Name: 真菌内切葡聚糖酶的活性高通量筛选大肠埃希氏菌 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 了解真菌内切葡聚糖酶在大肠埃希氏菌中的高通量活性筛选方法。该技术利用刚果红染色可视化底物降解，无需纯化酶即可快速筛选大型酶变体库，为微生物酶学研究提供高效可靠的评估手段。

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本工作由戈登与贝蒂·摩尔基金会以及联合黑人学院基金会/默克科学计划资助。

1. 筛选平板的制备
<ol>
	<li>在1L蒸馏水中加入25g LB培养基、15g琼脂和1.5g羧甲基纤维素（CMC）底物，高压灭菌以进行消毒。</li>
	<li>灭菌后，让培养基冷却，并加入适当的抗生素和IPTG，使其终浓度为100μM。</li>
	<li>将200mL培养基分别倒入5个大型方形培养皿/生物测定托盘（240 × 240 × 20 mm 或更大尺寸）中。让平板完全干燥。</li>
</ol>

2. 内切葡聚糖酶文库的构建与筛选
<ol>
	<li> 构建内切葡聚糖酶催化结构域的文库。可通过多种方式实现（例如定点突变、随机突变、重组等），具体方法由研究人员决定。</li>
	<li>将文库克隆至载体中，使其受T7启动子和lac操纵子调控，并包含pelB信号肽序列以靶向周质空间。合适的载体示例为Novagen公司的pET22b(+)。</li>
	<li>将内切葡聚糖酶文库转化至大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3) 菌株，并涂布获得单菌落。</li>
	<li>于37°C培养过夜。</li>
	<li>使用无菌牙签将克隆接种至含有400μL LB培养基（添加适当抗生素）的96孔深孔板中，于37°C、250 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>向96孔过夜培养物中加入无菌甘油，终浓度为10%，用于-80°C长期保存。此板作为主库板。</li>
	<li>使用96针复制仪将过夜培养物复制至含有IPTG和CMC的筛选平板上。每块筛选板最多可复制5组过夜培养物。</li>
	<li>标记筛选板，确保每个96孔板的身份和方向清晰可辨。</li>
	<li>将复制后的文库在室温（17–25°C）孵育过夜，或直至可见菌落形成。</li>
	<li>用蒸馏水冲洗平板，直至所有菌落痕迹完全去除。</li>
	<li>将刚果红（CR；0.5%水溶液）倒入清洗后的平板，确保加入量足以覆盖整个平板表面。</li>
	<li>室温孵育15分钟。刚果红染色时间不得超过15分钟，否则会导致水解圈不清晰。</li>
	<li>倒去刚果红溶液，加入足量1M NaCl溶液（用量应超过覆盖平板所需）。</li>
	<li>室温孵育15分钟。</li>
	<li>倒去NaCl溶液，即可观察到CMC降解产生的透明圈。为获得更清晰的透明圈，可能需要延长NaCl孵育时间或进行多次NaCl漂洗。</li>
	<li>使用无菌牙签从主库板中挑取具有活性的酶克隆，用于进一步表征。</li>
</ol>

3. 代表性结果：
图3展示了该高通量筛选的一个读出结果示例。根据降解区的大小，克隆可被鉴定为无活性、弱活性和高活性。如果在文库中包含已知活性的酶作为参照，则此方法尤为有用。如图所示，活性酶的鉴定结果可靠且可重复。然而，请注意，对筛选平板进行充分标记至关重要。研究人员必须能够在洗去菌落后仍能识别出具有活性的变异体，以便从保存于-80°C的主平板上挑取这些克隆，用于进一步表征。最后，难以预先评估酶在人工底物与天然底物上活性之间的关系。因此，研究人员必须在工业相关材料上测试所有阳性克隆，以确定蛋白质的功能适应性。
<img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig1.jpg" alt="在CMC琼脂IPTG平板上的菌落形成；细菌生长及CMC降解圈示意图。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 图1. 筛选流程示意图。将细胞转化至内切葡聚糖酶文库中，并进行选择性涂布以获得单菌落。挑取克隆并在96孔深孔板中过夜培养，用于（1）在-80°C下保存，以及（2）在含有CMC和IPTG的平板上进行复制平板培养，以诱导内切葡聚糖酶表达。从保存于-80°C的主平板上挑取有活性的克隆。
<img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig2.jpg" alt="基因编辑过程；含lac操纵子、启动子的质粒图谱；刚果红染色后羧甲基纤维素降解圈实验结果。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图2"> 图2. 真菌催化结构域在E. coli中的克隆与表达。(A) 内切葡聚糖酶表达载体。将基因克隆至pET22b(+)（Novagen）中，由T7启动子调控。(B) 右图：表达内切葡聚糖酶的BL21 (DE3) 菌落。左图：经刚果红染色并洗脱后出现的羧甲基纤维素（CMC）降解圈。
<img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig3.jpg" alt="蛋白质活性比较，电泳结果；标记为高活性和低活性。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图3"> 图3. CMC/刚果红筛选的示例结果。洗涤并经刚果红显色后拍摄的筛选平板照片。筛选平板上所有菌落大小相似。

<ol><li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li>
<li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+and+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li>
<li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+endoglucanase+III+%28Cel12A%29+from+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li>
<li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li>
<li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+%28Thermotoga+maritima%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I%2C+II%2C+and+III%2C+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li>
<li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+%28EGL+1%29+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li>
<li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+%28CBHI.1%29+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li>
<li>Howard, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Env+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方案能够快速、高通量地鉴定具有活性的酶，且操作步骤极少。活性检测具有较高的灵敏度，并能定性反映细胞内酶活性的水平。该方法操作简便，适用于多种酶文库的筛选，其应用范围仅受限于目标酶在大肠杆菌（E. coli）中的功能性表达。此外，此类活性筛选不仅限于真菌来源的纤维素酶，还可推广应用于任何具有可溶性底物（如羧甲基纤维素，CMC）的内切葡聚糖酶或其他纤维素酶活性的检测。

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1284</td><td></td></tr><tr><td>刚果红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360384</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1679</td><td></td></tr><tr><td>细菌琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>生物测定板</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>240845</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量筛选真菌内切葡聚糖酶活性 大肠杆菌

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

纤维素酶（内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶）可将纤维素水解为组分糖类，这些糖类继而可转化为燃料醇1。利用纤维素生物质进行酶水解以提供可再生能源的潜力，已促使人们加大努力，通过蛋白质工程改造纤维素酶以实现经济高效的燃料生产2。其中特别受到关注的是真菌纤维素酶3-8，这类酶目前已在食品和纺织品加工等工业领域中得到应用。
在纤维素酶突变体文库中鉴定出具有活性的变异体对酶的改造过程至关重要；具有活性的突变体可进一步用于检测其改良特性，或进行额外的诱变处理。真菌纤维素酶的高效改造一直受到缺乏针对天然宿主的遗传工具以及在异源宿主中表达酶的困难所限制。最近，Morikawa 及其同事开发了一种在大肠杆菌（E. coli）中表达来自斜卧青霉（H. jecorina）内切葡聚糖酶催化结构域的方法3,9，斜卧青霉是一种重要的工业真菌，能够大量分泌纤维素酶。此外，已有研究报道在大肠杆菌中成功实现了其他真菌来源纤维素酶的功能性表达，包括来自菜豆根腐菌（Macrophomina phaseolina）10和黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）11-12的纤维素酶。
我们介绍一种在E. coli中高通量筛选真菌内切葡聚糖酶活性的方法。（图1）该方法利用常见的微生物染料刚果红（CR）来可视化细胞在固体培养基上降解羧甲基纤维素（CMC）的酶解过程。该活性检测方法所需试剂廉价，操作简便，结果明确，表现为菌落周围出现降解区域（“晕圈”）。尽管该方法无法定量测定酶活性，但我们发现晕圈大小与细胞内的总酶活性呈正相关。对各个阳性克隆的进一步表征将确定其相对蛋白适应性。
传统的细菌全细胞CMC/刚果红（CR）活性检测方法13通常涉及将含有羧甲基纤维素（CMC）的琼脂倾注于菌落上，这种方法容易发生交叉污染；或者将培养物孵育在含有CMC的琼脂孔中，但后者较难适用于大规模实验。本文报道了一种改进的纤维素酶活性检测方案，该方案对现有的洗涤方法14进行了优化：在进行刚果红染色之前，先将生长在CMC琼脂平板上的菌体去除。本方案显著减少了交叉污染，并具有高度可扩展性，能够快速筛选数千个克隆。除了H. jecorina的酶外，我们还表达并筛选了来自Thermoascus aurantiacus和Penicillium decumbens的内切葡聚糖酶变体（见图2），表明该方案适用于来自多种生物体的酶。

我们介绍一种低成本、高通量的方法，用于在大肠杆菌（E. coli.）中筛选真菌内切葡聚糖酶活性。该方法依赖于底物降解的简单视觉读数，无需酶纯化步骤，且具有高度可扩展性，因而能够快速筛选大量酶变异体文库。

纤维素酶（内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶）可将纤维素水解为组分糖，这些糖随后可被转化……

在此项针对大肠杆菌中真菌内切葡聚糖酶活性的高通量筛选中，采用常见的微生物染料刚果红，通过在固体培养基上生长的细胞对羧甲基纤维素的酶解作用进行可视化检测。首先，将细胞转化入含有内切葡聚糖酶基因文库的质粒，并进行选择性涂板以获得单菌落。随后挑取单个克隆，在96孔板中过夜培养。接着，通过影印接种法将菌株转移至含有IPTG的CMC平板，诱导内切葡聚糖酶表达，从而进行酶活性筛选。最后，从保存在负80摄氏度的主培养板上挑取克隆。该检测可产生明确的结果，表现为菌落位置出现降解圈，其中晕圈大小与酶活性相关，从而可对蛋白质相对适应性进行定性评估。与现有的覆盖法等方法相比，该技术的主要优势在于能够实现高通量分析，且假阳性率极低。向一升蒸馏水中加入25克LB培养基、15克琼脂和1.5克羧甲基纤维素底物，经高压灭菌进行消毒。待培养基冷却后，加入适量抗生素和IPTG，使其终浓度为100微摩尔。然后将200毫升培养基分别倒入五个大型方形培养皿或生物测定托盘中，静置使平板完全干燥。首先，将内切葡糖酸酶催化结构域文库构建到合适的载体中，例如 Novagen 公司的 pET-22b(+) 载体，该载体包含 T7 启动子、lac 操纵元件以及 PAL-LV 信号序列，用于靶向定位至周质空间。使用玻璃珠法将内切葡糖酸酶文库转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 菌株，涂布平板以获得单菌落，并在 37°C 下过夜培养。随后用无菌牙签挑取克隆，接种至 96 孔板中。在含有400微升LB培养基并添加适当抗生素的深孔板中进行培养。于37摄氏度、250 RPM振荡条件下过夜培养。随后向96孔深孔板中的过夜培养物中加入无菌甘油，用于在负80摄氏度条件下长期保存。使用96针复制仪，将过夜培养物复制到含有IPTG和CMC的筛选平板上，此平板将作为主平板。 Stamp五组过夜培养物，标记后于室温孵育，直至可见菌落形成。继续用蒸馏水冲洗平板，直至所有菌落痕迹完全去除。加入适量的0.5%刚果红溶液，以覆盖已洗涤的平板为宜，在室温下孵育最多15分钟。倾去染液，加入足量的一摩尔氯化钠溶液，在室温下孵育15分钟。然后弃去氯化钠溶液，即可显现出CMC降解圈。使用无菌牙签从主平板中挑选具有活性的酶，用于进一步表征。在此示例中，内切葡糖酸酶表达载体构建于 PET 22 B plus 载体中，由 T7 启动子调控，并含有 lac 操纵子。随后对表达内切葡糖酸酶的 BL 21 菌落进行筛选，以检测其在羧甲基纤维素（CMC）上产生降解圈的能力。经刚果红染色、洗涤和显色后，通常可根据降解区域的大小将筛选平板上的克隆鉴定为无活性、弱活性和高活性。在此，活性酶的鉴定具有高度的稳健性和可重复性。务必正确标记筛选板，以便在主板上准确鉴定出阳性克隆。

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