一个 体外 研究肿瘤休眠及其向转移性生长转换的系统

以下实验的总体目标是利用以下体外检测方法对肿瘤休眠状态或向转移性生长的转变进行建模，从而以实时、高通量的方式观察潜在药物对肿瘤细胞休眠状态或从休眠状态复苏的影响。该目标首先通过在适配于96孔板平台的三维培养基底膜提取物（BME）系统中培养休眠或转移性肿瘤细胞来实现。当在三维系统中培养时，转移性细胞会进入一个短暂的、休眠或静止的阶段。

相比之下，体内处于休眠状态的肿瘤细胞会进入长期的静止状态。在三维培养系统中，可对转移性细胞施加候选药物，以阻止其从静止状态转变为增殖状态；而处于休眠状态的肿瘤细胞则可接受候选药物处理，以诱导其从静止状态向增殖状态转变。

在预定时间点加入Cell Titer 96 Aqueous One Solution细胞增殖检测试剂盒，通过ELIZA酶标仪分析处理后静息状态及转移性细胞的增殖行为。根据3D系统中的细胞增殖实验，获得处理对静息或转移性肿瘤细胞增殖影响的结果。该方法有助于回答转移研究领域中的关键问题，例如哪些因素和细胞机制维持播散性肿瘤细胞处于静息状态，以及哪些因素和细胞机制诱导肿瘤静息向临床转移的转变。

在进行增殖实验的前一天，将含Qualtrics生长因子的BME于4°C冰箱中过夜孵育。然后在实验当天，选择休眠状态或转移性肿瘤细胞培养物用于实验。接着，将96孔板放置于生物安全柜或通风橱内的冰盘上。

然后使用带有注射器的分配器，向每孔加入50 µL解冻后的冰上预冷的BME，使96孔板各孔包被BME。注意避免孔中产生气泡。将包被了BME的96孔板置于含5% CO₂、37 °C的湿润化培养箱中孵育30分钟。在BME包被板孵育的同时，将一瓶胰蛋白酶置于37 °C环境中预热。

吸去肿瘤细胞中的培养基。用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养板。然后吸去PBS，并向培养板中加入2毫升预热的胰蛋白酶。

将培养板孵育五分钟。在15毫升锥形管中加入5毫升DMEM高糖培养基，添加10% FCS和抗生素。在此期间。

孵育结束后，将脱离的细胞转移至15毫升离心管中并计数。然后在室温下，以1500 ×g 的速度在组织培养离心机中离心5分钟，沉淀待培养的总细胞数。小心吸除上清液。

留下部分培养基，因为在大多数情况下沉淀不可见。然后轻弹管底，确保获得单细胞悬液。接着，每2×10³个细胞用100 µL检测培养基重悬沉淀。

用5毫升移液管反复吹打细胞悬液多次，以确保维持单细胞悬液状态。将每孔100微升细胞悬液接种至96孔BME包被板中用于对照背景去评估板，另向96孔BME包被板中仅少数孔每孔加入100微升培养基。随后将培养板放入培养箱中孵育，并每隔四天吸除旧培养基，更换新鲜的检测培养基。

为评估细胞增殖，于预期的实验时间点，向每块待分析的96孔板的每个孔中加入20 µL细胞增殖检测试剂盒中的Cell Titer 96 Aqueous One Solution。将培养板孵育2小时。然后使用ELISA酶标仪记录实验孔和背景孔在490 nm处的吸光度，为免疫荧光分析做准备。

在染色前一天，将基底膜提取物（BME）置于4°C冰箱中过夜解冻。染色当天，将八孔玻璃载片系统放置于生物安全柜或通风橱内的冰盘上。随后，使用200微升移液器将50微升预冷的BME均匀涂布于玻璃载片系统的每个孔中。

确保BME均匀分布，且孔中无气泡产生。将包被好的载玻片孵育20分钟。选择一种处于静息状态或转移性肿瘤细胞系。

使用胰蛋白酶消化收获细胞，操作步骤如前所述。然后将待培养的全部细胞收集至一个15毫升的锥形离心管中。接着离心沉淀细胞，小心吸除上清液，注意留少量培养基。

轻弹15毫升锥形管底部，使沉淀重悬，获得单细胞悬液。每5 × 10³个细胞用400微升检测培养基重悬沉淀。使用5毫升移液器反复吹打细胞多次，确保维持单细胞悬液状态，然后将每孔400微升细胞悬液接种至8个BME包被的培养室中。

随后孵育玻片系统，在预定的实验时间点每四天吸除旧的培养基，并更换为新的检测培养基。吸去培养基的上层液体，加入200 µL含有Triton的固定液，室温孵育5分钟。然后吸去含Triton的固定液，仅加入200 µL固定液，室温再孵育25分钟。

再次吸去固定液，然后每孔加入 400 µL PBS。在室温下继续孵育 10 分钟。随后吸去 PBS，每孔加入含 0.05%（介于 20 与之间）的 PBS 400 µL，并再孵育 10 分钟。

同样在室温下进行。现在用200微升封闭液对固定后的细胞进行封闭。然后在室温下孵育细胞1小时。孵育结束后，吸去封闭液，并向每孔加入200微升用封闭液稀释的一抗。

将载玻片在4°C条件下与一抗孵育过夜，次日进行后续操作。吸除一抗溶液，随后用400 µL PBS洗涤3次，每次15分钟，每次洗涤后均需吸除溶液。最后一次洗涤吸除PBS后，每孔加入200 µL与罗丹明红偶联的二抗。

然后用铝箔覆盖八孔载玻片系统，并在室温下孵育一小时。接着，用 PBS 洗涤各孔三次，方法同前；第三次洗涤后，将载玻片置于防荧光淬灭封片剂中封片。

最后将载玻片置于避光条件下室温干燥40分钟。此处展示的是在三维培养中对静息态D 2.0 R细胞和转移性D two A one肿瘤细胞进行增殖分析的一个示例。D 2.0 R细胞在整个为期14天的实验培养期间均保持静息状态，而高转移性的D two A one细胞仅在培养的最初4至6天内保持静息，随后即在初始静息阶段之后开始增殖。

许多细胞在三维培养中保持单细胞状态，如本图所示的第4天培养的代表性照片所示，而其他非增殖性细胞则形成多细胞类固醇结构。D2A1细胞在三维培养中从静息状态向增殖状态的转变如本图所示的第12天培养照片所示，该过程伴随着细胞形态的显著变化。

一个防止 D2A1 细胞从静息状态转变为增殖状态的示例，如使用特异性肌球蛋白轻链激酶抑制剂处理 D2A1 细胞所示。如本图所示，将 D2A1 细胞维持在静息状态。在 D2A1 细胞从静息期第 1 天到第 4 天向增殖期过渡过程中，肌球蛋白轻链的磷酸化水平显著升高（以红色显示），随后发生 F-肌动蛋白丝的重组，形成绿色的肌动蛋白应力纤维。

第七天。然而，通过SHRA或药物ML-7抑制D2A1细胞中肌球蛋白轻链激酶的活性，可使D2A1细胞保持在静息状态，并抑制肌球蛋白轻链的磷酸化、F-肌动蛋白（F actin）以及应力纤维的形成，如图所示。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立体外模型系统，以研究肿瘤的静息状态及其向转移性生长的转变过程。