Name: 一个系统来研究肿瘤休眠和转移性增长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 了解三维体外肿瘤休眠与转移性增殖模型系统。该方法利用基底膜提取物培养肿瘤细胞，实现实时高通量筛选调控休眠与增殖的候选药物，为研究转移机制提供平台。

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本研究部分得到了美国国家癌症研究所院内研究计划的资助。

1. 休眠及转移性肿瘤细胞系的细胞培养维持
<ol>
 <li>在含有高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、10% 胎牛血清（FBS）和抗生素的 10 cm 培养皿中培养休眠期肿瘤细胞（D2OR/MCF7/K7M2-AS.46）和转移性肿瘤细胞（D2A1/MDA-MB-231/K7M2）。当细胞融合度达到 70–80% 时，进行以下实验分析。</li>
</ol>
2. 在3D-BME系统中培养的静息（休眠）和转移性（增殖）肿瘤细胞的细胞增殖检测
在三维系统中培养休眠/转移细胞
<ol>
 <li>在进行实验前一晚，将 Cultrex 去除生长因子的基底膜提取物（BME）置于 4°C 冰箱中解冻。注意：BME 始终需在冰上操作。</li>
 <li>次日，在超净台内的冰盘上放置一块 96 孔板。使用带注射器的分配器，向每孔加入 50–100 μl 冰冷的 BME 进行包被。确保孔内无气泡产生。将包被有 BME 的 96 孔板置于 37°C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 30 分钟。</li>
 <li>与此同时，吸除静止或转移性肿瘤细胞（按第 1 节制备）的培养基。用 10 ml pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养皿。吸除 PBS 后，向培养皿中加入 2 ml 预热至 37°C 的胰蛋白酶。将培养皿置于 37°C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 5 分钟。</li>
 <li>将细胞转移至含有 5 ml 添加 10% 胎牛血清（FCS）和抗生素的高糖 DMEM 培养基的 15 ml 圆锥形离心管中，并对细胞进行计数。</li>
 <li>在室温下，以 1500g 的转速在组织培养离心机中离心沉淀所需培养的总细胞数，离心 5 分钟。在我们的实验中，每种细胞系或时间点每孔接种 2×103 个细胞。然而，具体数量可能因所用细胞系不同而有所调整。</li>
 <li>小心吸除上清液。注意：大多数情况下沉淀不可见，因此应保留少量上清液。用手指轻弹 15 ml 圆锥形离心管底部，确保获得单细胞悬液。用含 2% FCS 和 2% BME 的低糖 DMEM（含抗生素）（即实验培养基）重悬细胞沉淀。每 2×103 个细胞应加入 100 μl 实验培养基。使用 5 ml 移液器反复吹打细胞多次，以维持单细胞悬液状态。</li>
 <li>将 100 μl 细胞悬液加入已包被 BME 的 96 孔板每孔中。为进行背景评估（见第 2.8 节），另在 BME 包被的 96 孔板中每孔单独加入 100 μl 实验培养基。将接种后的 96 孔板置于 37°C、5% CO2 的湿润培养箱中培养。每隔 4 天需用实验培养基更换一次培养基。</li>
</ol>
增殖实验：
<ol start="8">
 <li>细胞增殖实验：在所需时间点，向各孔中加入 20 μl Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation 检测试剂盒溶液。在 37°C、含 5% CO2 的湿化培养箱中孵育 2 小时。使用酶标仪在 490 nm 波长处读取吸光度。为进行背景评估与扣除，向预先包被 BME 并仅覆盖实验培养基的孔中加入 20 μl Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation 检测试剂盒溶液，使用酶标仪在 490 nm 波长处读取吸光度。</li>
</ol>
3. 静息（休眠）肿瘤细胞和/或转移性（增殖）肿瘤细胞中细胞信号分子的免疫荧光染色
在三维系统中培养休眠/转移细胞用于免疫荧光染色
*以下方案改编自 Debnath J 等 发表的 3D 培养方案18。
<ol>
 <li>按照 2.1 节所述方法准备 BME。次日：在超净台内的托盘上放置一个 8 孔玻璃载片系统，并在托盘中加入冰。使用 200 μl 移液器将 50 μl 冰冷的 BME 加入每个孔中。确保 BME 均匀铺展，孔内无气泡产生。将包被有 BME 的 8 孔玻璃载片置于 37°C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 20 分钟。</li>
 <li>从第 1 节中收获静息或转移性细胞，并按照 2.3–2.4 节所述方法进行培养准备。将待培养的全部细胞收集至一个 15 ml 锥形管中。我们为每种细胞系及每个时间点准备 5 × 103 个细胞/孔。在室温下，以 1500g 的转速在组织培养离心机中离心 5 分钟。小心吸除上清液。注意此时沉淀通常不可见，因此需保留少量培养基。用手指轻弹 15 ml 锥形管底部，确保获得单细胞悬液。用检测培养基重悬细胞沉淀。每 5 × 103 个细胞加入 400 μl 检测培养基。使用 5 ml 移液管反复吹打细胞多次。此步骤至关重要，以确保维持单细胞悬液状态。</li>
 <li>将 400 μl 细胞混合液接种至每个已包被 BME 的 8 孔玻璃载片的孔中。将接种后的 8 孔玻璃载片系统置于 37°C、含 5% CO2 的湿润培养箱中培养。每隔 4 天需用检测培养基更换一次培养液。</li>
</ol>
免疫荧光染色：
<ol start="4">
 <li>在预定时间点，吸除上层培养基，每孔加入 200 μl 含 4% 多聚甲醛（PFA）、5% 蔗糖和 0.1% Triton X-100 的固定液，室温孵育 5 分钟。吸除固定液后，加入 200 μl 含 5% 蔗糖的 4% PFA 固定液，室温孵育 25 分钟。</li>
 <li>吸除固定液，每孔加入 400 μl 磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育 10 分钟。吸除 PBS，每孔加入 400 μl 含 0.05% Tween 20 的 PBS，室温孵育 10 分钟。</li>
 <li>用 200 μl 10% 驴血清或 3% BSA 封闭固定后的细胞，室温孵育 1 小时（封闭液的选择应根据每种一抗的经验确定）。</li>
 <li>吸除封闭液，加入 200 μl 一抗（一抗稀释度应根据每种一抗的经验确定）。若封闭时使用 10% 驴血清，则用 10% 驴血清稀释一抗；若封闭时使用 3% BSA，则用 3% BSA 稀释一抗。4°C 条件下避光孵育过夜。</li>
 <li>吸除一抗溶液，用 400 μl PBS 洗涤各孔，每次 15 分钟，共洗三次。吸除 PBS，每孔加入 200 μl 相应的驴抗 IgG-罗丹明红标记二抗（稀释度需根据经验确定），用铝箔包裹八孔载玻片，室温孵育 1 小时。</li>
 <li>用 400 μl PBS 洗涤各孔（每次 15 分钟，共三次）。吸除 PBS，加入 VECTASHIELD 封片剂（含 DAPI）封片。将载玻片置于暗处室温干燥 40 分钟。载玻片可在 4°C 避光保存 1 周。在暗处保存样本，使用共聚焦显微镜成像。</li>
</ol>
4. 典型结果：
在3D培养中对休眠的D2.0R细胞和转移性D2A1肿瘤细胞进行增殖分析的示例如图1A所示。D2.0R细胞在整个为期14天的实验培养期间保持休眠（静止）状态，而高转移性的D2A1细胞仅在培养后4至6天内保持休眠，随后开始增殖。在初始休眠阶段，许多细胞在3D培养中保持单细胞状态（图1B；第4天），而其他非增殖细胞则形成多细胞球状体。D2A1细胞在3D培养中由休眠状态向增殖状态转变（图1B；第12天）伴随着细胞形态的显著变化。因此，该检测可用于测试哪些因子可能促使休眠的D2.0R细胞从休眠状态中激活，以及哪些因子可能阻止D2A1细胞由休眠状态向增殖状态转变。图2展示了一种能够阻止D2A1细胞由休眠状态向增殖状态转变的试剂。如图2所示，使用肌球蛋白轻链激酶特异性抑制剂（ML-7）处理D2A1细胞，可使D2A1细胞维持在休眠状态。
通过针对细胞信号分子的免疫荧光染色，可研究在三维系统中培养的静止态和增殖态肿瘤细胞中的细胞信号传导。如图3所示，D2A1细胞在从静止期（第1–4天）向增殖期（第7天）转变过程中，肌球蛋白轻链的磷酸化水平显著升高（红色染色），并伴随形成肌动蛋白应力纤维的F-actin丝重新排列（绿色染色）。然而，通过shRNA或特异性药物（ML-7）抑制D2A1细胞中肌球蛋白轻链激酶的活性，可使D2A1细胞维持在静止状态，并导致肌球蛋白轻链磷酸化及F-actin应力纤维结构的形成受到抑制（图4）。
<img alt="细胞增殖随时间变化；生长曲线图，显微镜结果；培养天数分析。" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 体外 用于研究单个肿瘤细胞休眠及其向转移性生长转变的模型。A）休眠型 D2.0R 与转移型 D2A1 在三维条件下的增殖 Cultrex BME，n=8（均值 ± 标准误）。三次实验的代表性结果（* p≤0.05）。B）D2.0R 和 D2A1 细胞在三维培养条件下的光学显微镜图像 Cultrex BME 放大倍数 ×20。图示经 Barkan 等人修改 17.
<img alt="增殖曲线图，OD 490 nm，培养天数，ML-7，细胞生长抑制分析结果" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过抑制肌球蛋白轻链激酶（MLCK）阻止 D2A1 细胞在三维培养系统中从静息（G0 期）向增殖状态转换。D2A1 细胞在三维 Cultrex BME 中培养的增殖过程（n=8，均值 ± 标准误）。细胞未处理（对照组），或自培养第 5 天起用 MLCK 特异性抑制剂（ML-7；5 μM）处理 48 小时。该图改编自 Barkan 等人17。
<img alt="随时间变化的细胞培养物荧光显微镜图像，显示DAPI、MLC-p、F-actin染色及合并图像。" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. D2A1细胞从静止状态向增殖性生长转变过程中，肌球蛋白轻链磷酸化紧随F-actin重组。将D2A1细胞培养于8孔玻璃载片上的3-D Cultrex BME中。在不同时间点，固定细胞并使用DAPI（蓝色）标记细胞核定位，鬼笔环肽（绿色）标记F-actin，以及抗磷酸化肌球蛋白轻链（MLC-p）抗体（红色）进行染色。F-actin与MLC-p染色合并后呈黄色。在D2A1细胞从静止状态（第1–4天）向增殖性生长（第7天）转变过程中，MLC-p表达增加，并伴随肌动蛋白应力纤维的形成（箭头所示）。共聚焦显微镜，放大倍数×63。白色标尺=20微米。该图改编自Barkan等17。
<img alt="免疫荧光显微镜图像，MLC-p 和 F-actin 染色的细胞，对照组与 ML-7 及 Sh-MLCK 样品对比。" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 抑制肌球蛋白轻链激酶（MLCK）介导的 D2A1 细胞中 F-actin 应力纤维的形成。 D2A1 细胞未作处理（对照组），或在培养第 5 天开始使用 MLCK 抑制剂（ML-7；5 μM）处理 48 小时，或经乱序对照或 MLCK shRNA 处理，随后对磷酸化肌球蛋白轻链（MLC-p，红色）、F-actin（绿色）和细胞核（蓝色）进行染色。F-actin 与 MLC-p 染色的合并图像显示黄色荧光。共聚焦显微镜，放大倍数 x63。白色标尺为 20 微米。

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<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Morris, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li>
<li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

维持播散性肿瘤细胞处于休眠状态或促使其转变为转移性生长的潜在机制在很大程度上仍不清楚。这一现象在人类患者中极难研究4,12，且目前仅有少数临床前模型被开发用于解决这一问题。尽管如此，一些用于研究肿瘤休眠的体内和离体模型系统已被建立（详见文献1,12综述）。然而，现有的肿瘤休眠体内模型主要用于验证调控肿瘤休眠的潜在机制，却难以实现实时观察单个播散性休眠肿瘤细胞的生物学行为。
本文首次报道的三维系统模型可模拟单个肿瘤细胞的休眠状态及其向转移性生长的转变过程 体外 模型系统。可在3D系统中随时间追踪模拟肿瘤休眠（静息）及其向增殖转化的增殖检测。该检测可用于在相对短的时间内以高通量方式研究潜在维持肿瘤细胞处于静息状态或促使其活化增殖的因素/基因。此外，增殖检测还可作为高通量平台，用于筛选可能具有休眠表型的其他肿瘤细胞系。 
由于从休眠肿瘤细胞中提取的RNA/蛋白质含量较低，因此通过传统的生化方法（如RT-PCR/蛋白质印...

<table><tbody><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 低糖培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型 3-D Cultrex 基底膜提取物</td><td>Trevigen Inc.</td><td></td><td>蛋白浓度为 14–15 mg/ml</td></tr><tr><td>D2.0R 和 D2A1 细胞系</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;5,19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>K7M2 和 K7M2AS1.46 细胞</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MCF-7 和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 孔玻璃载片系统</td><td>Lab-Tek</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>Cell Titer 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒</td><td>Promega Corp.</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Bio-Tec</td><td></td><td>记录 490 nm 吸光度</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>放大倍数 ×63</td></tr></tbody></table>

一个 体外 研究肿瘤休眠及其向转移性生长转换的系统

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

乳腺癌的复发通常发生在一段漫长的潜伏期之后，此期间无任何癌症迹象，且转移灶可能在原发肿瘤切除及辅助治疗多年后才出现临床表现。这一现象的可能解释是，肿瘤细胞已播散至转移部位，对常规治疗具有耐药性，并在长时间内保持休眠状态1-4。
继发部位存在休眠的癌细胞，此前已被描述为静息的单个细胞，既不增殖也不发生凋亡5-7。此外，这些单个细胞已被证明在疾病进展的早期阶段即从原发肿瘤播散8-10，并在患者的骨髓、血液和淋巴结中处于生长停滞状态1,4,11。因此，理解调控休眠状态或向增殖状态转换的机制，对于发现预防疾病复发的新靶点和干预策略至关重要。然而，由于缺乏可用的模型系统，揭示从肿瘤休眠向转移性生长转换的调控机制一直受到阻碍。
已有文献报道过用于研究肿瘤细胞转移进展的体内和离体模型系统1,12-14。然而，这些模型系统尚无法实时、高通量地揭示导致孤立的静止性肿瘤细胞转变为增殖性转移性疾病的具体分子机制。我们近期开发了一种三维体外模型系统，用于模拟在体内表现为静止（D2.OR、MCF7、K7M2-AS.46）或增殖性（D2A1、MDA-MB-231、K7M2）转移特性的细胞的体内生长特征。我们证明，在转移部位体内表现为静止的肿瘤细胞，在三维基底膜提取物（BME）培养环境中仍保持静止状态；而体内高度转移性的细胞则在经历一段可变但相对较短的静止期后，迅速在三维培养中增殖。尤为重要的是，通过利用该三维体外模型系统，我们首次证实细胞外基质（ECM）的组成在调控静止性肿瘤细胞是否向增殖状态转变中发挥重要作用，并在体内研究中验证了这一发现15-17。因此，本报告所述的模型系统提供了一种体外方法，可用于模拟肿瘤细胞静止状态，并研究微环境诱导其向增殖性生长转变的过程。

一种改良的三维体外系统被用于研究多种肿瘤细胞系在重建基底膜中的生长特性，这些特性与肿瘤细胞在转移性继发部位所表现出的休眠或增殖行为相关 体内.

乳腺癌的复发通常发生在一段漫长的潜伏期之后，此期间无任何癌症迹象，且转移灶可能尚未出现临床可察觉的表现……

以下实验的总体目标是利用以下体外检测方法对肿瘤休眠状态或向转移性生长的转变进行建模，从而以实时、高通量的方式观察潜在药物对肿瘤细胞休眠状态或从休眠状态复苏的影响。该目标首先通过在适配于96孔板平台的三维培养基底膜提取物（BME）系统中培养休眠或转移性肿瘤细胞来实现。当在三维系统中培养时，转移性细胞会进入一个短暂的、休眠或静止的阶段。相比之下，体内处于休眠状态的肿瘤细胞会进入长期的静止状态。在三维培养系统中，可对转移性细胞施加候选药物，以阻止其从静止状态转变为增殖状态；而处于休眠状态的肿瘤细胞则可接受候选药物处理，以诱导其从静止状态向增殖状态转变。在预定时间点加入Cell Titer 96 Aqueous One Solution细胞增殖检测试剂盒，通过ELIZA酶标仪分析处理后静息状态及转移性细胞的增殖行为。根据3D系统中的细胞增殖实验，获得处理对静息或转移性肿瘤细胞增殖影响的结果。该方法有助于回答转移研究领域中的关键问题，例如哪些因素和细胞机制维持播散性肿瘤细胞处于静息状态，以及哪些因素和细胞机制诱导肿瘤静息向临床转移的转变。在进行增殖实验的前一天，将含Qualtrics生长因子的BME于4°C冰箱中过夜孵育。然后在实验当天，选择休眠状态或转移性肿瘤细胞培养物用于实验。接着，将96孔板放置于生物安全柜或通风橱内的冰盘上。然后使用带有注射器的分配器，向每孔加入50 µL解冻后的冰上预冷的BME，使96孔板各孔包被BME。注意避免孔中产生气泡。将包被了BME的96孔板置于含5% CO₂、37 °C的湿润化培养箱中孵育30分钟。在BME包被板孵育的同时，将一瓶胰蛋白酶置于37 °C环境中预热。吸去肿瘤细胞中的培养基。用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养板。然后吸去PBS，并向培养板中加入2毫升预热的胰蛋白酶。将培养板孵育五分钟。在15毫升锥形管中加入5毫升DMEM高糖培养基，添加10% FCS和抗生素。在此期间。孵育结束后，将脱离的细胞转移至15毫升离心管中并计数。然后在室温下，以1500 ×g 的速度在组织培养离心机中离心5分钟，沉淀待培养的总细胞数。小心吸除上清液。留下部分培养基，因为在大多数情况下沉淀不可见。然后轻弹管底，确保获得单细胞悬液。接着，每2×10³个细胞用100 µL检测培养基重悬沉淀。用5毫升移液管反复吹打细胞悬液多次，以确保维持单细胞悬液状态。将每孔100微升细胞悬液接种至96孔BME包被板中用于对照背景去评估板，另向96孔BME包被板中仅少数孔每孔加入100微升培养基。随后将培养板放入培养箱中孵育，并每隔四天吸除旧培养基，更换新鲜的检测培养基。为评估细胞增殖，于预期的实验时间点，向每块待分析的96孔板的每个孔中加入20 µL细胞增殖检测试剂盒中的Cell Titer 96 Aqueous One Solution。将培养板孵育2小时。然后使用ELISA酶标仪记录实验孔和背景孔在490 nm处的吸光度，为免疫荧光分析做准备。在染色前一天，将基底膜提取物（BME）置于4°C冰箱中过夜解冻。染色当天，将八孔玻璃载片系统放置于生物安全柜或通风橱内的冰盘上。随后，使用200微升移液器将50微升预冷的BME均匀涂布于玻璃载片系统的每个孔中。确保BME均匀分布，且孔中无气泡产生。将包被好的载玻片孵育20分钟。选择一种处于静息状态或转移性肿瘤细胞系。使用胰蛋白酶消化收获细胞，操作步骤如前所述。然后将待培养的全部细胞收集至一个15毫升的锥形离心管中。接着离心沉淀细胞，小心吸除上清液，注意留少量培养基。轻弹15毫升锥形管底部，使沉淀重悬，获得单细胞悬液。每5 × 10³个细胞用400微升检测培养基重悬沉淀。使用5毫升移液器反复吹打细胞多次，确保维持单细胞悬液状态，然后将每孔400微升细胞悬液接种至8个BME包被的培养室中。随后孵育玻片系统，在预定的实验时间点每四天吸除旧的培养基，并更换为新的检测培养基。吸去培养基的上层液体，加入200 µL含有Triton的固定液，室温孵育5分钟。然后吸去含Triton的固定液，仅加入200 µL固定液，室温再孵育25分钟。再次吸去固定液，然后每孔加入 400 µL PBS。在室温下继续孵育 10 分钟。随后吸去 PBS，每孔加入含 0.05%（介于 20 与之间）的 PBS 400 µL，并再孵育 10 分钟。同样在室温下进行。现在用200微升封闭液对固定后的细胞进行封闭。然后在室温下孵育细胞1小时。孵育结束后，吸去封闭液，并向每孔加入200微升用封闭液稀释的一抗。将载玻片在4°C条件下与一抗孵育过夜，次日进行后续操作。吸除一抗溶液，随后用400 µL PBS洗涤3次，每次15分钟，每次洗涤后均需吸除溶液。最后一次洗涤吸除PBS后，每孔加入200 µL与罗丹明红偶联的二抗。然后用铝箔覆盖八孔载玻片系统，并在室温下孵育一小时。接着，用 PBS 洗涤各孔三次，方法同前；第三次洗涤后，将载玻片置于防荧光淬灭封片剂中封片。最后将载玻片置于避光条件下室温干燥40分钟。此处展示的是在三维培养中对静息态D 2.0 R细胞和转移性D two A one肿瘤细胞进行增殖分析的一个示例。D 2.0 R细胞在整个为期14天的实验培养期间均保持静息状态，而高转移性的D two A one细胞仅在培养的最初4至6天内保持静息，随后即在初始静息阶段之后开始增殖。许多细胞在三维培养中保持单细胞状态，如本图所示的第4天培养的代表性照片所示，而其他非增殖性细胞则形成多细胞类固醇结构。D2A1细胞在三维培养中从静息状态向增殖状态的转变如本图所示的第12天培养照片所示，该过程伴随着细胞形态的显著变化。一个防止 D2A1 细胞从静息状态转变为增殖状态的示例，如使用特异性肌球蛋白轻链激酶抑制剂处理 D2A1 细胞所示。如本图所示，将 D2A1 细胞维持在静息状态。在 D2A1 细胞从静息期第 1 天到第 4 天向增殖期过渡过程中，肌球蛋白轻链的磷酸化水平显著升高（以红色显示），随后发生 F-肌动蛋白丝的重组，形成绿色的肌动蛋白应力纤维。第七天。然而，通过SHRA或药物ML-7抑制D2A1细胞中肌球蛋白轻链激酶的活性，可使D2A1细胞保持在静息状态，并抑制肌球蛋白轻链的磷酸化、F-肌动蛋白（F actin）以及应力纤维的形成，如图所示。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立体外模型系统，以研究肿瘤的静息状态及其向转移性生长的转变过程。

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