录本，单次实验最多可检测24种mRNA转录本，从而降低成本并提高效率。该方法允许将多个处理组以完全相同的方式作为单一整体进行处理，避免数据分析中的偏差。对于前列腺研究者而言尤为关键的是，该方法可提供胎鼠尿道中低丰度和高丰度mRNA转录本在空间和时间上的精确定位，而尿道正是前列腺导管网络的发育起源。

在此，我们描述一种高效的高通量方法 原位 原位杂交（ISH）方法用于可视化小鼠胎儿前列腺组织切片中mRNA表达的模式。该方法可轻松适用于可视化其他小鼠组织或其他物种组织中mRNA的表达模式。

高通量 原位 用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

下尿路（LUT）的发育是一个复杂的过程。这种复杂性在胎儿男性前列腺形成过程中表现得尤为明显……

本实验的总体目标是可视化小鼠胎儿下泌尿生殖道组织发育过程中 mRNA 的表达模式。首先，通过从 PCR 扩增的模板合成地高辛标记的核糖探针来实现这一目标。实验的第二步是使用振动切片机制备较厚的组织切片。第三步是在定制篮子中盛放的下泌尿生殖道切片上进行原位杂交。通过使用BM紫紫色沉淀性碱性磷酸酶底物对结合的核糖探针进行免疫组织化学检测，从而可视化mRNA。最终，显微镜可显示小鼠胎儿下泌尿生殖道中低丰度和高丰度mRNA转录本的空间和时间定位。与现有的免疫组织化学等方法相比，该技术的主要优势在于，核糖探针易于制备，且可针对小鼠全基因组中绝大多数mRNA进行识别。尽管该方法可用于研究小鼠胎儿泌尿生殖系统发育过程中的mRNA表达模式，但同样适用于其他器官系统、物种以及发育阶段。对该方法进行可视化演示至关重要，因为将组织包埋于钻孔器中操作较难掌握，且方向上的微小偏差可能导致结果不一致。在准备组织前至少一天，从直径为12毫米的Milli细胞培养板上移除并丢弃膜，仅保留环形结构，该环将作为模具使用；将这些环在RNA酶抑制剂溶液中浸泡过夜。在实验当天，取经梯度甲醇再水化的雄性小鼠下泌尿生殖道组织进行解剖。用 PBS-Tween 洗涤后，弃去约三分之二的膀胱组织，将剩余的下泌尿生殖道组织保存在 PBS-Tween 中。随后，将一个经处理的环形模具置于玻璃载玻片上，注入62摄氏度的4%低熔点琼脂糖溶液并填满模具，静置冷却约两分钟。现在，将下泌尿生殖道组织进行封闭干燥，并浸入已配制的凝胶溶液中。使用镊子调整组织方向，使其悬浮于环状容器的顶部与底部之间的中点位置。在4°C条件下孵育，直至凝胶完全凝固。在切片组织之前，先用溶剂冲洗定制的威尔金森刀片，随后用水冲洗。将双刃刀片沿长度方向分离成两个单刃刀片。接着，用显微切片机刀片支撑威尔金森刀片。首先，将切片刀片裁剪至与威尔金森刀片相同的长度。然后使用乐泰（Loctite）粘合剂将切片刀片粘附在威尔金森刀片上，使其与切割刃偏移约三到四毫米。接着，将加固后的刀片安装到振动切片机上，并将刀片角度设置为35度。通过向浴槽中加入 PBS 并在周围填充湿冰来准备豪华型标本浴。在将包埋在凝胶塞中的组织进行固定之前，先将其从环形模具中取出，并将底面吸干。然后使用乐泰胶水将干燥的表面粘附到固定盘上。将切片插入振动切片机中，并将切片厚度调整为 50 微米，速度调整为 2，刀片振幅调整为 4。在切割组织切片时，使用钝头镊子将每一片切片转移至含有 0.5 毫升冰冻 PBS Tween 的 24 孔培养板中。切片完成后，在开始 INI 杂交前，使用弹簧剪刀去除每片组织切片周围的大部分琼脂糖。这些切片可在含有 2 毫摩尔叠氮化钠的 PBS Tween 中于 4 摄氏度保存最多 48 小时。首先，在微量离心管的 100 微升刻度处剪去管底，制作定制样品篮。将剪下的管段在火焰上加热，直至塑料变软。然后将软化的塑料紧紧压在金属网片上。静置使其硬化，并修剪多余的网状材料。使用加热的18号针头在每个管盖上穿刺两个孔，以完成篮子的制作。通过在24孔板的盖子上钻出24个等距分布的12毫米孔，制备用于放置样品篮的托盘。每个孔在开始前应准确定位于24孔培养板的每孔上方，同时开始预热一个杂交室，其中加入半英寸自来水并加热至60.5摄氏度。通过向24孔培养板的每孔加入两毫升PBS吐温溶液，开始原位杂交反应。用已装好篮子的准备好的盖子盖住该培养板。现在将组织切片在室温下转移至篮中，置于含吐温的 PBS 中加入 6% 过氧化氢，于摇床上孵育，随后用含吐温的 PBS 进行一系列洗涤，接着用蛋白酶 K 孵育，再进行一次固定，并进行更多次洗涤。为完成样本的制备，向每个孔中加入 2 毫升预热的预杂交缓冲液，并将培养板置于加热的杂交室中孵育至少 1 小时。通过向每个孔中加入 0.5 微克标记的 RIBA 探针，启动杂交反应。然后将杂交盒置于加热杂交炉中过夜孵育。次日，用溶液一清洗组织，逐步更换为溶液二，然后用RNAs处理。接着用溶液三清洗，再依次用TBS吐温和组织封闭缓冲液洗涤，期间组织在组织封闭缓冲液中孵育。在孵育结束后，将抗地高辛抗体加入抗体吸收缓冲液中，于4°C条件下至少孵育两小时。将抗体溶液在10,000 RPM下离心一分钟。为去除不溶物，向两毫升抗体溶液缓冲液中加入Senna。现在将组织从封闭缓冲液中取出，放入已配制好的抗体溶液中孵育。在操作的第三天，于4°C条件下在杂交箱中孵育过夜。用TBST缓冲液多次洗涤组织。然后使用玻璃巴斯德吸管，将组织小心转移至干净的微量离心管中。用一毫升 NTM 缓冲液清洗组织，振荡洗涤 10 分钟。然后用含有火山岩底 MBM 紫色染料的 TMT 溶液替换原有溶液。将试管置于避光环境中，在接下来的数天内观察颜色发育情况，并根据需要更换溶液。待颜色完全发育后，用含有火山岩底的 TMT 溶液短暂清洗组织，随后在含对甲醛的 PBS 中于 4°C 下过夜孵育。第二天用漂白剂漂白并清洗组织。切片现在可用于成像。下泌尿生殖道组织被包埋在琼脂中，使得尿道中线与琼脂塞的平面平行。这种取向产生了矢状切面。定制的样品篮可保护精细的组织切片免受灰尘和颗粒物的污染。在为期多天的酵母双杂交实验过程中。他们还防止了任何切片的丢失。在检测低丰度 mRNA 所需的长时间孵育过程中，限制背景染色具有挑战性。然而，添加叠氮化钠并随后进行过滤似乎有效降低了背景染色。此外，当样本在显色液中孵育较长时间时，背景染色未出现明显差异。若操作得当，掌握该技术后可在六天内完成。在完成本实验步骤后，可进一步采用免疫组织化学等其他方法，以确定mRNA的表达模式是否与蛋白质的表达模式相关。观看本视频后，您应能充分理解如何对 mRNA 表达模式以及小鼠下生殖道的发育过程进行可视化观察。

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Research

科研

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Biology

生物学

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高通量原位用于表征小鼠胎儿下泌尿生殖道中mRNA表达模式的杂交方法

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